Summary
Intratrakeal (IT) administrering av eksperimentelle midler hos mus resulterer ofte i asymmetrisk levering til de opp-lungene. I denne rapporten beskriver vi en direkte intrabronchial (IB) for å kannelerer hver lunge i levende mus ikke-operativt. Denne tilnærmingen kan brukes til å selektivt administrere agenter til en lunge eller kan tilpasses for å forbedre symmetrisk agent levering til begge lungene.
Abstract
Intratrakeal (IT) administrasjon av eksperimentelle agenter er en essensiell teknikk i murine modeller av diffuse lungesykdommer, slik som bleomycin-indusert lunge fibrose. Imidlertid er fordelingen av intratracheally til den ikke-administrerte mus lungen ofte asymmetrisk, med lunge parenkymatøs konsentrasjoner økt i de mindre (men like tilgjengelige) venstre lunge av musen. Beskrevet i denne rapporten er en roman intrabronchial (IB) tilnærming til kannelerer venstre og/eller høyre lungene av levende mus ikke-operativt. Det er også demonstrert hvordan denne tilnærmingen kan brukes til å selektivt administrere agenter til en lunge eller tilpasset (via dose-justert IB levering) for å forbedre venstre-høyre symmetri lunge levering av eksperimentelle agenter, og dermed bedre modeller av diffuse lungesykdom som bleomycin-indusert lunge fibrose.
Introduction
Direkte lunge administrasjon av eksperimentelle agenter i mus gjør det mulig for studiet av lunge immunresponser, akutt lungeskade, og lunge fibrose. Direkte lunge administrasjon utføres vanligvis via INTRATRAKEAL (IT) drypping, som beskrevet tidligere1,2,3. Imidlertid er denne tilnærmingen selektivt, påvirker både lungene i en nontargeted og ofte asymmetrisk måte. Eksperimentell modellering av lungeskade kan ha nytte av evnen til å selektivt målrette en bestemt lunge, noe som åpner for bruk av kontralateral lunge som en kontroll. Omvendt, nøyaktig modellering av menneskelige diffuse lungesykdommer fordeler fra symmetrisk distribusjon av eksperimentelle agenter til den bilaterale lunge parenchyma.
Det overordnede målet med denne rapporten er å beskrive en metode for selektiv levering av eksperimentelle agenter til venstre eller høyre lunge av en mus (figur 1). Denne intrabronchial (IB) administrasjonen gir mulighet for ensidig behandling av en mus lunge og kan lett tilpasses for å sikre lik levering av en agent til den bilaterale høyre bronkiene. Ved å bruke IB administrasjon for å levere større doser av eksperimentelle agenter til større høyre lunge og mindre volumer til mindre venstre lunge (dvs. dose justert IB administrasjon), demonstrert i denne rapporten er en forbedring i homogenitet av lunge levering av eksperimentelle agenter, optimalisere modellen av diffus lungeskade hos mus. Som sådan kan denne rapporten holde verdi for undersøkere som søker å enten ensidig administrere eksperimentelle agenter til mus eller forbedre symmetri narkotika deponering i begge lungene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller ha blitt anerkjent av universitetet av Colorado Denver institusjonelle dyr bekymre og bruk komité (IACUC). Alle prosedyrene som er beskrevet nedenfor (pkt. 4 – 7) er optimalisert med både mannlige og kvinnelige C57BL/6-mus. Denne tilnærmingen er validert ved hjelp av mus som spenner fra 19 – 40 g i kroppsvekt.
1. opprettelse av plattform for IB administrasjon
- Bøy bookend fra den opprinnelige 90 ° vinkelen mellom basal fløyen og stående vinge til 70 ° (figur 2a).
- Bor et hull i midten-toppen av den stående fløyen av metall bookend (figur 2a).
- Bor et hull av samme størrelse i tilsvarende posisjon av plast bord. Bor to mindre hull forsiktig og sideveis (figur 2a).
- En 4:0 silke Sutur mellom disse små hullene i plast brettet (fig.2a).
- Legg kroken og sløyfe tapen på kanten av plast brettet (figur 2a).
- Monter plast styret til metall bookend med skruen (figur 2b). Sørg for at skruen-mutteren er tilstrekkelig stramt til å holde brettet i posisjon samtidig som det gir mulighet for justering av vinkelen, om nødvendig.
- Sørg for at rotasjon av plast styret er med klokken og mot klokken, beveger seg fritt.
Merk: bevegelse med klokken er representert i denne rapporten som en (+) grad rotasjon, og mot klokken representeres som en (-) graders rotasjon. - Bruk en vinkel transportør for å posisjonere plast styret ved + 30 °, + 86 °,-30 °, og-74 ° og merke dem på bookend, henholdsvis.
2. opprettelse av utvidet katetre for IB agent administrasjon
- Lag en rett vinkel som er skåret med et skarpt blad på spissen av et originalt 22 G-kateter (25 mm, se tabell over materialer) (Figur 3, trinn 1a).
- Skråkanten (~ 50 ° – 60 °) spissen av det andre originale kateteret (25 mm) med bladet, og deretter avskåret i rett vinkel fra navet (Figur 3, trinn 1b).
- Lim de to katetre på deres Butte ender med en litt mindre enn 180 ° vinkel (Figur 3, trinn 2).
- Stump skrå spissen ved smelting med en cauterization med lav temperatur (se tabell over materialer).
- Polsk den utvidede kateteret med "0" størrelse sandpapir på limt området og skrå spissen av den utvidede kateteret (Figur 3, trinn 3).
- Merk på det forlengede kateteret med forskjellige farger på 25 mm, 30 mm og 35 mm (Figur 3, trinn 3).
- Angi skråkant på det utvidede kateteret ved å merke navet med merket.
- Skyll det forlengede kateteret med DI vann, etter ved å skylle innsiden av kateteret med 70% etanol. Airdry kateteret.
- Steriliseres med UV-lys i 10 minutter før bruk.
3. forberedelse til pre-prosedyre
- Gjør alle administrerte agenter i en biologisk sikkerhets hette under steril teknikk.
- Rengjør arbeidsplassen med 70% etanol.
- Sterilisere alle kirurgiske verktøy med 70% etanol.
- Fest bunnen av Arbeidsplattformen til benken rett foran forskeren ved påføring C-klemmer til basal fløyen av bookend.
- Generer flere provisoriske kaliberes, som er enheter som vil muliggjøre påvisning av tidevanns luftstrøm i mus. Kort, depositum 60 μL av sterilisert saltvann i en 1 mL sprøyte (stempel fjernet) med en gel lasting spissen.
Merk: avsatt dråpe saltvann dualcare fatet og beveger seg oppover og nedover når de utsettes for tidevanns ventilasjon3. - Fest navet av en 22 G forlenget kateter til provisorisk spirometeret.
- Plasser hver av glass droppers på hver side av plattformen for enkel tilgang.
- Koble isoflurane induksjon kammer til gnager anestesi maskinen (se tabell over materialer) i et isoflurane, biologisk sikkerhetskabinett.
4. ikke-operative IT-intubering tilnærming
- Bedøve en C57BL/6-mus (hann eller hunn, 8 – 10 uker, ~ 25 g) med oksygen (2 L/min) og 5% isoflurane (se tabell over materialer) i en induksjon kammer i 4 min.
- Aspirer den eksperimentelle agenten som skal leveres (for eksempel Evans blå fargestoff eller FITC-dextran, som demonstrert i Figur 4) i to Pipetter, og plasser dem på hver side av plattformen under sedasjon.
- Sørg for en åndedretts rate på ca 24-30 åndedrag/min før du fjerner musen fra anestesi induksjon kammeret.
Merk: isoflurane anestesi varer vanligvis i 4 minutter, tilstrekkelig for alle IB prosedyrer. Hvis operatøren ikke er dyktig med teknikken, ketamin/xylazine (80 mg/kg og 10 mg/kg intraperitonealt, se tabell over materialer) kan brukes for mer langvarig anestesi. - Suspendere musen ved sin fortenner på drapert Sutur linjen i liggende posisjon. Fest musen med to til tre stykker av kroken og loop tapen løst, unngå begrensning av ventilasjon.
- Slå på LED-Fiberoptisk belysning (se tabell over materialer, figur 2C).
- Plasser operatøren bak plattformen (rygg mot mus).
- Juster gooseneck til lyset slik at det lyser opp strupen på området gjennom huden. Avstanden mellom musen og lyskilden er 2 – 3 cm (figur 2C).
- Bekreft dybden av anestesi med en tå/pote klype før du utfører alle prosedyrene nedenfor.
- Hold den sterile tang med den dominerende hånden, og deretter trekke tungen ut av munnhulen med tang.
- Hold den sterile depressor med nondominant hånd, deretter flat roten av tungen med depressor å eksponere oropharynx mye. Pinsett kan deretter frigjøres og frigjør den dominerende hånden.
- Bruk den dominerende hånden til å intubere det forlengede kateteret inn i luftrøret via munnhulen (figur 2C).
- Bekreft plasseringen ved å observere om boblen i sprøyten beveger seg opp og ned med hvert åndedrag.
- Flere detaljer om IT-intubering har blitt publisert tidligere3. Total prosedyre tid, unntatt anestesi, varer 10-15 s for en godt trent operatør.
5. ikke-operative IB intubering og leverings tilnærminger
- IB tilnærming til selektiv Lobar kanyleringen av den høyre lunge
- Når du har utført IT-kanyleringen (trinn 4,11), roterer du plast kortet + 30 ° (figur 4a).
- Hold navet på kateteret og veilede det naturlig parallelt med musen midtlinjen, utvide den til vekt-baserte dybder som beskrevet i tabell 1.
Merk: motstanden på disse dybder bør bemerkes. På dette punktet, vil musen bli litt tachypneic, som forklart i representative resultater. For en erfaren operatør, vil ca 90% av forsøkene lykkes kannelerer høyre lunge (med tachypné bemerket). - Lever 20 μL av 0,3% Evans blått fargestoff (EBD, se tabell av materialer) med en gel lasting spissen.
- Dispensere 1-2 alikvoter (0,1 mL hver) av luft ved hjelp av glass dropper.
Merk: Dette sikrer klarering av gjenværende EBD-løsning (eller eksperimentelle midler) fra innsiden av kateteret. - Trekke tilbake kateteret, og deretter opprettholde musen posisjon for 30 s.
- Plasser dyret på en varmende teppe før det gjenvinner bevisstheten. Gjenoppretting er vanligvis ferdig innen 2 min.
- IB tilnærming til selektiv segmental kanyleringen av den venstre lunge
- Når du har utført IT-kanyleringen (trinn 4,11), roterer du plast kortet-74 ° (figur 4b).
- Hold navet på kateteret og påfør forsiktig Trykk for å fremme kateteret inn i venstre høyre bronkie, mens du plasserer beskjeden trykk både nedover (90 °) og mot bookend. På dybder notert i tabell 1, bør operatøren merke motstand som de nedre segmenter av venstre lunge er engasjert. Hvis tachypné oppstår, trekker du kateteret tilbake til posisjonen 20 – 25 mm og reattempt.
- Etter å ha cannulating venstre nedre lunge segmenter, er det nødvendig med en endring i posisjon for å muliggjøre tyngdekraft hjelp for agent administrasjon. Roter plast kortet-30 ° (figur 4b).
- Lever 40 μL av 0,3% EBD med et tips for gel lasting.
Merk: det er mulig å levere et større volum av agent fordi venstre lunge har bare én flik. - Dosering 1 – 2 alikvoter (0,1 – 0,3 mL hver) av luft ved hjelp av glass droppers.
Merk: Dette sikrer klarering av eventuelle gjenværende EBD (eller eksperimentelle midler) fra innsiden av kateteret. - Trekke tilbake kateteret, og deretter opprettholde musen posisjon for 30 s.
- Plasser dyret på en varmende teppe før det gjenvinner bevisstheten. Gjenoppretting er vanligvis ferdig innen 2 min.
- Tilpasning av IB administrasjon for å tillate levering av agent til helheten av venstre eller høyre lunge
Merk: Hvis operatøren søker å levere agenter ikke til en bestemt høyre lunge flik eller venstre lunge segment, men heller til hele lungene (høyre eller venstre lunge), bør kateteret være litt tilbake til de respektive høyre bronkiene, som følger.-
Høyre hele lunge administrasjon
- Roter plast kortet + 30 ° (figur 5a) etter trinn 4,11.
- Hold navet på kateteret og veilede det naturlig parallelt med musen midtlinjen, og nådde den til dybder nødvendig for høyre ensidig Lobar kanyleringen (tabell 1).
- Bekreft utseendet til tachypné fortegn.
- Roter musen-74 ° for å muliggjøre tyngdekraften hjelp for agent levering (figur 5B).
- Trekk kateteret tilbake til en posisjon som tilsvarer takeoff til høyre høyre bronkie (tabell 1). Påse at skråkant på kateteret vender nedover (figur 5B).
- Lever 30 μL av 0,3% EBD med en gel lasting spissen til høyre lunge.
- Dosering 1 – 2 alikvoter (0,1 – 0,3 mL hver) av luft ved hjelp av et glass dropper.
- Trekke tilbake kateteret, og deretter opprettholde musen posisjon for 30 s. Plasser dyret på en varmende teppe før det gjenvinner bevisstheten. Gjenoppretting er vanligvis ferdig innen 2 min.
-
Venstre hele lunge administrasjonen
- Roter plast brettet-74 ° (figur 6a) etter trinn 4,11. Alternativt kan rotasjon oppstå etter trinn 5.3.1.8 ved å trekke kateteret tilbake til luftrøret, slik at bilateral IB agent administrasjon.
- Hold navet på kateteret og påfør forsiktig Trykk for å fremme kateteret inn i venstre høyre kateter, mens du plasserer beskjeden trykk både nedover (90 °) og mot bookend. Intubering dybde styres av tabell 1.
- Bekreft ikke noe tachypné-tegn.
- Roter musen + 86 ° for å muliggjøre tyngdekraften hjelp med agent administrasjon.
- Trekk kateteret til venstre høyre bronkie (samme avstander som den høyre lungen er tilstrekkelig, tabell 1) og roter skråkant av kateteret vender nedover (figur 6b).
- Lever 30 μL av 0,3% EBD med et gel lasting spissen til venstre lunge.
- Dosering 1 – 2 alikvoter (0,1 – 0,3 mL hver) av luft ved hjelp av et glass dropper.
- Trekke tilbake kateteret, og deretter opprettholde musen posisjon for 30 s. Plasser dyret på en varmende teppe før det gjenvinner bevisstheten. Gjenoppretting er vanligvis ferdig innen 2 min.
-
Høyre hele lunge administrasjon
6. Bruk av sekvensielle IB kanyleringen tilnærminger for å levere dose justerte volum av agent til hver lunge
-
Gruppe for IT-administrasjon
- Utfør IT-kanyleringen som beskrevet i trinn 4.1 – 4.11.
- Lever 60 μL av 0,05% FITC-dextran (se tabell over materialer) med et tips for gel lasting (figur 1B).
- Dosering 1 – 2 alikvoter (0,1 – 0,3 mL hver) av luft ved hjelp av glass droppers.
- Behold posisjonen for 60 s og la for mus utvinning som beskrevet ovenfor.
-
Symmetrisk bilateral IB-administrasjon
- Utfør trinn 5.3.1.1-5.3.1.8 (høyre lunge) og trinn 5.3.2.1-5.3.2.8 (venstre lunge).
- Administrere like volumer (30 μL) av 0,05% FITC-dextran (eller en eksperimentell agent) til hver side av lungene.
-
Bilateral IB-administrering med dose justering
- Utfør trinn 5.3.1.1-5.3.1.8 (høyre lunge) og trinn 5.3.2.1-5.3.2.8 (venstre lunge).
- Administrer større volum (40 μL) på 0,05% FITC-dextran til den større høyre lungen, og et mindre volum (20 μL) på 0,05% FITC-dextran til den mindre venstre lungen. I stedet for FITC-dextran, en eksperimentell agent kan administreres.
7. Bruk av dose justert IB administrasjon for å forbedre symmetri av enkelt dose bleomycin (BLM)-indusert lungeskade
-
BLM administrasjon grupper
- Dose justert IB-BLM (1,2 mg/kg, se tabell over materialer) administrasjon gruppe: 60 μL (20 μL for venstre lunge og 40 μL for høyre lunge, henholdsvis) av BLM løsning ble levert til mus (n = 5). Kontroller (n = 5) mottok lignende volumer av saltvann.
Merk: se trinn 5.3.1 og 5.3.2. - Gruppe for IT-administrasjon: 60 μL av BLM-løsning ble levert til mus med teknikker for IT-administrasjon.
Merk: se trinn 6.1.1 – 6.1.4.
- Dose justert IB-BLM (1,2 mg/kg, se tabell over materialer) administrasjon gruppe: 60 μL (20 μL for venstre lunge og 40 μL for høyre lunge, henholdsvis) av BLM løsning ble levert til mus (n = 5). Kontroller (n = 5) mottok lignende volumer av saltvann.
-
Måling av lungefunksjon
- På dag 21 etter BLM eller saltvann, bedøve mus med en intraperitoneal (IP) injeksjon av ketamin (160 mg/kg) og xylazine (32 mg/kg).
- Etter å ha bekreftet dybden av anestesi av pote/tå klype, utføre en trakeostomi med en 18 G kanyle (se tabell over materialer).
- Koble mus til ventilatoren og måle åndedretts mekanikere som tidligere beskrevet4.
-
Oppsamling og bearbeiding av lunge vev
- Etter måling av lunge mekanikere, euthanize de anesthetized musene ved hjerte punktering.
- Åpne brystveggen og indusere bilaterale pneumothoraces.
- Pump opp lungene med 1% lav smelte agarose (40 ° c)5 i PBS ved et jevnt trykk (42 cm H2O).
- Skjær fire til fem stykker av lungene langs den lange aksen tvers, fikse i 10% formalin, og legge i parafin.
- Skjær 5 μm seksjoner og beis med Masson ' s trichrome å visualisere kollagen deponering.
8 etter prosessuelle omsorg
- På slutten av overlevelse prosedyrer, plasserer dyret på en varmende teppe før det gjenvinner bevissthet. Gjenoppretting er vanligvis ferdig innen 2 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Selektiv IB intubering mål spesifikke fliker (høyre lunge) eller basilar segmenter (venstre lunge).
IB administrering av EBD til høyre lunge ble utført som beskrevet i avsnitt 5,1. Etter ferdigstillelse av eksperimentet, ble mus administrert en dødelig dose av intraperitoneal ketamin/xylazine, og lungene ble høstet for demonstrasjon av EBD-distribusjon (figur 4a, høyre). Brutto utseende av lungene viser at 90% av forsøkene kanylert den lille bakre flik av høyre lunge, mens 10% av forsøkene rettet mot dårligere flik. Det er spekulert på at de små volumene av disse fliker forklarer kompenserende tachypné av musen under hånd kanyleringen (for å opprettholde minuttventilasjon gjennom kateteret).
IB administrering av EBD til venstre lunge ble utført som beskrevet i avsnitt 5,2. 100% av forsøkene er rettet mot underlegne segmenter av venstre lunge (figur 4b). I motsetning til høyre-sidig intubering, ingen tachypné oppstår med dette engasjementet, reflekterer intubering (og ventilasjon) av større venstre lunge segmenter.
Tilpasningen av den selektive IB kanyleringen-teknikken kan målrette mot hele venstre eller høyre lunge.
Når IB kanyleringen er utført, uttak av IB kateter (og endringer i musen posisjonering, som beskrevet i avsnitt 5,3) kan brukes til å forbedre levering av agenter til alle fliker av høyre lunge (og alle segmenter av venstre lunge). Drypping av EBD løsning til høyre lunge (§ 5.3.1) vellykket målrettet rett fliker, som demonstrert i figur 5c. Drypping av EBD-løsningen til venstre lunge (del 5.3.2) lyktes med å målrette mot alle venstre segmenter (figur 6C).
IT-administrasjon eller SYMMETRISK IB-administrasjon gir asymmetrisk lunge parenkymatøs-agent konsentrasjoner, som kan korrigeres av IB Dosejustering.
Mus gjennomgikk bilateral administrasjon av 30 μL av 0,05% FITC-dextran til venstre lunge og 30 μL av 0,05% FITC-dextran til høyre lunge som beskrevet i avsnitt 6,2. Mus mottok også 60 μL av 0,05% FITC-dextran intratracheally i henhold til avsnitt 6,1. På slutten av eksperimentet, var mus euthanized via terminal anestesi overdose (ketamin/xylazine). Lungene ble umiddelbart høstet og homogenisert. FITC-fluorescens (kvantifisert med optisk tetthet) ble målt med 96-brønn plate leser. Dato ble analysert med studentens t-test for to-gruppe sammenligninger.
Som beskrevet i figur 7, både IT (figur 7a) og symmetrisk IB Administration (figur 7b) av FITC-DEXTRAN førte til asymmetrisk lunge parenkymatøs FITC fluorescens, med større relative konsentrasjoner (normalisert til vekt) nevnt i venstre lunge. Dette tyder på at asymmetrisk lunge levering av eksperimentelle agenter etter at IT-administrasjonen ikke er en konsekvens av asymmetrisk presentasjon av disse agentene til hver høyre bronkie. Snarere var det hypotetisk gjennomsnitt at lik høyre levering (som sikres ved symmetrisk IB administrasjon) ble fortynnet av forskjeller i lunge vekter/masse, som observert i tabell 2.
For å overkomme disse forskjellene i symmetrisk levering, 40 μL av 0,05% FITC-dextran ble administrert til den større høyre lunge og 20 μL til mindre venstre lunge, i henhold til punkt 6,3. Denne "dose justert IB Administration" forbedret symmetri av lunge parenkymatøs agent levering (figur 8a). Til tross for denne korreksjonen, men observerte vi vedvarende heterogenitet innenfor forskjellige fliker av høyre lunge (figur 8B).
BLM-indusert lungeskade i ulike leveringssystemer:
For å demonstrere at den dose justerte IB administrering av eksperimentelle midler kan forbedre modellering av diffus lungesykdom, administrerte vi BLM (en musemodell av fibrosing lungeskade) enten intratracheally eller via en dose justert IB-administrasjon, som pr. seksjon 7. som forventet med denne modellen av skade, både IT og IB injeksjoner av BLM førte til lungeskade og systemisk sykdom (med tap av vekt). Denne systemiske sykdommen løses i 7 dager. 21-dagers dødelighet var 20% (1/5) i IT-gruppen og 0% (0/5) i den dose justerte IB-gruppen.
21 dager etter IT-eller IB-BLM administrasjon, mus ble høstet for lunge histologi. Som demonstrert i representative histologic bilder (figur 9a),
For å finne ut om denne forbedrede homogenitet for antifibrotiske lungeskade er fysiologisk relevant, ble det observert at dose justert IB administrering av BLM formidlet en mer konsistent tap av inspirasjons kapasitet (IC) og overholdelse av åndedrettssystemet (CRS), samt en konkordante økning i åndedrettssystemet elastisitet (ers) (figur 9B).
Figur 1: anatomi av muse luftveiene kanyleringen. (A) en mus luftveis støpt ble gjort ved å blåse en mus lunge (høstet fra en 25 g mus) med silisium elastomer. (B) kateter plassering for standard IT-administrasjon. (C) kateter plassering for IB administrasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: oppsett for Arbeidsplattformen. (A) en metall bookend (90 ° vinkel) er bøyd til 70 °. En skrue hull er plassert i den øverste midtlinjen å feste en bevegelig (80 mm x 150 mm). Krok og sløyfe tape og en suspendere Sutur er plassert for å tillate posisjonering av en anesthetized mus på brettet. (B) plast styret er forankret med en skrue på metall bookend. Skruen er tilstrekkelig løs for å tillate rotasjon av brettet med urviseren (+) eller mot urviseren (-) retning. (C) en anesthetized mus er plassert ved hjelp av krok og sløyfe tape (0,75 W) for IT/IB agent administrasjon. En Sutur er vedtatt under musen fortenner å tillate hode stabilisering. Operatøren er plassert på rygg aspektet av musen, og halsen er opplyst via en gås nakke lampe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: opprettelse av tilpassede katetre for IB Administration. (Trinn 1) For å muliggjøre tilstrekkelig kateter lengde for å engasjere høyre bronkiene, kombineres to katetre. (Trinn 2) Katetre er koblet på en liten vinkel, tilrettelegging selektiv intubering til høyre bronkiene. (Trinn 3) Videre er den opp-drypping kateter spissen skråstilt, noe som gir bedre retningskontroll av luftveis- Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: tilnærming for selektiv høyre/venstre lunge Lobar kanyleringen og administrasjon. (A) for å målrette høyre lunge, er plast styret rotert + 30 °, forbedre enkel selektivt å engasjere de riktige høyre bronkie. Kateteret er avansert (per distanse foreslått i tabell 1) til selektivt engasjere høyre ensidig fliker. 20 μL av 0,3% EBD ble administrert. I ~ 90% av forsøkene, den bakre flik er kanylert. De resterende 10% av forsøkene engasjere dårligere flik. (B) for å målrette mot venstre lunge, plast styret er først rotert-74 ° for venstre høyre engasjement. Etter vellykket intubering av kateteret, er rotasjon deretter redusert til-30 ° for å tillate tyngdekraften å bistå med agent levering. For å påvise selektiv engasjement på venstre side ble 40 μL av 0,3% EBD levert. Denne tilnærmingen konsekvent (100% av forsøkene) målrettede venstre lunge basilar segmenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: symmetrisk administrasjon tilnærming til ensidig levere agenter til hele høyre lunge. (A) rett-side IB intubering ble utført ved 30 °, identisk med selektiv høyre lunge Lobar Kanyleringen (figur 4a). (B) plast styret ble deretter rotert til-74 ° for å tillate tyngdekraften hjelp under agent administrasjon. Kateter spissen trekkes deretter tilbake til dybder som er beskrevet i tabell 1, som tilsvarer høyre høyre bronkie. Skråkanten av spissen er plassert nedover ved å dreie kateter navet. (C) 30 μL EBD ble levert ved-74 °, som beviser diffus høyre lunge administrasjon av EBD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Tilnærming til symmetrisk administrasjon å ensidig administrere agenter til hele venstre lunge . (A) venstre-sidig IB intubering ble utført ved-74 °, identisk med selektiv venstre lunge Lobar Kanyleringen (figur 4b). (B) etter en vellykket intubering, plast styret ble deretter rotert + 86 ° for å tillate tyngdekraften hjelp under agent administrasjon. Kateter spissen trekkes deretter tilbake til dybden som er beskrevet i tabell 1. Skråkant på tuppen forskyves nedover ved å dreie kateter navet. (C) 30 ΜL av EBD ble levert med gel lasting spissen, beviser diffus venstre lunge administrasjon av EBD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: IT-administrasjon av eksperimentelle agenter er like levert til høyre bronkiene, men fører til ulike lunge parenkymatøs konsentrasjoner. (A) det administrering av 0,05% FITC-dextran (60 μL) formidlet høyere fluorescens i venstre lunge, noe som tyder på ujevne lunge konsentrasjoner av levert middel. (B) denne ulike lunge parenkymatøs fluorescens vedvarer selv når like volumer på 0,05% FITC-dextran (30 μL) administreres til hver høyre bronkie. Denne vedvarende parenkymatøs ubalanse, til tross for lik høyre/venstre høyre levering, tyder på at forskjellene i konsentrasjoner av lunge agenter reflekterer fortynning i den større høyre lungen (n = 10 per gruppe). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: forbedret homogenitet av agent deponering med dose JUSTERTE IB administrasjon. (A) asymmetri av lunge parenkymatøs levering forbedres når en større andel av midlet (40 μL av 0,05% FITC-dextran) administreres til den større høyre lunge og en mindre andel av MIDlet (20 μL av 0,05% FITC-dextran) til den mindre venstre lungen. (B) til tross for denne forbedrede venstre-høyre symmetri, er det fortsatt Lobar heterogenitet av agent deponering (svart: overlegen flik; gul: midtre flik; blå: mindreverdig flik; grønn: bakre flik; rød: venstre lunge). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: forbedring av mus BLM-indusert lunge fibrose modell ved hjelp av dose JUSTERT IB administrasjon. (A) IT-administrasjon av BLM (1,2 mg/kg i 60 μL-løsning) induserer venstre dominerende lungeskade/fibrose 21 dager senere, i samsvar med høyere lunge konsentrasjoner av agent i denne mindre lunge. Venstre-høyre symmetri forbedrer ved å justere volumet på BLM til hver side av lungene: 40 μL av oppløsningen administreres til den større høyre lunge og 20 μL av oppløsningen administreres til den mindre venstre lungen. I: dårligere flik, M: midtre flik, S: overlegen flik, P: bakre flik. Bilder representerer fliker fra en enkelt, representativ mus. (B) i samsvar med forbedret symmetri distribusjon, forbedrer den dose justerte IB ADMINISTRERING av BLM fysiologiske modellering av lunge fibrose, med mer representative økninger i luftveiene elastisitet (ers) og nedgang i inspirasjons kapasitet (IC) og dynamisk samsvar med åndedrettssystemet (CRS). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kroppsvekt (g) | Antall mus testet | Kateter dybde (mm) for selektiv kanyleringen |
Kateter dybde (mm) for hele lunge kanyleringen | |
| Høyre lunge | Venstre lunge | |||
| 15 - 19 | 17 | 37 | 38 | 26 |
| 20 - 25 | 22 | 38 | 39 | 27 |
| 25 - 30 | 29 | 39 | 40 | 28 |
| > 30 | 11 | 40 | 41 | 31 |
Tabell 1: foreslått dybde på kateter innsetting. Spådd kateter dybder nødvendig å selektivt kannelerer den proksimale lungene ble empirisk bestemt ved hjelp av C57BL/6 mus av ulike vekter (totalt = 79 mus).
| Kroppsvekt (g) | Antall mus testet | Forholdet mellom lunge vekter |
| 14 - 10 | 25 | 2,01 ± 0,16 |
| 20 - 25 | 35 | 1,88 ± 0,27 |
| 25 - 30 | 15 | 1,88 ± 0,27 |
| > 30 | 6 | 2,03 ± 0,09 |
Tabell 2: høyre: venstre lunge vekt prosenter. Forskjeller i lunge vekter observert hos 81 C57BL/6 mus viser begrunnelsen for korrigert IB narkotika administrasjon. Lungene ble dissekert og veid etter en dødelig dose av ketamin og xylazine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lungeskade har vært klassisk modellert i gnagere bruke IT-administrasjon av skadelig agenter som BLM6. Slike IT-administrasjon, men fører bare til usammenhengende skade, reflekterer nontargeted natur lunge levering med denne tilnærmingen7. Disse begrensningene for modellering lungeskade er lærerike utfordringer når de forsøker IT-levering av ikke-skadelig eksperimentelle agenter, for eksempel narkotika, siRNA, eller cellulære terapier.
I denne rapporten beskriver vi direkte IB administrasjon av eksperimentelle agenter. Denne tilnærmingen gir to forskjellige fordeler fremfor klassiske tilnærminger til IT-administrasjon. For det første gjør tilnærmingen for selektiv ensidig administrasjon til en lunge, noe som åpner for sparing av kontralateral lunge. Denne tilnærmingen er nyttig for selektiv administrering av narkotika i en ensidig skadet lunge (f. eks iskemi-reperfusion skade8), unngå ikke-spesifikke effekter i uskadet lunge. Videre kan styrt administrering av tumorceller brukes til å skille primær tumor vekst fra kontralateral, metastatisk spredning9,10.
For det andre, rapporten detaljene en tidligere ugjenkjennelig fordel av IB administrasjon. Som beskrevet i figur 7a, konsentrerer IT-administrasjonen relativt eksperimentelle agenter innenfor de mindre venstre lungene. Denne asymmetri kan korrigeres ved å administrere et relativt større volum av agent til større høyre lunge (tabell 2), mens levere et mindre volum til mindre venstre lunge (figur 8a). Relevansen av denne dose justerte IB-administrasjonen til BLM-indusert antifibrotiske lungeskade ble vist her. Dose justering demper skaden på venstre lunge (som fikk mindre BLM), samtidig som det øker skade på høyre lunge (figur 9a). Denne økte symmetri sammenfaller med redusert variasjon av lungeskade, som kvantifisert av målinger av lungefunksjonen (figur 9B).
Det er flere kritiske trinn i protokollen, inkludert behovet for å ha et stativ som er i stand til å enkelt og gjentatte ganger endre dyr posisjonering (dvs. rotasjon). Mer kritisk er evnen til å avgjøre når selektiv lunge kanyleringen er oppnådd. Som beskrevet i avsnitt 4,12, bruk av en spirometeret (der en Vannsøyle demonstrerer tidevanns ventilasjon) sikrer vellykket tracheal kanyleringen3. Observasjon av mus tachypné er konsistent med det kanyleringen høyre lunge segmentet, mens fraværet av dyspné (til tross for følelse motstand med kateter innsetting) foreslo kanyleringen av venstre lunge. Ved hjelp av disse ikke-operative lokalisering teknikker, bør operatøren være i stand til nøyaktig guide IB kanyleringen og eksperimentell agent deponering.
Denne tilnærmingen har flere begrensninger. Den IT-modell av agent levering er attraktiv i sin enkelhet. Det krever en moderat grad av praksis og tekniske ferdigheter, selv om en dyktig operatør kan fortsatt raskt utføre denne teknikken i vinduet av isoflurane anestesi. Den ekstra tekniske ferdigheter/praksis som kreves, kan imidlertid lett oppveid av fordelen med denne tilnærmingen i eksperimenter som prioriterer enten selektiv agent/siRNA/Cell levering eller økt homogenitet av agent deponering. En ekstra begrensning på denne metoden er usikkerheten med hensyn til lengden på kateter innsetting. Som beskrevet i tabell 1ble 79 mannlige og kvinnelige mus målt for å anslå dybden av kateter innsetting som er nødvendig for selektiv IB kanyleringen. Disse dataene tjene som en ressurs for å veilede operatøren til å utføre vår protokoll. Vi kan imidlertid ikke trygt ekstrapolere vår ressurs til andre mus stammer (inkludert knockout mus) eller sykelig overvektige mus. I tillegg har vi ikke målt hvis det er forskjeller i luftrom volum (Lobar, segmental) som varierer basert på vekt. Som sådan, det er en mulig det stor mus kanskje være i stand til huse større drypping mengder med IB administrasjon. Dermed bør operatøren utføre en innledende optimalisering/feilsøkingstrinn (ved hjelp av EBD-drypping) for å sikre at vår teknikk er godt tilpasset den ønskede muse modellen.
Oppsummert beskriver denne rapporten en roman IB teknikk som kan brukes til å selektivt administrere eksperimentelle agenter til en enkelt lunge eller tilpasset for å sikre symmetrisk distribusjon gjennom begge lungene. Disse fordelene rettferdiggjør den marginale økningen i kompleksitet sammenlignet med standard IT-teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NHLBI stipend HL125371 til E.P.S. og av DOD (CDMRP) Grant W81XWH-17-1-0051 til Y.Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G shielded IV Catheter | BD | 381423 | |
| Bleomycin | Enzo life sciences | BML-AP302-0010 | |
| Compact Mini rodent anesthesia machine | DRE Veterinary | 9280 | |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC | |
| LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-30W | |
| Low temperature cautery with fine tip | Bovie | AA02 | |
| Precisionglide needle, 18G x 1" | BD | 305195 | Beveled tip, 12 mm in length |
| Xylazine | AKORN | NDC 59399-110-20 | |
| Zatamine | VetOne | NDC 13985-702-10 | Ketamine |
References
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106 (3), 984-987 (2009).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
- Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung. Laboratory Investigation. 71 (1), 149-153 (1994).
- Thrall, R. S., McCormick, J. R., Jack, R. M., McReynolds, R. A., Ward, P. A. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat: inhibition by indomethacin. American Journal of Pathology. 95 (1), 117-130 (1979).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), L379-L399 (2008).
- Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44 (8), e604-e613 (2016).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13 (6), 349-358 (2000).
