Summary
Intratracheal (IT) toediening van experimentele agentia bij muizen resulteert vaak in asymmetrische afgifte aan de distale longen. In dit rapport beschrijven we een directe intrabronchiale (IB) benadering om elke Long in levende muizen niet-operatief te cannuleren. Deze aanpak kan worden gebruikt om agenten selectief te beheren tot één Long of kan worden aangepast om de symmetrische agent levering aan beide longen te verbeteren.
Abstract
Intratracheal (IT) toediening van experimentele agentia is een essentiële techniek in muriene modellen van diffuse longziekten, zoals bleomycine-geïnduceerde pulmonale fibrose. Echter, distributie van intratracheally-toegediende agenten aan de distale muis Long is vaak asymmetrisch, met de Long parenchymale concentraties verhoogd in de kleinere (maar even toegankelijk) linker long van de muis. Beschreven in dit rapport is een nieuwe intrabronchiale (IB) benadering om de linker-en/of rechter longen van levende muizen niet-operatief te cannuleren. Het is ook aangetoond hoe deze aanpak kan worden gebruikt om agenten selectief te beheren tot één Long of aangepast (via dosis gecorrigeerde IB-levering) om de linker-rechter symmetrie van de Long afgifte van experimentele agentia te verbeteren, waardoor de modellen van diffuse longziekte zoals bleomycine-geïnduceerde pulmonale fibrose.
Introduction
Directe pulmonale toediening van experimentele agenten in muizen zorgt voor de studie van Long immuunresponsen, acute long letsel, en longfibrose. Directe Long toediening wordt meestal uitgevoerd via intratracheale (IT) instillatie, zoals eerder beschreven1,2,3. Deze benadering is echter niet-selectief, waardoor beide longen in een nontargeted en vaak asymmetrische wijze worden aangetast. Experimentele modellering van long letsel kan profiteren van de mogelijkheid om selectief te richten op een specifieke Long, waardoor het gebruik van de contralaterale Long als een controle. Omgekeerd, accurate modellering van menselijke diffuse longziekten profiteert van symmetrische verdeling van experimentele agentia naar het bilaterale Long parenchym.
Het algemene doel van dit verslag is het beschrijven van een methode voor selectieve levering van experimentele agentia aan de linker-of rechter long van een muis (Figuur 1). Deze intrabronchiale (IB) toedieningsweg zorgt voor een eenzijdige behandeling van een muis Long en kan gemakkelijk worden aangepast om een gelijke afgifte van een agens aan de bilaterale hoofdstam bronchiën te waarborgen. Door gebruik te maken van de IB-toediening om grotere doses experimentele agentia te leveren aan de grotere rechter long en kleinere volumes naar de kleinere linker long (d.w.z. een dosis gecorrigeerde IB-toediening), wordt in dit rapport aangetoond dat het een verbetering is van de homogeniteit van pulmonale levering van experimentele agenten, het optimaliseren van het model van diffuse long letsel bij muizen. Als zodanig kan dit verslag waarde hebben voor onderzoekers die proberen om de experimentele agentia eenzijdig toe te dienen aan muizen of om de symmetrie van de afzetting van het geneesmiddel in beide longen te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier protocollen zijn goedgekeurd door de University of Colorado Denver Institutional Animal Care and use Committee (IACUC). Alle hieronder beschreven procedures (paragrafen 4 – 7) zijn geoptimaliseerd met zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL/6 muizen. Deze aanpak is gevalideerd met muizen variërend van 19 – 40 g in lichaamsgewicht.
1. creatie van platform voor IB administratie
- Buig de Boekensteun van de originele 90 ° hoek tussen de basale vleugel en de staande vleugel tot 70 ° (Figuur 2a).
- Boor een gat in het midden-bovenzijde van de staande vleugel van de metalen Boekensteun (Figuur 2a).
- Boor een gat van identieke grootte op de corresponderende positie van het plastic bord. Boor twee kleinere gaten ondeugdelijkheid en lateraal (Figuur 2a).
- Drapeer een 4:0 zijde hecht tussen deze kleine gaatjes in de kunststof plaat (Figuur 2a).
- Plaats de klittenband op de rand van de kunststof plaat (Figuur 2a).
- Monteer de kunststof plaat op de metalen Boekensteun met de schroef (Figuur 2b). Zorg ervoor dat de schroef moer voldoende strak is om het board in positie te houden, maar indien nodig om de hoek te kunnen afstellen.
- Zorg ervoor dat de rotatie van het plastic bord rechtsom en linksom beweegt, vrij bewegen.
Opmerking: rechtsom beweging wordt in dit rapport weergegeven als een (+) graden rotatie, en linksom wordt weergegeven als een (-) graden rotatie. - Gebruik een hoek gradenboog om het plastic bord te positioneren op + 30 °, + 86 °,-30 ° en-74 ° en markeer ze respectievelijk op de Boekensteun.
2. creatie van uitgebreide katheters voor de toediening van IB-agenten
- Maak een rechte hoek snede met een scherp mes op de punt van een originele katheter van 22 G (25 mm, Zie tabel met materialen) (Figuur 3, stap 1a).
- Schuine kant (~ 50 ° – 60 °) de punt van de andere oorspronkelijke katheter (25 mm) met het mes, vervolgens afgesneden in rechte hoek van de hub (Figuur 3, stap 1b).
- Lijm de twee katheters aan hun stompe uiteinden met een iets minder dan 180 ° hoek (Figuur 3, stap 2).
- Bot de schuine punt door te smelten met een lage temperatuur cauterie (Zie tabel van de materialen).
- Polijsten de verlengde katheter met "0" grootte schuurpapier op het gelijmde gebied en de schuine punt van de verlengde katheter (Figuur 3, stap 3).
- Markeer op de verlengde katheter met verschillende kleuren op 25 mm, 30 mm en 35 mm (Figuur 3, stap 3).
- Geef de schuine zijde van de verlengde katheter aan door de hub met marker te labelen.
- Spoel de verlengde katheter met DI water, na door het spoelen van de binnenkant van de katheter met 70% ethanol. Airdry de katheter.
- Steriliseren met UV-licht gedurende 10 minuten voor gebruik.
3. voorbereiding voorafgaand aan de procedure
- Maak alle toegediende stoffen in een biologische veiligheids motorkap onder steriele techniek.
- Reinig de werkplek met 70% ethanol.
- Steriliseer alle chirurgische gereedschappen met 70% ethanol.
- Bevestig de basis van het werkplatform aan de bank direct voor de onderzoeker door het aanbrengen van C-klemmen op de basale vleugel van de Boekensteun.
- Genereer verschillende geïmproviseerde spirometers, die apparaten zijn die het mogelijk maken de getijden luchtstroom bij muizen te detecteren. In het kort, deponeren 60 μL gesteriliseerde zoutoplossing in een 1 mL spuit (zuiger verwijderd) met een gel laadpunt.
Opmerking: de gestorte druppel zoutoplossing occludeert het vat en beweegt naar boven en naar beneden bij blootstelling aan getijden ventilatie3. - Bevestig losjes de naaf van een 22 G verlengde katheter aan de geïmproviseerde spirometer.
- Plaats elk van de glazen druppel pers aan elke kant van het platform voor gemakkelijke toegang.
- Verbind de Isofluraan inductie kamer met de knaagdieren anesthesie machine (Zie tabel van de materialen) in een Isofluraan-compatibele biologische veiligheidskast.
4. niet-operatieve IT-intubatie benadering
- Anesthetiseer een C57BL/6 muis (mannelijk of vrouwelijk, 8 – 10 weken, ~ 25 g) met zuurstof (2 L/min) en 5% Isofluraan (Zie tabel van materialen) in een inductie kamer voor 4 min.
- Aspirate het experimentele middel dat moet worden afgeleverd (bijvoorbeeld Evans Blue Dye of FITC-dextran, zoals aangetoond in Figuur 4) in twee pipetten, en plaats ze vervolgens aan elke kant van het platform tijdens sedatie.
- Zorg voor een ademhalingsfrequentie van ongeveer 24 – 30 ademhalingen/min voordat u de muis uit de anesthesie-inductie kamer verwijdert.
Opmerking: Isoflurane anesthesie duurt meestal 4 minuten, voldoende voor alle IB-procedures. Als de operator niet bekwaam is met de techniek, kan ketamine/xylazine (80 mg/kg en 10 mg/kg intraperitoneaal, Zie tabel van de materialen) worden gebruikt voor meer langdurige anesthesie. - Onderbreek de muis door de snijtanden op de gedrapeerde hecht lijn in rugligging. Beveilig de muis met twee tot drie stukken haak en loop de tape losjes en Vermijd de beperking van ventilatie.
- Zet de LED Fiber Optic illuminator aan (Zie tabel met materialen, figuur 2c).
- Plaats de operator achter het platform (dorsaal aan de muis).
- Oriënteer de zwanenhals van de verlichter zodat deze het strottenhoofd gebied door de huid verlicht. De afstand tussen de muis en de lichtbron is 2 – 3 cm (figuur 2c).
- Bevestig de diepte van de anesthesie met een teen/paw pinch voordat u alle onderstaande procedures uitvoert.
- Houd de steriele Tang vast met de dominante hand en trek de tong uit de mondholte met de Tang.
- Houd de steriele depressor met de niet-dominante hand, dan afvlakken van de wortel van de tong met de depressor om de orofarynx op grote schaal bloot. De Tang kan dan worden losgelaten, waardoor de dominante hand vrijkomt.
- Gebruik de dominante hand om de verlengde katheter via de mondholte in de luchtpijp te intuberen (figuur 2c).
- Bevestig de plaatsing door te observeren of de bubbel in de spuit met elke adem op en neer beweegt.
- Aanvullende details van IT-intubatie zijn eerder gepubliceerd3. Totale procedure tijd, met uitzondering van anesthesie, duurt 10 – 15 s voor een goed opgeleide operator.
5. niet-operatieve IB intubatie-en leverings benaderingen
- IB-benadering van selectieve lobar-cannulatie van de distale rechter long
- Na het uitvoeren van het infusen (stap 4,11), draai het plastic bord + 30 ° (Fig. 4a).
- Houd de naaf van de katheter vast en leid deze op natuurlijke wijze parallel met de middenlijn van de muis, en strek deze uit tot op gewicht gebaseerde diepten zoals beschreven in tabel 1.
Opmerking: de weerstand op deze diepten moet worden genoteerd. Op dit punt, de muis zal enigszins tachypneic worden, zoals uitgelegd in de representatieve resultaten. Voor een ervaren operator zal ongeveer 90% van de pogingen de rechter Long met succes cannuleren (met tachypneu genoteerd). - Lever 20 μL 0,3% Evans Blue Dye (EBD, Zie tabel met materialen) met een gel loading tip.
- Verdeel 1 – 2 aliquots (elk 0,1 mL) van de lucht met behulp van de glas druppelaar.
Opmerking: Dit zorgt voor de klaring van de resterende EBD-oplossing (of experimentele middelen) van binnenuit van de katheter. - Trek de katheter in en houd vervolgens de muis stand voor 30 sec.
- Leg het dier op een verwarmende deken totdat het bewustzijn herwint. Herstel is meestal voltooid binnen 2 minuten.
- IB benadering van selectieve segmentale cannulatie van de distale linker long
- Na het uitvoeren van de cannulatie (stap 4,11), draai het plastic bord-74 ° (figuur 4b).
- Houd de naaf van de katheter vast en breng zachte druk aan om de katheter in de linker mainstam bronchus te brengen, terwijl de bescheiden druk zowel naar beneden (90 °) als naar de Boekensteun wordt gebracht. Op dieptes vermeld in tabel 1moet de operator de weerstand opmerken, aangezien de onderste segmenten van de linker long zijn ingeschakeld. Als tachypneu optreedt, trekt u de katheter in op de positie van 20 – 25 mm en probeert u opnieuw.
- Na het cannuleren van de linker onderste Long segmenten is een verandering in positie vereist om zwaartekracht assistentie toe te staan voor agent administratie. Draai de kunststof plaat-30 ° (figuur 4b).
- Lever 40 μL 0,3% EBD met een gel-laadpunt.
Opmerking: het is mogelijk om een groter volume van de agent te leveren, omdat de linker long slechts één LOB heeft. - Verdeel 1 – 2 aliquots (0,1 – 0,3 mL elk) van de lucht met behulp van de glas druppel pers.
Let op: Dit zorgt voor de klaring van eventuele resterende EBD (of experimentele agenten) van binnenuit van de katheter. - Trek de katheter in en houd vervolgens de muis stand voor 30 sec.
- Leg het dier op een verwarmende deken totdat het bewustzijn herwint. Herstel is meestal voltooid binnen 2 minuten.
- Aanpassing van de IB-administratie om de levering van een agent volledig van linker-of rechter longen mogelijk te maken
Opmerking: als de operator streeft naar het leveren van agenten niet aan een specifieke rechter long kwal of linker long segment, maar in plaats van de hele Long (rechts of linker long), de katheter moet enigszins worden teruggetrokken om de respectieve hoofdstam bronchiën, als volgt.-
Juiste volledige Long toediening
- Draai na stap 4,11 het plastic bord + 30 ° (figuur 5a).
- Houd de naaf van de katheter en leid deze natuurlijk parallel aan de middenlijn van de muis, en bereik deze tot diepten die nodig zijn voor de rechter zijdige distale lobar-cannulatie (tabel 1).
- Bevestig het uiterlijk van het tachypneu-teken.
- Draai de muis-74 ° om zwaartekracht assistentie voor de levering van agenten in te schakelen (Figuur 5b).
- Zuig de katheter op in een positie die overeenkomt met het opstijgen van de rechteronderstam bronchus (tabel 1). Zorg ervoor dat de schuine kant van de katheter naar beneden gericht is (Figuur 5b).
- Lever 30 μL 0,3% EBD met een gel loading tip aan de juiste Long.
- Verdeel 1 – 2 aliquots (0,1 – 0,3 mL elk) van de lucht met behulp van een glas druppelaar.
- Trek de katheter in en houd de muis stand gedurende 30 sec. plaats het dier op een verwarmende deken totdat het bewustzijn herwint. Herstel is meestal voltooid binnen 2 minuten.
-
Volledige Long toediening links
- Draai na stap 4,11 de plastic plaat-74 ° (Figuur 6a). Als alternatief kan rotatie optreden na stap 5.3.1.8 door de katheter terug te trekken naar de luchtpijp, wat de bilaterale toediening van IB-agenten mogelijk maakt.
- Houd de naaf van de katheter vast en breng zachte druk aan om de katheter in de linker mainstuurkath eter te brengen, terwijl de bescheiden druk zowel naar beneden (90 °) als naar de Boekensteun wordt gebracht. De diepte van de Intubatie wordt geleid door tabel 1.
- Bevestig het no tachypneu teken.
- Draai de muis + 86 ° om zwaartekracht hulp met agent administratie mogelijk te maken.
- Trek de katheter aan de linker mainstam bronchus (dezelfde afstanden als de rechter long voldoende zijn, tabel 1) en draai de schuine kant van de katheter naar beneden (Figuur 6b).
- Lever 30 μL 0,3% EBD met een gel-laadpunt naar de linker long.
- Verdeel 1 – 2 aliquots (0,1 – 0,3 mL elk) van de lucht met behulp van een glas druppelaar.
- Trek de katheter in en houd de muis stand gedurende 30 sec. plaats het dier op een verwarmende deken totdat het bewustzijn herwint. Herstel is meestal voltooid binnen 2 minuten.
-
Juiste volledige Long toediening
6. gebruik van sequentiële IB-cannulatie benaderingen voor het leveren van dosis gecorrigeerde hoeveelheden agent aan elke Long
-
IT-beheergroep
- Voer de cannulatie uit zoals beschreven in stap 4.1 – 4.11.
- Lever 60 μL 0,05% FITC-dextran (Zie tabel met materialen) met een gel-laadpunt (Figuur 1b).
- Verdeel 1 – 2 aliquots (0,1 – 0,3 mL elk) van de lucht met behulp van de glas druppel pers.
- Houd de positie voor 60 s en toestaan voor muis herstel zoals hierboven beschreven.
-
Symmetrische bilaterale IB-administratie
- Voer stappen 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (rechter long) en stappen 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (linker long) uit.
- Dien gelijke volumes (30 μL) van 0,05% FITC-dextran (of een experimenteel middel) toe aan elke zijde van de longen.
-
Dosis-gecorrigeerde bilaterale IB-toediening
- Voer stap 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (rechter long) en stappen 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (linker long).
- Dien een groter volume (40 μL) van 0,05% FITC-dextran toe aan de grotere rechter long, en een kleiner volume (20 μL) van 0,05% FITC-dextran aan de kleinere linker long. In plaats van FITC-dextran kan een experimenteel agens worden toegediend.
7. gebruik van een dosis gecorrigeerde IB-toediening ter verbetering van de symmetrie van de enkelvoudige dosis bleomycine (BLM)-geïnduceerde long letsel
-
BLM-beheergroepen
- Dosis-gecorrigeerde IB-BLM (1,2 mg/kg, Zie Inhoudsopgave) toedienings groep: 60 μl (20 μl voor de linker long en 40 μl voor de rechter long) van blm-oplossing werden bij muizen afgeleverd (n = 5). Besturingselementen (n = 5) ontvangen vergelijkbare volumes zoutoplossing.
Opmerking: Zie de stappen 5.3.1 en 5.3.2. - IT-administratie groep: 60 μL BLM-oplossing werd geleverd aan muizen met IT-beheertechnieken.
Opmerking: Zie de stappen 6.1.1 – 6.1.4.
- Dosis-gecorrigeerde IB-BLM (1,2 mg/kg, Zie Inhoudsopgave) toedienings groep: 60 μl (20 μl voor de linker long en 40 μl voor de rechter long) van blm-oplossing werden bij muizen afgeleverd (n = 5). Besturingselementen (n = 5) ontvangen vergelijkbare volumes zoutoplossing.
-
Longfunctie meting
- Op dag 21 na BLM of zoutoplossing, anesthetiseer muizen met een intraperitoneale (IP) injectie van ketamine (160 mg/kg) en xylazine (32 mg/kg).
- Na bevestiging van de diepte van de anesthesie door paw/teen pinch, voer een tracheostomie met een 18 G canule (Zie tabel van de materialen).
- Verbind muizen met de ventilator en meet de Ademhalings mechanica zoals eerder beschreven4.
-
Longweefsel inzameling en-verwerking
- Na het meten van de pulmonaire mechanica, euthanruseer de verdoofde muizen door cardiale punctie.
- Open de borstwand en induceren bilaterale pneumothoraces.
- Blaas de longen op met 1% laag smelt agarose (40 °C)5 in PBS met een constante druk (42 cm H2O).
- Snijd vier tot vijf stukjes van de longen langs de lange as dwars, fixeer in 10% formaline, en insluiten in paraffine.
- Snijd 5 μm secties en beits met de trichrome van Masson om de depositie van collageen te visualiseren.
8 post-procedurele zorg
- Aan het einde van de overlevings procedures, plaats het dier op een verwarmende deken totdat het bewustzijn herwint. Herstel is meestal voltooid binnen 2 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Selectieve IB-intubatie richt zich op specifieke lobben (rechter long) of basilaire segmenten (linker long).
IB toediening van EBD naar de juiste Long werd uitgevoerd zoals beschreven in paragraaf 5,1. Na afloop van het experiment werden muizen een dodelijke dosis intraperitoneale ketamine/xylazine toegediend, en longen werden geoogst voor demonstratie van EBD-verdeling (figuur 4a, rechts). Het bruto-uiterlijk van de longen toont aan dat 90% van de pogingen de kleine posterieure kwab van de rechter long heeft gecanuleerd, terwijl 10% van de pogingen gericht was op de inferieure LOB. Er wordt gespecerd dat de kleine volumes van deze lobben verklaren de compenserende tachypneu van de muis tijdens distale cannulatie (om minuten ventilatie door de katheter te houden).
IB toediening van EBD aan de linker long werd uitgevoerd zoals beschreven in paragraaf 5,2. 100% van de pogingen is gericht op de inferieure segmenten van de linker long (figuur 4b). In tegenstelling tot de rechts-zijdige intubatie, treedt er geen tachypneu op bij deze betrokkenheid, die de intubatie (en ventilatie) van de grotere linker long segmenten reflecteert.
Aanpassing van de selectieve IB-cannulatie techniek kan gericht zijn op de gehele linker-of rechter long.
Zodra IB-cannulatie wordt uitgevoerd, kan het intrekken van de IB-katheter (en veranderingen in de muis positionering, zoals beschreven in paragraaf 5,3) worden gebruikt om de afgifte van agenten aan alle lobben van de rechter Long (en alle segmenten van de linker long) te verbeteren. Instillatie van de EBD-oplossing aan de rechter Long (punt 5.3.1) richtte zich met succes alle juiste lobben op, zoals aangetoond in figuur 5c. Instillatie van de EBD-oplossing naar de linker long (punt 5.3.2) getarget alle linker segmenten (figuur 6C).
It-administratie of symmetrische IB-toediening levert asymmetrische Long parenchymale agent concentraties, die kunnen worden gecorrigeerd door IB dosisaanpassing.
Muizen onderging een bilaterale toediening van 30 μL 0,05% FITC-dextran naar de linker long en 30 μL 0,05% FITC-dextran naar de rechter long, zoals beschreven in punt 6,2. Als alternatief kregen muizen 60 μL 0,05% FITC-dextran intratracheally als per sectie 6,1. Aan het einde van het experiment werden muizen geëeuthanaliseerd via terminale anesthesie overdosis (ketamine/xylazine). De longen werden onmiddellijk geoogst en gehomogeniseerd. FITC-fluorescentie (gekwantificeerd door optische dichtheid) werd gemeten met 96-well plate Reader. De datum werd geanalyseerd met de student t-toets voor vergelijkingen met twee groepen.
Zoals beschreven in Figuur 7, LEIDDEN zowel IT (figuur 7A) als symmetrische IB-toediening (figuur 7b) van FITC-dextran tot asymmetrische longparenchymale FITC-fluorescentie, met grotere relatieve concentraties (genormaliseerd naar gewicht) genoteerd in de linker long. Dit suggereert dat asymmetrische Long afgifte van experimentele agentia na de IT-toediening niet het gevolg is van een asymmetrische presentatie van deze agentia op elke mainstam bronchus. Integendeel, het was veronderstelde dat gelijke hoofdstam levering (zoals verzekerd door symmetrische IB administratie) werd verdund door verschillen in Long gewichten/massa, zoals waargenomen in tabel 2.
Om deze verschillen in symmetrische levering te overwinnen, werd 40 μL van 0,05% FITC-dextran toegediend aan de grotere rechter long en 20 μL naar de kleinere linker long, zoals per sectie 6,3. Deze "dosis-gecorrigeerde IB-toediening" verbeterde de symmetrie van de aflevering van de Long parenchymale agent (figuur 8a). Ondanks deze correctie hebben we echter aanhoudende heterogeniteit waargenomen binnen verschillende lobben van de rechter Long (figuur 8b).
BLM-geïnduceerde long letsel in verschillende toedieningssystemen:
Om aan te tonen dat dosis-gecorrigeerde IB-toediening van experimentele agentia de modellering van diffuse longziekte kan verbeteren, hebben we BLM (een muismodel van fibroserende long letsel) toegediend ofwel intratracheally of via een dosis-gecorrigeerde IB-toediening, zoals per sectie 7. zoals verwacht met dit model van letsel leidden zowel IT-als IB-injecties van BLM tot long letsel en systemische ziekte (met gewichtsverlies). Deze systemische ziekte verdwenen in 7 dagen. de 21-daagse sterfte bedroeg 20% (1/5) in de IT-groep en 0% (0/5) in de dosis-gecorrigeerde IB-Groep.
21 dagen na toediening-of IB-BLM Administration, werden muizen geoogst voor Long histologie. Zoals aangetoond in representatieve histologische beelden (figuur 9a),
Om te bepalen of deze verbetering van de linker-rechts homogeniteit van fibrotische long letsel fysiologisch relevant is, werd geconstateerd dat de toediening van een dosis-gecorrigeerde IB van BLM een consistenter verlies van Inspiratoire capaciteit (IC) en respiratoire systeem compliance (CRS), evenals een overeenstemmende toename van het ademhalingssysteem (ers) (figuur 9b).
Figuur 1: Anatomie van de muis luchtweg cannulatie. A) een muis luchtwegen cast werd gemaakt door het opblazen van een muis Long (geoogst van een 25 g muis) met silicium elastomeer. B) plaatsing van de katheter voor standaard it-administratie. C) katheter plaatsing voor IB-toediening. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 2: instellen voor het werkplatform. A) een metalen Boekensteun (90 ° hoek) is gebogen tot 70 °. Een schroefgat wordt in de bovenste middenlijn geplaatst om een beweegbaar (80 mm x 150 mm) te verankeren. Klittenband en een schorsing hechtdraad geplaatst om positionering van een verdoofd muis op het bord toe te staan. B) het kunststof karton is verankerd met een schroef op de metalen Boekensteun. De schroef is voldoende los om rotatie van het bord in een rechtsom (+) of linksom (-) richting mogelijk te maken. (C) een verdovingde muis wordt gepositioneerd met klittenband (0,75 "W) voor IT/IB agent Administration. Een hechtdraad wordt doorgegeven onder de muis snijtanden om hoofd stabilisatie mogelijk te maken. De operator is gepositioneerd op het rugdeel van de muis, en de nek wordt verlicht via een zwanenhals lamp. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: creatie van aangepaste katheters voor IB-toediening. (Stap 1) Om een voldoende katheter lengte in te schakelen om de hoofdstam bronchiën te betrekken, worden twee katheters gecombineerd. (Stap 2) Katheters worden in een lichte hoek aangesloten, waardoor selectieve intubatie aan de hoofdstam bronchiën wordt vergemakkelijkt. (Stap 3) Bovendien is de distale katheter Tip afgeschuurd, waardoor een betere directionele controle van de luchtweg instillatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: aanpak voor selectieve rechter/linker long lobar cannulatie en toediening. (A) om de juiste Long te targeten, wordt het plastic bord gedraaid + 30 °, waardoor het gemak van selectief betrekken van de juiste hoofdstam bronchus wordt verbeterd. De katheter is gevorderd (per afstanden voorgesteld in tabel 1) om selectief te schakelen rechts zijdige lobben. 20 μL van 0,3% EBD werd toegediend. In ~ 90% van de pogingen, de achterste kwab is cannulated. De resterende 10% van de pogingen betrekken de inferieure kwal. (B) om de linker long te targeten, wordt het plastic bord voor het eerst geroteerd-74 ° voor links hoofdstam engagement. Na succesvolle intubatie van de katheter, wordt de rotatie verlaagd tot-30 °, zodat de zwaartekracht kan helpen bij het afleveren van de agent. Om selectieve betrokkenheid van de linkerzijde te bewijzen, werd 40 μL van 0,3% EBD afgeleverd. Deze aanpak consequent (100% van de pogingen) gericht linker long basilaire segmenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: symmetrische toedienings benadering om agenten eenzijdig aan de gehele rechter long te leveren. A) de IB-intubatie aan de rechterkant werd uitgevoerd op + 30 °, identiek aan de selectieve Long lobar-cannulatie (figuur 4a). (B) de plastic plaat werd vervolgens gedraaid naar-74 ° om zwaartekracht bij de toediening van de agent mogelijk te maken. De tip van de katheter wordt vervolgens teruggetrokken tot dieptes die gedetailleerd zijn in tabel 1, overeenkomend met de rechter stam van bronchus. De schuine kant van de punt wordt neerwaarts geplaatst door de katheter naaf te draaien. C) 30 ΜL EBD werd geleverd bij-74 °, wat een diffuse rechter long toediening van EBD aantoont. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Symmetrische beheer benadering voor het eenzijdig toedienen van agenten aan de gehele linker long . A) de links-zijdige IB-intubatie werd uitgevoerd bij-74 °, identiek aan de selectieve Long lobar-cannulatie (figuur 4b). B) na een geslaagde intubatie werd de plastic plaat vervolgens gedraaid + 86 ° om zwaartekracht ondersteuning tijdens de toediening van de agent mogelijk te maken. De tip van de katheter wordt vervolgens op diepte in tabel 1opgenomen. De schuine kant van de punt wordt naar beneden verschoven door de katheter naaf te draaien. C) 30 ΜL EBD werd geleverd met een gel-laadpunt, wat een diffuse linker long toediening van EBD aantoont. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: it-toediening van experimentele agentia wordt evenzeer afgeleverd aan mainstam Bronchi, maar leidt tot verschillende longparenchymale concentraties. A) de it-administratie van 0,05% FITC-dextran (60 μL) heeft een hogere fluorescentie in de linker long, wat duidt op ongelijke Long concentraties van het geleverde agens. B) deze ongelijke Long parenchymale fluorescentie blijft bestaan, zelfs wanneer gelijke volumes van 0,05% FITC-dextran (30 μL) worden toegediend aan elke hoofdstam bronchus. Deze aanhoudende parenchymale onbalans, ondanks gelijke rechts/linker hoofdstam levering, suggereert dat verschillen in Long agent concentraties de verdunning in de grotere rechter long weerspiegelen (n = 10 per groep). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: verbeterde homogeniteit van de depositie van de agent door middel van een dosis gecorrigeerd IB toediening. A) asymmetrie van de Long parenchymale afgifte wordt verbeterd wanneer een groter deel van het agens (40 μL van 0,05% FITC-dextran) wordt toegediend aan de grotere rechter long en een kleiner deel van het agens (20 μL 0,05% FITC-dextran) naar de kleinere linker long. B) Ondanks deze verbeterde symmetrie in de linker-rechterkant blijft de lobar heterogeniteit van de depositie van de agent (zwart: superieure kwab; geel: middelste kwab; blauw: inferieure kwab; groen: achterste kwab; rood: linker long). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: verbetering van het door muizen met BLM geïnduceerde longfibrose-model met behulp van een dosis gecorrigeerde IB-toediening. A) de IT-toediening van blm (1,2 mg/kg in 60 μL oplossing) induceert de overheersende long letsel/fibrose aan de linkerzijde 21 dagen later, in overeenstemming met hogere Long concentraties van agent in deze kleinere Long. De symmetrie in de linker-en rechterkant verbetert door het volume van BLM aan elke zijde van de longen aan te passen: 40 μL van de oplossing wordt toegediend aan de grotere rechter long en 20 μL van de oplossing wordt toegediend aan de kleinere linker long. I: inferieure kwab, M: middelste kwab, S: superieure kwab, P: posterieure kwab. Afbeeldingen vertegenwoordigen lobben van een enkele, representatieve muis. B) in overeenstemming met een verbeterde symmetrie van de verdeling, verbetert de dosis-gecorrigeerde IB-toediening van blm de fysiologische modellering van longfibrose, met meer representatieve verhogingen van de Inspiratoire capaciteit (IC) en dynamische respiratoire systeem compliance (CRS). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Lichaamsgewicht (g) | Aantal geteste muizen | Diepte van de katheter (mm) voor selectieve cannulatie |
Diepte van de katheter (mm) voor gehele Long cannulatie | |
| Rechter long | Linker long | |||
| 15 - 19 | 17 | 37 | 38 | 26 |
| 20 - 25 | 22 | 38 | 39 | 27 |
| 25 - 30 | 29 | 39 | 40 | 28 |
| > 30 | 11 | 40 | 41 | 31 |
Tabel 1: voorgestelde diepte van de katheter inbrengen. Voorspelde diepte van de katheter nodig om selectief te cannuleren de distale en proximale longen werden empirisch bepaald met behulp van C57BL/6 muizen van verschillende gewichten (totaal = 79 muizen).
| Lichaamsgewicht (g) | Aantal geteste muizen | Verhouding van de Long gewichten |
| 14 - 10 | 25 | 2,01 ± 0,16 |
| 20 - 25 | 35 | 1,88 ± 0,27 |
| 25 - 30 | 15 | 1,88 ± 0,27 |
| > 30 | 6 | 2,03 ± 0,09 |
Tabel 2: rechts: linker long weight ratio. Verschillen in Long gewichten waargenomen bij 81 C57BL/6 muizen tonen de beweegredenen voor een gecorrigeerde behandeling met IB-geneesmiddelen. De longen werden ontleed en gewogen na een dodelijke dosis ketamine en xylazine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Long letsel is klassiek gemodelleerd in knaagdieren met behulp van de IT-administratie van schadeveroorzakende agenten zoals BLM6. Een dergelijke IT-administratie leidt echter alleen tot fragmentarisch letsel, dat de nontargeted aard van de Long levering weerspiegelt met deze aanpak7. Deze beperkingen van het modelleren van long letsel zijn leerzame uitdagingen bij het proberen van de IT-levering van niet-schadelijke experimentele agenten, zoals drugs, siRNA of cellulaire therapieën.
In dit verslag beschrijven we de directe IB-administratie van experimentele agenten. Deze aanpak biedt twee verschillende voordelen ten opzichte van klassieke benaderingen voor IT-beheer. Ten eerste, de aanpak maakt selectieve unilaterale toediening aan één Long mogelijk, waardoor de contralaterale Long kan worden gesparend. Deze aanpak is nuttig voor de selectieve toediening van geneesmiddelen in een eenzijdig gewonde Long (bijvoorbeeld ischemie-reperfusie letsel8), waarbij niet-specifieke effecten in de ongewonde Long worden vermeden. Bovendien, gerichte toediening van tumorcellen kan worden gebruikt om te onderscheiden van primaire tumorgroei van contralaterale, gemetastaseerde verspreiding9,10.
Ten tweede wordt in het verslag een eerder niet-erkend voordeel van de administratie van IB genoemd. Zoals beschreven in figuur 7Aconcentreert de it-administratie zich relatief op experimentele agentia binnen de kleinere linker long. Deze asymmetrie kan worden gecorrigeerd door het toedienen van een relatief groter volume van de agent aan de grotere rechter Long (tabel 2), terwijl het leveren van een kleiner volume aan de kleinere linker long (figuur 8a). De relevantie van deze dosis-gecorrigeerde IB-toediening aan BLM-geïnduceerde fibrotische long letsel werd hier aangetoond. Dosisaanpassing vermindert de verwonding aan de linker long (die minder BLM kreeg), terwijl de verwonding aan de rechter long werd vergroot (figuur 9a). Deze toegenomen symmetrie valt samen met een verminderde variabiliteit van long letsel, zoals gekwantificeerd door metingen van de longfunctie (figuur 9b).
Er zijn verschillende kritische stappen in het Protocol, waaronder de noodzaak om een stand te hebben die gemakkelijk en herhaaldelijk de positionering van dieren kan veranderen (d.w.z. rotatie). Kritischer is het vermogen om te bepalen wanneer selectieve Long cannulatie is bereikt. Zoals beschreven in punt 4,12 zorgt het gebruik van een spirometer (waarbij een waterkolom de getijden ventilatie aantoont) voor een geslaagde tracheale cannulatie3. Observatie van de muis tachypneu is consistent met distale rechter long segment cannulatie, terwijl de afwezigheid van dyspneu (ondanks gevoel weerstand met katheter inbrengen) voorgesteld cannulatie van de linker long. Met behulp van deze niet-operatieve lokalisatie technieken moet de exploitant in staat zijn om IB-cannulatie en experimentele agent afzetting nauwkeurig te begeleiden.
Deze aanpak kent verschillende beperkingen. Het IT-model van agent Delivery is aantrekkelijk in zijn eenvoud. Het vereist een matige mate van oefening en technische vaardigheid, hoewel een bekwame operator deze techniek nog steeds snel kan uitvoeren binnen het raam van Isofluraan anesthesie. De aanvullende technische vaardigheid/praktijk die vereist is, kan echter gemakkelijk worden gecompenseerd door het voordeel van deze aanpak in experimenten die prioriteit geven aan selectieve agent/siRNA/cel levering of een verhoogde homogeniteit van de depositie van de agent. Een extra beperking van deze methode is de onzekerheid over de lengte van de katheter inbrengen. Zoals beschreven in tabel 1werden 79 mannelijke en vrouwelijke muizen gemeten om de diepte van het inbrengen van de katheter te schatten die nodig is voor selectieve IB-cannulatie. Deze gegevens dienen als hulpmiddel om de operator te begeleiden om ons protocol uit te voeren. We kunnen onze middelen echter niet met vertrouwen extrapoleren naar andere muis stammen (waaronder knock-outmuizen) of morbide zwaarlijvige muizen. Daarnaast hebben we niet gemeten of er verschillen zijn in het luchtruim volume (lobar, segmental) dat varieert op basis van gewicht. Daarom is het mogelijk dat grote muizen mogelijk grotere instillatie volumes met IB-toediening kunnen opvangen. De exploitant moet dus een initiële optimalisatie/probleemoplossings stap uitvoeren (met behulp van EBD instillatie) om ervoor te zorgen dat onze techniek goed is aangepast aan het gewenste muismodel.
Samenvattend wordt in dit verslag een nieuwe IB-techniek beschreven die kan worden gebruikt voor het selectief toedienen van experimentele agentia op een enkele Long of aangepast om een symmetrische verdeling in beide longen te garanderen. Deze voordelen rechtvaardigen de marginale toename van de complexiteit in vergelijking met standaard IT-technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NHLBI Grant HL125371 to E.P.S. en door DOD (CDMRP) Grant W81XWH-17-1-0051 tot Y.Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G shielded IV Catheter | BD | 381423 | |
| Bleomycin | Enzo life sciences | BML-AP302-0010 | |
| Compact Mini rodent anesthesia machine | DRE Veterinary | 9280 | |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC | |
| LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-30W | |
| Low temperature cautery with fine tip | Bovie | AA02 | |
| Precisionglide needle, 18G x 1" | BD | 305195 | Beveled tip, 12 mm in length |
| Xylazine | AKORN | NDC 59399-110-20 | |
| Zatamine | VetOne | NDC 13985-702-10 | Ketamine |
References
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106 (3), 984-987 (2009).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
- Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung. Laboratory Investigation. 71 (1), 149-153 (1994).
- Thrall, R. S., McCormick, J. R., Jack, R. M., McReynolds, R. A., Ward, P. A. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat: inhibition by indomethacin. American Journal of Pathology. 95 (1), 117-130 (1979).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), L379-L399 (2008).
- Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44 (8), e604-e613 (2016).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13 (6), 349-358 (2000).
