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Medicine

直接注射内管理,改善小鼠肺内的选择性代理沉积

doi: 10.3791/59450 Published: May 20, 2019

Summary

小鼠实验剂的内切管 (IT) 给给通常会导致对称输送到远端肺部。 在这份报告中,我们描述了一种直接的肺内(IB)方法,用于对活体小鼠的每项肺进行非手术处理。 这种方法可用于选择性地将制剂施用到一个肺上,或者可以调整以改善对称剂向两个肺的输送。

Abstract

实验性制剂的内切内(IT)管理是扩散性肺病(如博霉素引起的肺纤维化)的鼠模型中必不可少的技术。 然而,在远端小鼠肺中,内切开剂的分布往往是不对称的,小鼠的左肺中肺气肿浓度增加。 本报告中描述了一种新的肺内(IB)方法,用于使活小鼠的左肺和/或右肺不手术。 还演示了如何利用这种方法选择性地将试剂施用到一个肺或调整(通过剂量调整的IB交付),以改善实验剂肺输送的左右对称性,从而改进扩散模型肺病,如博洛霉素引起的肺纤维化。

Introduction

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小鼠实验剂的直接肺给给术可用于研究肺免疫反应、急性肺损伤和肺纤维化。直接肺管理通常通过内切术 (IT) 灌输执行,如前面描述的1,2,3。然而,这种方法是非选择性的,以非靶向和经常不对称的方式影响两个肺。 肺损伤的实验建模可能受益于选择性地瞄准一个特定肺的能力,允许使用反向肺作为对照。相反,人类扩散性肺病的精确建模得益于实验剂对称分布到双边肺气肿。

本报告的总体目标是描述一种选择性地将实验剂输送到小鼠左肺或右肺的方法(图1)。这种支管内(IB)管理方法允许对小鼠肺进行单方面治疗,并可轻松加以调整,以确保将制剂平等交付给双边主干支气管。通过使用IB管理将大剂量的实验剂输送到较大的右肺,将更小的体积输送到较小的左肺(即剂量调整的IB给药),本报告证明的是肺的同质性的改善提供实验剂,优化小鼠扩散性肺损伤模型。因此,这份报告对于寻求单方面给小鼠施用实验剂或改善两个肺部药物沉积的对称性的调查者可能具有价值。

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Protocol

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所有动物协议都已获得科罗拉多大学丹佛机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。下面描述的所有程序(第 4-7 节)都使用雄性和雌性 C57BL/6 小鼠进行了优化。这种方法已经验证使用小鼠范围从19-40克的体重。

1. 创建IB管理平台

  1. 将书尾从基底翼和站立翼之间的原始 90° 角度弯曲到 70°(图 2A)。
  2. 在金属书底立翼的中端钻一个孔(图2A)。
  3. 在塑料板的相应位置钻一个相同大小的孔。下部和横向钻两个小孔(图2A)。
  4. 在塑料板上的这些小孔之间打下4:0的丝线(图2A)。
  5. 将钩和环胶带放在塑料板的边缘(图2A)。
  6. 用螺钉将塑料板组装到金属书头(图2B)。确保螺杆螺母足够紧,以便将板固定到位,同时在必要时允许调整角度。
  7. 确保塑料板的旋转是顺时针和逆时针的,自由移动。
    注: 顺时针运动在此报告中表示为 (+) 度旋转,逆时针表示为 (-) 度旋转。
  8. 使用角量角器将塑料板定位在 [30]、[86]、-30°和 -74°处,并分别在书尾标记它们。

2. 为IB代理管理建立扩展导管

  1. 在原装 22 G 导管的尖端使用锋利的刀片进行直角切割(25 mm,参见材料表)(图 3,步骤 1a)。
  2. 用刀片将其他原始导管的尖端(±50±±60°)斜切,然后从轮毂以直角切断(图3,步骤1b)。
  3. 用略小于 180° 角将两个导管粘附在钝端(图 3,步骤 2)。
  4. 通过低温烧焦熔化,使斜尖变硬(参见材料表)。
  5. 在粘合区域和扩展导管的斜尖上抛光带有"0"大小的沙纸的扩展导管(图 3,步骤 3)。
  6. 在 25 mm、30 mm 和 35 mm 处用不同颜色的扩展导管标记(图 3,步骤 3)。
  7. 通过标记其集线器,指示扩展导管的斜面。
  8. 用DI水冲洗扩展导管,然后用70%乙醇冲洗导管内部。把导管晾干。
  9. 使用前使用紫外线消毒10分钟。

3. 程序前准备

  1. 使所有施用的试剂在无菌技术下的生物安全罩。
  2. 使用 70% 乙醇清洁工作场所。
  3. 用70%乙醇消毒所有手术工具。
  4. 将工作平台的底座固定在研究人员面前的长凳上,将 C 形夹固定在书尾的基翼上。
  5. 生成几个临时的肺活量计,这些装置将允许检测小鼠的潮汐气流。简单地说,将60 μL的灭菌盐水沉积到1 mL注射器中(取出柱塞),并带有凝胶加载头。
    注:沉积的盐水滴遮挡桶,并在暴露于潮汐通风3时上下移动。
  6. 松散地将 22 G 扩展导管的集线器连接到临时肺活量计。
  7. 将每个玻璃滴器放在平台的每一侧,以便于访问。
  8. 将电子芦原感应室连接到与分路体兼容的生物安全柜中的啮齿动物麻醉机(见材料表)。

4. 非操作性IT插管方法

  1. 用氧气(2 L/min)和5%的子胶(见材料表)在感应室中麻醉C57BL/6小鼠(男性或雌性,8~10周,±25克)。
  2. 将要交付的实验剂(例如,如图 4所示的 Evans 蓝色染料或 FITC-dextran)吸入两个移液器中,然后在镇定期间将它们放在平台的每一侧。
  3. 在将小鼠从麻醉感应室中取出之前,确保呼吸速率约为 24-30 次/分钟。
    注:共和麻醉通常持续4分钟,足以进行所有IB手术。如果操作者不精通该技术,氯胺酮/西拉津(80毫克/千克和10毫克/千克内腹,见材料表)可用于更长时间的麻醉。
  4. 将鼠标的切口悬挂在悬垂缝合线上的上。用两到三块钩子固定鼠标,并松散地环住胶带,避免通风受限。
  5. 打开 LED 光纤照明器(参见材料表,图 2C)。
  6. 将操作员放在平台后面(鼠标背)。
  7. 定向照明器的鹅颈,使其通过皮肤照亮喉部区域。鼠标和光源之间的距离为 2⁄3 厘米 (图 2C)。
  8. 在执行以下所有步骤之前,用脚趾/爪子捏合确认麻醉深度。
  9. 用主导手握住无菌钳,然后用钳子将舌头从口腔中抽出。
  10. 用非主导手握住无菌压压器,然后用压压器压平舌头根,广泛暴露口角。然后,可以释放钳子,释放占支配力的手。
  11. 使用主手通过口腔将延长的导管插管插入气管(图2C)。
  12. 通过观察注射器中的气泡是否随每次呼吸上下移动来确认放置位置。
  13. 有关 IT 插管的其他详细信息已于3之前发布。总手术时间(不包括麻醉)对于训练有素的操作员来说持续 10-15 s。

5. 非操作性IB插管和交付方法

  1. 远端右肺选择性叶条插的IB方法
    1. 执行 IT 罐化(步骤 4.11)后,旋转塑料板 [30](图 4A)。
    2. 握住导管的轮毂,并自然地将其与鼠标中线平行,将其扩展到表1中描述的基于重量的深度。
      注:应注意这些深度的电阻。此时,小鼠将变得轻微发痒,如代表性结果中所述。对于有经验的操作员,大约 90% 的尝试将成功地使右肺(并注明)。
    3. 提供 20 μL 的 0.3% 埃文斯蓝色染料 (EBD, 参见材料表) 与凝胶加载尖端.
    4. 使用玻璃滴漏器分配 1⁄2 等分量(每片 0.1 mL)空气。
      注:这可确保残留EBD溶液(或实验剂)从导管内部清除。
    5. 拔下导管,然后保持鼠标位置 30 s。
    6. 将动物放在温暖的毯子上,直到它恢复知觉。恢复通常在 2 分钟内完成。
  2. 远端左肺选择性分段管的IB方法
    1. 执行 IT 罐制(步骤 4.11)后,旋转塑料板 -74° (图 4B)。
    2. 握住导管的轮毂,施加轻柔的压力,将导管推进到左侧主干支气管中,同时向下(90°)和朝下向书端施加适度压力。在表1中注明的深度,当左肺的下部被接合时,操作员应注意阻力。如果发生心动过速,将导管拔至 20⁄25 mm 位置,然后重新尝试。
    3. 在左下肺段的分段后,需要改变位置,以便对剂管理进行重力辅助。旋转塑料板 -30° (图 4B)。
    4. 使用凝胶加载尖端提供 40 μL 的 0.3% EBD。
      注:提供较大体积的代理是可行的,因为左肺只有一个叶。
    5. 使用玻璃滴漏器分配 1⁄2 等分量(每片 0.1~0.3 mL) 空气。
      注:这可确保从导管内部清除任何残留的EBD(或实验剂)。
    6. 拔下导管,然后保持鼠标位置 30 s。
    7. 将动物放在温暖的毯子上,直到它恢复知觉。恢复通常在 2 分钟内完成。
  3. 调整IB管理,允许将代理输送到左肺或右肺
    注:如果操作者寻求将试剂不输送到特定的右肺叶或左肺段,而是运送到整个肺(右肺或左肺),导管应稍微撤回到各自的主干支气管,如下所示。
    1. 右整个肺管理
      1. 步骤 4.11 后,旋转塑料板 [30](图 5A)。
      2. 握住导管的轮毂,并自然地将其与鼠标中线平行,到达右侧远端角管插管所需的深度(表1)。
      3. 确认心动过速符号的外观。
      4. 旋转鼠标 -74°,为代理交付提供重力辅助 (图 5B)。
      5. 将导管拔至与右主干支气管起飞相对应的位置(表1)。确保导管的斜面朝下 (图 5B)。
      6. 提供 30 μL 的 0.3% EBD,并带有凝胶加载头到右肺。
      7. 使用玻璃滴漏器分配 1⁄2 等分量(每支 0.1–0.3 mL)的空气。
      8. 拔下导管,然后保持小鼠位置30s。将动物放在加热毯上,直到它恢复知觉。恢复通常在 2 分钟内完成。
    2. 左整个肺给给
      1. 步骤 4.11 后,旋转塑料板 -74° (图 6A)。或者,在步骤 5.3.1.8 之后,可以通过将导管取出到气管进行旋转,从而实现双边 IB 代理管理。
      2. 握住导管的轮毂,施加轻柔的压力,将导管推进到左侧主导管中,同时向下(90°)和朝下放置适度压力。插管深度由表1指导。
      3. 确认无心动过速迹象。
      4. 旋转鼠标 [86],以便使用代理管理进行重力帮助。
      5. 将导管拔至左侧主干支气管(与右肺的距离足够,1)并向下旋转导管的斜面(图 6B)。
      6. 将 30 μL 的 0.3% EBD 与凝胶加载头输送到左肺。
      7. 使用玻璃滴漏器分配 1⁄2 等分量(每支 0.1–0.3 mL)的空气。
      8. 拔下导管,然后保持小鼠位置30s。将动物放在加热毯上,直到它恢复知觉。恢复通常在 2 分钟内完成。

6. 使用连续IB可塑方法向每个肺提供剂量调整的试剂量

  1. IT 管理组
    1. 执行步骤 4.1_4.11 中所述的 IT 可测量。
    2. 提供 60 μL 的 0.05% FITC-dextran(参见材料表),带有凝胶加载尖端(图 1B)。
    3. 使用玻璃滴漏器分配 1⁄2 等分量(每片 0.1~0.3 mL) 空气。
    4. 保持位置 60 s,并允许如上所述恢复鼠标。
  2. 对称双边IB管理
    1. 执行步骤 5.3.1.1~5.3.1.8(右肺)和步骤 5.3.2.1~5.3.2.8(左肺)。
    2. 在肺的每一侧施用0.05%FITC-dextran(或实验剂)的等量(30 μL)。
  3. 剂量调整双边IB管理
    1. 执行步骤 5.3.1.1=5.3.1.8(右肺)和步骤 5.3.2.1=5.3.2.8(左肺)。
    2. 将大体积(40 μL)0.05%FITC-dextran管理到较大的右肺,将体积(20μL)的0.05%FITC-dextran管理到较小的左肺。代替FITC-dextran,可以管理一个实验剂。

7. 使用剂量调整IB给药改善单剂量布洛霉素(BLM)引起的肺损伤的对称性

  1. BLM 管理组
    1. 剂量调整的IB-BLM(1.2毫克/千克,见材料表)给给小鼠的BLM溶液给小鼠(n = 5)。60 μL(左肺为20μL,右肺分别为40μL)。控件 (n = 5) 收到类似的盐量。
      注:请参阅步骤 5.3.1 和 5.3.2。
    2. IT 管理组:使用 IT 管理技术向小鼠交付了 60 μL 的 BLM 解决方案。
      注:请参阅步骤 6.1.1~6.1.4。
  2. 肺功能测量
    1. 在BLM或盐水之后的第21天,用氯胺酮(160毫克/千克)和木兰辛(32毫克/千克)注射腹内(IP)对小鼠进行麻醉。
    2. 通过爪子/脚趾捏确认麻醉深度后,使用 18 G 形管进行气管切开术(参见材料表)。
    3. 将小鼠连接到呼吸机并测量呼吸力学,如前所述4。
  3. 肺组织收集和处理
    1. 在测量肺力学后,通过心脏穿刺使麻醉小鼠安乐死。
    2. 打开胸壁,诱导双边肺气肿。
    3. 在一致压力(42厘米H2O)下,在PBS中用1%低熔化甘贺金(40°C)5充气肺。
    4. 沿着长轴横向切割四到五块肺,固定在10%的形式,并嵌入石蜡中。
    5. 使用马森的三铬切割5μm部分和染色,以可视化胶原蛋白沉积。

8 程序后护理

  1. 在生存程序结束时,将动物放在加热毯上,直到它恢复意识。恢复通常在 2 分钟内完成。

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Representative Results

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选择性IB插管针对特定的叶(右肺)或巴勒拉段(左肺)。

IB给右肺的EBD给分部,如第5.1节所述。实验完成后,给小鼠注射致命剂量的腹内氯胺酮/木氨酸,并采集肺部以证明EBD分布(图4A,右图)。肺毛外观表明,90%的尝试可以使右肺的小后叶,而10%的尝试针对下等叶。据推测,这些叶的小体积解释了小鼠在远端气管过程中的补偿性性性节节(通过导管保持分钟通气)。

IB对左肺的EBD给分给进行了第5.2节所述。100%的尝试针对左肺的劣质部分(图4B)。与右侧插管相比,这种接触不会发生心动过节,这反映了较大左肺段的插管(和通气)。

选择性IB可控制技术的适应可以针对整个左肺或右肺。

一旦IB可以执行,提取IB导管(和鼠标定位的变化,如第5.3节详述)可用于改善试剂的交付到右肺的所有叶(和左肺的所有部分)。将EBD溶液灌输至右肺(第5.3.1节)成功地瞄准了所有右叶,如图5C所示。向左肺灌输EBD溶液(第5.3.2节)成功瞄准了所有左段(图6C)。

IT 管理或对称 IB 管理产生不对称肺parenchymal剂浓度,可以通过IB剂量调整来纠正。

小鼠接受30μL的双边给左肺0.05%FITC-dextran和30μL的0.05%FITC-dextran到右肺,如第6.2节所述。或者,小鼠接受60 μL的0.05%FITC-dextran,根据第6.1节。在实验结束时,通过绝症过量(氯胺酮/西拉津)对小鼠进行安乐死。肺立即收获和同质化。使用 96 孔板读取器测量 FITC 荧光(按光学密度量化)。通过学生t-test对日期进行分析,进行两组比较。

如图7所示,FITC-dextran 的 IT(图 7A)和对称 IB 管理(图 7B)均导致非对称肺节合 FITC 荧光,其中指出的相对浓度(归化为重量)左肺。这表明,在IT管理后,实验性试剂的不对称肺传递并不是这些制剂向各主干支气管的不对称呈现的结果。相反,假设相等的主干传递(由对称IB管理所保证)被肺重量/质量的差异所稀释,如表2所观察到的。

为了克服对称传递中的这些差异,根据第 6.3 节,对较大的右肺施用 40 μL 的 FITC-dextran,对较小的左肺施用 20 μL。这种"剂量调整IB给药"改善了肺皮剂输送的对称性(图8A)。然而,尽管如此修正,我们观察到右肺不同叶内持续存在的异质性(图8B)。

不同输送系统中的BLM诱发肺损伤:

为了证明剂量调整的IB给药可以改善弥漫性肺病的建模,我们根据部分在神经内或通过剂量调整的IB给药施用BLM(一种纤维化肺损伤的小鼠模型)7. 正如这种损伤模型所预料的,IT和IB注射BLM都导致肺部损伤和全身疾病(体重减轻)。这种全身性疾病在7天内就解决了。21天死亡率为20%(1/5)在IT组和0%(0/5)在剂量调整IB组。

在IT或IB-BLM给政21天后,小鼠被收获用于肺体学。如代表性组织学图像所示(图9A),

为了确定纤维性肺损伤的左右同质性是否改善,观察到对BLM的剂量调整IB施用使呼吸能力(IC)和呼吸系统符合性更加一致。(Crs),以及呼吸系统抗性(Ers)的一致增加(图9B)。

Figure 1
图1:小鼠气道气道解剖学。(A) 老鼠气道铸造是用硅弹性体充气小鼠肺(从25克小鼠中收获的)。(B) 标准 IT 管理的导管放置。(C) IB管理的导管放置。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:工作平台的设置。(A) 金属书底 (90° 角) 弯曲到 70°.在顶部中线放置一个螺钉孔,以锚定可移动的(80 mm x 150 mm)。钩子和环带和悬挂缝合线被放置,以允许在板上放置麻醉鼠标。(B) 塑料板用螺丝固定在金属书底上。螺钉足够松,允许以顺时针 (+) 或逆时针 (-) 方向旋转板。(C) 麻醉鼠标与钩带和环带(0.75"W)一起定位,用于 IT/IB 代理管理。缝合线在鼠标切口下传递,以允许头部稳定。操作员位于鼠标的背部,颈部通过鹅颈灯照明。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:为IB管理创建定制导管。(步骤 1)为了获得足够的导管长度来接合主干支气管,将两根导管组合起来。(步骤 2)导管以轻微角度连接,促进选择性插管到主干支气管。(步骤 3)此外,远端导管尖端被斜移,允许更好的方向控制气道气道气。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:选择性右/左肺叶管插管和给给的方法。(A) 为了瞄准右肺,塑料板旋转 [30],提高了选择性地接触右主干支气管的易性。导管是先进的(表1中建议的每个距离),以选择性地接合右侧叶。施用20μL的0.3%EBD。在+90%的尝试中,后叶是可分的。其余 10% 的尝试都涉及劣质叶。(B) 为了瞄准左肺,塑料板首先旋转 -74° 进行左主干啮合。导管成功插管后,旋转减小到-30°,以允许重力帮助代理交付。为了证明左侧的选择性参与,交付了 40 μL 的 0.3% EBD。这种方法一致(100%的尝试)针对左肺巴勒段。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:对称管理方法,单方面将试剂输送到整个右肺。(A) 右侧IB插管在+30°处进行,与选择性右肺叶管插管相同(图4A)。(B) 塑料板随后旋转至-74°,以便在剂管理过程中提供重力辅助。然后,导管尖端被撤回到表1中详述的深度,对应于右主干支气管。通过旋转导管轮毂,将刀尖的斜面向下定位。(C) 30 μL EBD 在 -74° 时交付,证明 EBD 的扩散右肺给给。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图 6:对称管理方法单方面管理整个左肺的代理.(A) 左侧IB插管在-74°时进行,与选择性左肺叶节相同(图4B)。(B) 插管成功后,塑料板被旋转[86],以便在剂管理过程中提供重力辅助。然后,导管尖端被撤回到表 1中详述的深度。通过旋转导管轮毂,尖端的斜面向下移动。(C) 30 μL EBD 与凝胶加载尖端一起交付,证明 EBD 的扩散左肺给给。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7:实验性制剂的IT管理同样被输送到主干支气管,但会导致不同的肺气管浓度。(A) IT 给给 0.05% FITC-dextran (60 μL) 的 IT 给给左肺的荧光较高,表明输送剂的肺浓度不均匀。(B) 即使对每种主干支气管施用 0.05% FITC-dextran (30 μL) 的相等体积,这种不相等的肺气管荧光仍然存在。这种持续的节温不平衡,尽管右/左主干传递相等,表明肺剂浓度的差异反映了大右肺的稀释(n = 每组10)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图8:通过剂量调整IB提高剂沉积的同质性管理。(A) 当较大比例的试剂(40 μL,0.05% FITC-dextran)被施用至较大的右肺,而较小的左肺的代理(20 μL 0.05% FITC-dextran)比例较低时,肺节质输送的不对称性得到改善。(B) 尽管这种改善的左-右对称性,但代理沉积仍然存在叶差异质性(黑色:上垂;黄色:中叶;蓝色:下垂;绿色:后叶;红色:左肺)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 9
图9:使用剂量调整IB给药改善小鼠BLM诱导肺纤维化模型。(A) BLM 的 IT 给给(60 μL 溶液中 1.2 mg/kg)在 21 天后诱导左侧主要肺损伤/纤维化,与这种较小肺中较高的肺剂浓度一致。通过调整BLM体积到肺的每一侧,左-右对称性得到改善:溶液的40μL被施用到较大的右肺,20μL的溶液被施用到较小的左肺。I: 下级叶, M: 中叶, S: 上级叶, P: 后叶.图像表示单个代表鼠标的叶。(B) 与分布的对称性改善一致,BLM 的剂量调整 IB 管理改善了肺纤维化的生理建模,呼吸系统抗性增加 (Ers) 和吸气能力 (IC) 和动态呼吸系统符合性 (Crs)。请点击此处查看此图的较大版本。

体重(克) 测试的小鼠数量 导管深度(毫米)
用于选择性罐分
全肺罐的导管深度 (mm)
右肺 左肺
15 - 19 17 37 38 26
20 - 25 22 38 39 27
25 - 30 29 39 40 28
> 30 11 40 41 31

表1:导管插入的建议深度。预测导管深度是必要的选择性的远端和近端肺的经验确定使用C57BL/6小鼠的各种重量(共= 79小鼠)。

体重(克) 测试的小鼠数量 肺重量之比
14 - 10 25 2.01 ± 0.16
20 - 25 35 1.88 ± 0.27
25 - 30 15 1.88 ± 0.27
> 30 6 2.03 ± 0.09

表2:右:左肺体重比。在81个C57BL/6小鼠中观察到的肺重量差异证明了纠正IB药物给药的理由。肺被解剖和称重后,氯胺酮和木兰素的致命剂量。

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Discussion

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肺损伤在啮齿类动物中采用IT管理,如BLM6。肺损伤是典型的模型。然而,这种IT管理只会导致零碎的伤害,反映了这种方法7的肺分娩的非针对性。模拟肺损伤的这些局限性是尝试提供非有害实验性药物(如药物、siRNA 或细胞疗法)的 IT 时面临的指导性挑战。

在本报告中,我们描述了对实验代理的直接IB管理。与传统的 IT 管理方法不同,此方法具有两种截然不同的优势。首先,该方法允许选择性的单方面给一个肺,允许保留反向肺。这种方法可用于选择性地将药物给单方面受伤的肺部(例如,缺血再灌注损伤8),避免在未受伤的肺部产生非特异性影响。此外,肿瘤细胞的定向给给可用于区分原发性肿瘤生长与反向、转移性扩散9、10。

其次,报告详细说明了IB管理以前未被承认的好处。如图7A所示,IT管理相对地将实验试剂集中在较小的左肺内。这种不对称可以通过向较大的右肺施用相对较大的剂量来纠正(表2),同时向较小的左肺提供较小的体积(图8A)。本文演示了这种剂量调整IB给药与BLM引起的纤维化肺损伤的相关性。剂量调整减轻左肺(其接受较少BLM)的损伤,同时增加右肺的损伤(图9A)。这种增加对称性与肺损伤变异性降低相吻合,通过肺功能测量来量化(图9B)。

协议中有几个关键步骤,包括需要有一个能够轻松和反复地改变动物定位(即旋转)的支架。更为关键的是确定何时实现选择性肺结角的能力。如第 4.12 节所述,使用肺气计(其中水柱显示潮汐通气)可确保成功的气管罐3。观察小鼠心动过速与远右肺部分可口一致,而缺乏呼吸困难(尽管感觉与导管插入有抵抗力)建议左肺的可口。使用这些非手术定位技术,操作者应该能够准确引导IB罐和实验代理沉积。

此方法有几个限制。代理交付的 IT 模型在简单性方面很有吸引力。它需要适度的实践和技术技能,虽然熟练的操作者仍然可以在异曲斯麻醉窗口内快速执行这种技术。然而,在优先考虑选择性剂/siRNA/细胞交付或增加代理沉积同质性的实验中,这种方法的好处很容易抵消所需的额外技术技能/实践。此方法的另一个限制是导管插入长度的不确定性。如表1所详述,测量了79只雄性小鼠和雌性小鼠,以估计选择性IB插管所需的导管插入深度。这些数据用作指导操作员执行我们的协议的资源。然而,我们不能自信地将我们的资源推断给其他小鼠菌株(包括敲孔小鼠)或病态肥胖小鼠。此外,我们尚未测量空域体积(罗巴、分段)是否因重量而异。因此,大型小鼠可能能够适应IB管理的更大的灌输量。因此,操作员应执行初始优化/故障排除步骤(使用 EBD 灌输),以确保我们的技术能够很好地适应所需的鼠标型号。

总之,本报告描述了一种新的IB技术,该技术可用于选择性地将实验剂施用到单个肺上,或加以调整,以确保两个肺的对称分布。与标准 IT 技术相比,这些好处证明复杂性略有增加是合理的。

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Disclosures

提交人宣称,他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作由NHLBI向E.P.S.提供HL125371赠款和国防部(CDMRP)赠款W81XWH-17-1-0051给Y.Y.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

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References

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直接注射内管理,改善小鼠肺内的选择性代理沉积
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Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).More

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

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