Summary
Внутритрачельное (ИТ) введение экспериментальных агентов у мышей часто приводит к асимметричным родам в легкие. В этом докладе мы описываем прямой внутрибронхиальный (IB) подход к канюляции каждого легкого у живых мышей неоперативно. Этот подход может быть использован для выборочного введения агентов в одно легкое или могут быть адаптированы для улучшения симметричной доставки агента в обоих легких.
Abstract
Внутритрачеционное (ИТ) администрирование экспериментальных агентов является важным методом в моделях диффузных заболеваний легких, таких как блеомицин-индуцированный легочный фиброз. Тем не менее, распределение внутричешно управляемых агентов в дистальное легкое мыши часто асимметрично, с легкими паранхимальными концентрациями, увеличенными в меньшем (но в равной степени доступном) левом легком мыши. Описанный в настоящем докладе является новым внутрибронхиальным (IB) подходом к канюляции левого и/или правого легких живых мышей неоперативно. Также показано, как этот подход может быть использован для выборочного администрирования агентов в одно легкое или адаптированы (через дозу скорректированной доставки IB) для улучшения лево-правой симметрии легких доставки экспериментальных агентов, тем самым улучшая модели диффузных заболевания легких, такие как блеомицин-индуцированный легочный фиброз.
Introduction
Прямое легочочное введение экспериментальных агентов у мышей позволяет изучать иммунные реакции легких, острую травму легких и фиброз легких. Прямое легочочное введение обычно осуществляется через интрахельное (ИТ) зависление, как описано ранее 1,2,3. Однако этот подход является неселективным, затрагивая оба легких нецелевым и часто асимметричным образом. Экспериментальное моделирование травмы легких может извлечь выгоду из способности избирательно целевой одного конкретного легкого, что позволяет использовать контралатеральные легких в качестве контроля. И наоборот, точное моделирование заболеваний легких человека приносит пользу от симметричного распределения экспериментальных агентов на двустороннюю пуэнхиму легких.
Общая цель настоящего доклада заключается в описании метода выборочной доставки экспериментальных агентов в левое или правое легкое мыши(рисунок 1). Такой внутрибронхиальный (IB) административный подход позволяет одностороннее лечение легких мыши и может быть легко адаптирован для обеспечения равной доставки агента в двусторонний основной бронхов. С помощью администрации IB для доставки больших доз экспериментальных агентов в более крупные правые легкие и меньшие объемы в меньшее левое легкое (т.е. скорректированная на дозу администрация IB), продемонстрировано в настоящем докладе, является улучшение однородности легочной доставка экспериментальных агентов, оптимизация модели диффузной травмы легких у мышей. Таким образом, этот доклад может иметь значение для исследователей, стремящихся либо в одностороннем порядке управлять экспериментальных агентов для мышей или улучшить симметрию осаждения наркотиков в обоих легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы животных были одобрены Университетом Колорадо Денвер институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC). Все процедуры, описанные ниже (разделы 4-7), были оптимизированы с использованием как мужских, так и женских мышей C57BL/6. Этот подход был подтвержден с использованием мышей, начиная от 19-40 г в весе тела.
1. Создание платформы для администрирования IB
- Согните bookend от первоначально угла 90 'между базальным крылом и стоящим крылом до 70»(рисунок 2A).
- Просверлите отверстие в центральной верхней части стоящего крыла металлического букенда(рисунок 2A).
- Просверлите отверстие одинакового размера в соответствующем положении пластиковой доски. Просверлите два небольших отверстия неполноценно и спотерально(рисунок 2A).
- Drape 4:0 шелковый шов между этими небольшими отверстиями в пластиковой доске(Рисунок 2A).
- Поместите крючок и петлю ленты на краю пластиковой доски(рисунок 2A).
- Соберите пластиковую доску для металлического букенда с винтом(Рисунок 2B). Убедитесь, что винт-орех достаточно плотно держать доску в положении, обеспечивая при необходимости регулировку угла.
- Убедитесь, что вращение пластиковой доски по часовой стрелке и против часовой стрелки, свободно перемещаясь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Движение по часовой стрелке представлено в настоящем отчете в виде вращения градуса, а против часовой стрелки — в вращении (-) степени. - Используйте наклонный протрактор, чтобы расположить пластиковую доску на уровне 30, 86, -30 и -74 и пометить их на книжке, соответственно.
2. Создание расширенных катетеров для администрирования агентов IB
- Сделайте прямой угол вырезать с острым лезвием на кончике оригинального 22 G катетер (25 мм, см. Таблица материалов) (Рисунок3, шаг 1a).
- Бевел (50-60 евро) кончик другого оригинального катетера (25 мм) с лезвием, затем отрезается под прямым углом от коня(рисунок 3, шаг 1b).
- Клей два катетера на их тупые концы с чуть менее 180 "угол (Рисунок 3, шаг 2).
- Затухать смелый кончик, плавя с низкой температурой каутери (см. Таблицаматериалов).
- Польский расширенный катетер с наждачной бумагой "0" на клееной области и сбитому кончиком расширенного катетера(рисунок 3, шаг 3).
- Отметьте на удлинении катетера разного цвета на 25 мм, 30 мм и 35 мм(рисунок 3, шаг 3).
- Укажите скобелевую сторону расширенного катетера, пометив его концентратор маркером.
- Промыть расширенный катетер с di воды, после промывки внутри катетера с 70% этанола. Воздушный катетер.
- Стерилизовать с ультрафиолетовым светом в течение 10 минут перед использованием.
3. Предпроцедурная подготовка
- Сделайте все управляемые агенты в капюшоне биологической безопасности под стерильной техникой.
- Очистите рабочее место с 70% этанола.
- Стерилизовать все хирургические инструменты с 70% этанола.
- Закрепите основание рабочей платформы на скамейке непосредственно перед исследователем, прикрепив C-зажимы к базальному крылу книжного крыла.
- Создайте несколько самодельных спирометров, которые являются устройствами, которые позволят обнаружить приливный поток воздуха у мышей. Кратко, депозит 60 л стерилизованного солевого раствора в шприц 1 мл (плинтер удален) с наконечником погрузки геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отложенное падение сольника окклюзии баррель и движется вверх и вниз при воздействии приливной вентиляции3. - Свободно прикрепите концентратор 22 G расширенный катетер к импровизированному спирометру.
- Поместите каждый из стаканчиков с каждой стороны платформы для облегчения доступа.
- Соедините изофлюранскую индукционную камеру к аппарату анестезии грызунов (см. ТаблицаМатериалов) в изофруранском шкафе биологической безопасности.
4. Неоперативный подход к интубации ИТ
- Анестезия C57BL/6 мышь (мужчина или женщина, 8-10 недель, 25 г) с кислородом (2 л / мин) и 5% изофлуран (см. Таблица материалов) в индукционной камере в течение 4 мин.
- Прикрепляйте экспериментальный агент, который будет доставлен (например, синий краситель Evans или FITC-dextran, как показано на рисунке 4) в две пипетки, а затем поместите их в каждую сторону платформы во время седации.
- Убедитесь, что частота дыхания составляет примерно 24-30 вдохов/мин, прежде чем удалить мышь из индукционной камеры анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуранская анестезия обычно длится 4 мин, достаточная для всех процедур IB. Если оператор не владеет техникой, кетамин/ксилазин (80 мг/кг и 10 мг/кг интраперитоненалически, см. Таблица материалов)может быть использован для более длительной анестезии. - Приостановить мышь его резцы на драпированные шовлинии в положении лежа. Закрепите мышь двумя-тремя кусками крючка и свободно завязайте ленту, избегая ограничения вентиляции.
- Включите светодиодный волоконно-оптический иллюминатор (см. Таблица материалов, Рисунок 2C).
- Расположите оператора за платформой (спинс к мыши).
- Ориентируйте гусиную шею осветители так, чтобы он освещал область гортани через кожу. Расстояние между мышью и источником света составляет 2-3 см(рисунок 2C).
- Подтвердите глубину анестезии с ног / лапы щепотку перед выполнением всех процедур ниже.
- Держите стерильные щипчи с доминирующей рукой, а затем вытащить язык из полости рта с щипками.
- Держите стерильный депрессор с недоминирующей стороны, а затем сгладить корень языка с депрессором подвергать роофаинкс широко. Затем щипцы могут быть освобождены, освобождая доминирующую руку.
- Используйте доминирующую руку, чтобы интубировать расширенный катетер в трахею через полость рта (рисунок2C).
- Подтвердите размещение, наблюдая, если пузырь в шприц движется вверх и вниз с каждым вдохом.
- Дополнительные сведения об Интубации ИТ были опубликованы ранее3. Общее время процедуры, за исключением анестезии, длится 10-15 с для хорошо подготовленного оператора.
5. Неоперативные подходы к интубации и доставке IB
- ПОДХОД IB к селективной лобарной каннулации дистального правого легкого
- После выполнения ИТ-каниляции (шаг 4.11), поверните пластиковую доску(рисунок 4A).
- Держите концентратор катетера и направьте его естественным путем параллельно средней линии мыши, расширяя его до глубины, основанной на весе, как описано в таблице1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сопротивление на этих глубинах должно быть отмечено. В этот момент мышь станет слегка тахипнейной, как поясняется в репрезентативном результатах. Для опытного оператора, примерно 90% попыток будет успешно канюлязировать правое легкое (с тагипноной отметил). - Доставьте 20 л 0,3% Синий краситель Эванс (EBD, см. Таблица материалов) с гель загрузки отзыв.
- Распределите 1-2 aliquots (0,1 мл каждый) воздуха с помощью стеклоуистого капельница.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает очистку остаточного раствора EBD (или экспериментальных агентов) изнутри катетера. - Снимите катетер, затем сохраните положение мыши в течение 30 с.
- Поместите животное на согреваемые одеяла, пока он не приходит в сознание. Восстановление, как правило, завершено в течение 2 минут.
- Подход IB к селективной сегментальной каниляции дистального левого легкого
- После выполнения ИТ-каниляции (шаг 4.11), поверните пластиковую доску -74 "(рисунок 4B).
- Держите концентратор катетера и применять мягкое давление для продвижения катетера в левый основной бронхов, при этом размещение скромное давление как вниз (90 ") и к bookend. На глубинах, отмеченных в таблице1, оператор должен отметить сопротивление, так как нижние сегменты левого легкого заняты. При тагипноне снимите катетер в положение 20-25 мм и повторите попытку.
- После канюляции левого нижнего сегмента легких, изменение позиции требуется, чтобы гравитационная помощь для агентадминистрациии. Поверните пластиковую доску -30 "(рисунок 4B).
- Доставьте 40 л 0,3% EBD с наконечником погрузки геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это возможно, чтобы доставить больший объем агента, потому что левое легкое имеет только одну долбу. - Распределить 1-2 aliquots (0,1-0,3 мл каждый) воздуха с помощью стеклокапель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает очистку любых остаточных EBD (или экспериментальных агентов) изнутри катетера. - Снимите катетер, затем сохраните положение мыши в течение 30 с.
- Поместите животное на согреваемые одеяла, пока он не приходит в сознание. Восстановление, как правило, завершено в течение 2 минут.
- Адаптация администрации IB, чтобы обеспечить доставку агента в полном объеме левого или правого легкого
ПРИМЕЧАНИЕ: Если оператор стремится доставить агентов не к определенной правой доли легких или левого сегмента легких, а для всего легкого (правое или левое легкое), катетер должен быть слегка снят с соответствующего основного бронха, а следующим образом.-
Правая вся администрация легких
- После шага 4.11 поверните пластиковую доску(рисунок 5A).
- Держите концентратор катетера и направлять его естественным путем параллельно средней линии мыши, достигая его до глубины, необходимой для правой односторонней дистальной лобарной канноизоляции(Таблица 1).
- Подтвердите появление знака тагипноя.
- Поверните мышь -74 ", чтобы гравитационная помощь для доставки агента(рисунок 5B).
- Снимите катетер до позиции, которая соответствует взлету правого основного бронха(таблица 1). Убедитесь, что скобы катетера обращены вниз(рисунок 5B).
- Доставьте 30 л 0,3% EBD с наконечником погрузки геля в правое легкое.
- Распределить 1-2 aliquots (0,1-0,3 мл каждый) воздуха с помощью стекловыки.
- Снимите катетер, затем сохраните положение мыши в течение 30 с. Поместите животное на согреваеемые одеяла, пока оно не придет в сознание. Восстановление, как правило, завершено в течение 2 минут.
-
Левая вся администрация легких
- После шага 4.11, поверните пластиковую доску -74 "(рисунок 6A). Кроме того, вращение может произойти после шага 5.3.1.8 путем снятия катетера к трахеее, что позволяет двустороннее управление агентом IB.
- Держите концентратор катетера и приложите мягкое давление, чтобы продвинуть катетер в левый катетер главного калибра, при этом устанавливая умеренное давление как вниз (90 градусов), так и к букенду. Глубина интубации руководствуется таблицей1.
- Подтвердите отсутствие знака тагипноа.
- Поверните мышь (86) для оказания помощи в управлении агентом.
- Снимите катетер в левый основной бронх (тех же расстояний, что и правое легкое, таблица 1) и поверните скотовод лица катетера вниз (рисунок6B).
- Доставьте 30 л 0,3% EBD с кончиком понабочной нагрузки геля в левое легкое.
- Распределить 1-2 aliquots (0,1-0,3 мл каждый) воздуха с помощью стекловыки.
- Снимите катетер, затем сохраните положение мыши в течение 30 с. Поместите животное на согреваеемые одеяла, пока оно не придет в сознание. Восстановление, как правило, завершено в течение 2 минут.
-
Правая вся администрация легких
6. Использование последовательных подходов к консервации IB для доставки скорректированных на дозу объемов агента в каждое легкое
-
Группа ИТ-администрирования
- Выполните ИТ-каннулуляцию, описанную в шагах 4.1-4.11.
- Доставка 60 л 0,05% FITC-dextran (см. Таблица материалов) с наконечником погрузки геля (рисунок1B).
- Распределить 1-2 aliquots (0,1-0,3 мл каждый) воздуха с помощью стеклокапель.
- Держите положение в течение 60 с и позволяют для восстановления мыши, как описано выше.
-
Симметричное двустороннее управление IB
- Выполните шаги 5.3.1.1-5.3.1.8 (правое легкое) и шаги 5.3.2.1-5.3.2.8 (левое легкое).
- Администрирование равных объемов (30 л) 0,05% FITC-dextran (или экспериментального агента) в каждой стороне легких.
-
Скорректированная на дозу двусторонняя администрация IB
- Выполните шаг 5.3.1.1-5.3.1.8 (правое легкое) и шаги 5.3.2.1-5.3.2.8 (левое легкое).
- Администрирование большего объема (40 л) 0,05% FITC-dextran в более крупное правое легкое, и меньший объем (20 л) 0,05% FITC-dextran в меньшее левое легкое. Вместо FITC-dextran может быть введен экспериментальный агент.
7. Использование дозы скорректированной администрации IB для улучшения симметрии однодозовых бломицин (BLM)-индуцированной травмы легких
-
Группы администрирования BLM
- Скорректированная на дозу IB-BLM (1,2 мг/кг, см. Таблица Материалов) административная группа: 60 qL (20 л для левого легкого и 40 л для правого легкого, соответственно) раствора BLM были доставлены мышам (n No 5). Элементы управления (n No 5) получили аналогичные объемы сольения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагам 5.3.1 и 5.3.2. - Группа ИТ-администрирования: 60 зл раствора BLM были доставлены мышам с помощью методов ИТ-администрирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагам 6.1.1.1.1.4.
- Скорректированная на дозу IB-BLM (1,2 мг/кг, см. Таблица Материалов) административная группа: 60 qL (20 л для левого легкого и 40 л для правого легкого, соответственно) раствора BLM были доставлены мышам (n No 5). Элементы управления (n No 5) получили аналогичные объемы сольения.
-
Измерение функции легких
- На 21 день после BLM или сольника, анестезируют мышей с интраперитонеальной (IP) инъекцией кетамина (160 мг/кг) и ксилазина (32 мг/кг).
- После подтверждения глубины анестезии по лапам / ног щепотку, выполнить трахеостомию с 18 G канюли (см. Таблица материалов).
- Подключите мышей к аппарату искусственной вентиляции легких и измерить дыхательную механику, как ранее описано4.
-
Сбор и обработка тканей легких
- После измерения легочной механики, эвтаназии анестезирует мышей с помощью сердечного прокола.
- Откройте грудную стенку и нависните двусторонними пневмоторасами.
- Надуть легкие с 1% низким расплава агарозы (40 градусов по Цельсию)5 в PBS при постоянном давлении (42 см H2O).
- Вырезать от четырех до пяти частей легкого вдоль длинной оси поперечно, исправить в 10% формалин, и вставлять в парафин.
- Вырезать 5 мкм разделов и пятно с трихромом Массона, чтобы визуализировать осаждение коллагена.
8 Постпроцедурный уход
- В конце процедуры выживания, поместите животное на согревающий одеяло, пока он не приходит в сознание. Восстановление, как правило, завершено в течение 2 минут.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Селективная интубация IB нацелена на определенные доли (правое легкое) или базилярные сегменты (левое легкое).
ИБ администрирование ЭБД в правом легком было выполнено, как описано в разделе 5.1. После завершения эксперимента мышам вводили смертельную дозу интраперитонеального кетамина/ксилазина, а легкие собирали для демонстрации распределения EBD(рисунок 4A, справа). Грубый внешний вид легких показывает, что 90% попыток канитулировали с небольшой задней долей правого легкого, в то время как 10% попыток были направлены на нижнюю долбу. Предполагается, что небольшие объемы этих долей объясняют компенсационную тагипноа мыши во время дистальной каниляции (для поддержания минутной вентиляции через катетер).
ИБ администрирование ЭБД в левое легкое было выполнено, как описано в разделе 5.2. 100% попыток нацелены на нижние сегменты левого легкого(рисунок 4B). В отличие от правосторонней интубации, при таком участии не происходит тагипноа, отражающего интубацию (и вентиляцию) более крупных сегментов левого легкого.
Адаптация селективной техники консервации IB может быть направлена на все левое или правое легкое.
Как только ib канистру выполняется, вывод катетера IB (и изменения в позиционировании мыши, как описано в разделе 5.3) может быть использован для улучшения доставки агентов на все доли правого легкого (и все сегменты левого легкого). Привитие раствора EBD правому легкому (раздел 5.3.1) успешно направлено на все нужные доли, как показано на рисунке 5C. Привитие раствора EBD левому легкому (раздел 5.3.2) успешно ориентировано на все левые сегменты(рисунок 6C).
ИТ-администрирование или симметричное администрирование IB дает асимметричные легкие parenchymal концентрации агента, которые могут быть исправлены IB дозы-корректировки.
Мыши прошли двустороннее введение в размере 30 л 0,05% FITC-dextran в левое легкое и 30 л 0,05% FITC-dextran в правое легкое, как описано в разделе 6.2. Кроме того, мыши получили 60 л 0,05% FITC-dextran внутричечеально в соответствии с разделом 6.1. В конце эксперимента мышей усыпили с помощью терминальной передозировки анестезии (кетамин/ксилазин). Легкие были немедленно собраны и однородны. FITC-флуоресценция (количественно оптическая плотность) была измерена с 96-наилучшим считывателем пластин. Дата была проанализирована с t-тест студента для сравнения 2 группы.
Как описано на рисунке 7, как ИТ (Рисунок7A) и симметричное администрирование IB (Рисунок7B) FITC-dextran привело к асимметричной пуэнхимальной флуоресценции легких FITC, с большей относительной концентрацией (нормализованной до веса), отмеченной в левое легкое. Это говорит о том, что асимметричная доставка легких экспериментальных агентов после введения ИТ не является следствием асимметричной презентации этих агентов каждому основному бронху. Скорее, было высужено, что равные поставки основного ствола (как это обеспечивается симметричным администрированием IB) были разбавлены различиями в весах/массе легких, как это было отмечено в таблице2.
Чтобы преодолеть эти различия в симметричных родах, 40 qL 0,05% FITC-dextran вводили в более крупное правое легкое и 20 Зл в меньшем левом легком, в соответствии с разделом 6.3. Это "доза скорректированной администрации IB" улучшилась симметрия легких parenchymal доставки агента(рисунок 8A). Несмотря на эту коррекцию, однако, мы наблюдали стойкую неоднородность в различных доле правого легкого(рисунок 8B).
BLM-индуцированной травмы легких в различных системах доставки:
Чтобы продемонстрировать, что скорректированная на дозу администрирование IB экспериментальных агентов может улучшить моделирование диффузной болезни легких, мы ввели BLM (модель мыши фиброзной травмы легких) либо внутричече, либо через дозу скорректированной администрации IB, в соответствии с разделом 7. Как и ожидалось с этой моделью травмы, как ИТ и IB инъекции BLM привело к травме легких и системных заболеваний (с потерей веса). Эта системная болезнь разрешилась за 7 дней. 21-дневная смертность составила 20% (1/5) в ИТ-группе и 0% (0/5) в группе IB, скорректированной на дозу.
Через 21 день после введения ИТ- или IB-BLM мышей собирали для гистологии легких. Как показано на репрезентативном гистологическом изображении(рисунок 9А),
Чтобы определить, является ли это улучшение лево-правой однородности фиброзной травмы легких физиологически актуальным, было отмечено, что скорректированная на дозу администрация IB BLM придала более последовательную потерю инспираторной способности (IC) и соблюдения дыхательной системы (Crs), а также согласованное увеличение эластики дыхательной системы (Ers)(рисунок 9B).
Рисунок 1: Анатомия мыши дыхательных путей каниляции. (A) Мышь дыхательных путей литые было сделано путем раздувания мыши легких (собранные из 25 г мыши) с кремния эластомер. (B) Размещение катетера для стандартного ИТ-администрирования. (C) Размещение катетера для администрирования IB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Настройка для рабочей платформы. (A) Металлический букенд (угол 90 евро) согнут до 70 градусов. Винтовая дыра помещается в верхней средней линии, чтобы закрепить подвижный (80 мм х 150 мм). Крюк и петля ленты и подвески шов размещены, чтобы позволить позиционирование анестезирующей мыши на доске. (B) Пластиковая доска закреплена винтом на металлическом букенд. Винт достаточно рыхлый, чтобы позволить вращение доски в часовой стрелке (я) или против часовой стрелки (-) направление. (C) Анестезия мышь расположена с помощью крючка и петли ленты (0,75 " W) для ИТ / IB агент администрации. Шов передается под резчиками мыши, чтобы можно было стабилизировать голову. Оператор расположен на торцевом аспекте мыши, а шея освещается с помощью гусиной шейной лампы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Создание индивидуальных катетеров для администрирования IB. (Шаг1) Для того, чтобы достаточная длина катетера задействовать основные бронхи, два катетера объединяются. (Шаг2) Катетеры соединены под небольшим углом, что облегчает селективную интубацию к основным бронхи. (Шаг3) Кроме того, дистальный наконечник катетера смоченной, что позволяет лучше управлять направленным закачиванием дыхательных путей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Подход к селективному праву/левому лозерной кануляции и администрированию. (A) Для целевой правого легкого, пластиковая доска вращается 30 ", улучшение легкости выборочно привлечения правой основной бронхов. Катетер является продвинутым (на расстояния, предлагаемые в таблице1) для выборочно заниматься правосторонних долей. Было введено 20 ЗЛ 0,3% EBD. В 90% попыток, задняя доли канитулирует. Остальные 10% попыток занимут низшую доле. (B) Для того чтобы пристрелть левое легкя, пластичная доска сперва повернута -74» для левого участия mainstem. После успешной интубации катетера, вращение затем уменьшается до -30 ", чтобы гравитация, чтобы помочь с доставкой агента. Чтобы доказать избирательное участие левой стороны, было поставлено 40 QL 0,3% EBD. Этот подход последовательно (100% попыток) нацелен на левые сегменты базилика легких. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Симметричный подход к администрированию в одностороннем порядке доставить агенты всему правому легкому. (A) Правая сторона IB интубация была выполнена на 30 ", идентичныселет правой долина лон-уплотнения легких (Рисунок 4A). (B) Пластиковая доска была затем повернута до -74 ", чтобы обеспечить гравитационную помощь во время агентадминистрациии. Наконечник катетера затем выводится на глубины, детализированные в таблице1, соответствующие правому основному бронху. Скобы наконечника расположены вниз, вращая катетерный концентратор. (C) 30 Л EBD был доставлен на -74 ", доказав диффузного правого легкого администрации EBD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Симметричный подход к администрированию в одностороннем порядке управлять агентами для всего левого легкого . (A) Левосторонний ИНтубации IB была выполнена при -74 ", идентичныселеки левой локолок каниляции (Рисунок 4B). (B) После успешной интубации, пластиковая доска была затем повернута (86) для обеспечения гравитационной помощи во время агентского администрирования. Наконечник катетера затем выводится на глубину, описанную в таблице1. Скобы наконечника смещаются вниз путем вращения катетерного концентратора. (C) 30 ЗЛ EBD был доставлен с наконечником погрузки геля, доказывая диффузное левое управление легкимeb. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: ИТ-администрирование экспериментальных агентов в равной степени поставляется в mainstem бронхов, но приводит к различным концентрациям легких parenchymal. (A) ИТ-администрирование 0,05% FITC-dextran (60 Л)) придал более высокую флуоресценцию в левом легком, предполагая неравномерные концентрации легких доставленного агента. (B) Эта неравная паранхимальная флуоресценция легких сохраняется даже тогда, когда равные объемы 0,05% FITC-dextran (30 КЛ) вводятся к каждому основному бронху. Этот стойкий паренхимальный дисбаланс, несмотря на равные правые/левые поставки основного ствола, свидетельствует о том, что различия в концентрациях легочных агентов отражают разбавление в более крупном правом легком (n - 10 на группу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Улучшение однородности осаждения агента с помощью скорректированного IB администрации. (A) Асимметрия легких parenchymal доставки улучшается, когда большая доля агента (40 л 0,05% FITC-dextran) вводят в более крупном правом легком и меньшую долю агента (20 л 0,05% FITC-dextran) в меньшем левом легком. (B) Несмотря на это улучшение лево-правой симметрии, остается неоднородность lobar осаждения агента (черный: превосходная доли; желтый: средняя доли; синий: нижняя доли; зеленый: задняя доли; красный: левое легкое). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Улучшение мыши BLM-индуцированной модели фиброз легких с использованием дозы скорректированной администрации IB. ()ИТ-администрирование BLM (1,2 мг/кг в 60 л раствор) индуцирует левую сторону преобладающей травмы легких / фиброз 21 дней спустя, в соответствии с более высокой концентрации легких агента в этом меньшем легком. Лево-правая симметрия улучшается, регулируя объем BLM к каждой стороне легкого: 40 qL раствора вводят в более крупное правое легкое и 20 злиций раствора вводят в меньшее левое легкое. I: нижняя доли, M: средняя доли, S: превосходная доли, P: задняя доли. Изображения представляют собой доли из одной репрезентативной мыши. (B) В соответствии с улучшенной симметрией распределения, скорректированная доза введения IB BLM улучшает физиологическое моделирование фиброза легких, с более репрезентативным увеличением эластики дыхательной системы (Ers) и уменьшается инспираторный потенциал (IC) и динамическое соответствие дыхательной системе (Crs). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Вес тела (г) | Количество протестированных мышей | Глубина катетера (мм) для селективной канноизоляции |
Глубина катетера (мм) для всей легочной канистры | |
| Правое легкое | Левое легкое | |||
| от 15 до 19 | 17 Лет | 37 | 38 | 26 |
| от 20 до 25 | 22 Г. | 38 | 39 | 27 |
| от 25 до 30 | 29 | 39 | 40 г. | 28 |
| No gt; 30 | 11 Год | 40 г. | 41 год | 31 год |
Таблица 1: Рекомендуемая глубина вставки катетера. Прогнозируемые глубины катетера, необходимые для выборочного канюляпации дистальных и проксимальных легких, были эмпирически определены с помощью мышей C57BL/6 различных весов (всего 79 мышей).
| Вес тела (г) | Количество протестированных мышей | Соотношение веса легких |
| от 14 до 10 | 25 | 2,01 и 0,16 |
| от 20 до 25 | 35 лет | 1,88 и 0,27 |
| от 25 до 30 | 15 лет | 1,88 и 0,27 |
| No gt; 30 | 6 | 2,03 и 0,09 |
Таблица 2: Право:левые коэффициенты веса легких. Различия в весах легких наблюдается в 81 C57BL/6 мышей демонстрируют обоснование для исправления IB управления наркотиками. Легкие были вскрыты и взвешены после смертельной дозы кетамина и ксилазина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Травма легких была классически смоделирована у грызунов с использованием ИТ-администрирования вредных агентов, таких как BLM6. Такое ИТ-администрирование, однако, только приводит к пятнистый травмы, отражающие нецелевой характер доставки легких с этим подходом7. Эти ограничения моделирования травмлегких легких поучительные проблемы, с которыми сталкиваются при попытке ИТ доставки невредных экспериментальных агентов, таких как наркотики, siRNA, или клеточной терапии.
В этом отчете мы описываем прямое администрирование IB экспериментальных агентов. Такой подход предлагает два различных преимущества по сравнению с классическими подходами к ИТ-администрированию. Во-первых, подход позволяет избирательно одностороннее введение в одно легкое, что позволяет щадить контралатерального легкого. Такой подход полезен для селективного введения препаратов в односторонне травмированное легкое (например, ишемия-реперфузионная травма8),избегая неспецифических эффектов в неповрежденном легком. Кроме того, направленное введение опухолевых клеток может быть использованодля различения первичного роста опухоли от контралатерального, метастатического распространения 9,10.
Во-вторых, в докладе подробно излагается ранее непризнанная выгода администрации IB. Как описано на рисунке 7A, ИТ-администрация относительно концентрирует экспериментальные агенты в меньшем левом легком. Эта асимметрия может быть исправлена путем введения относительно большего объема агента в более крупном правом легком (Таблица 2), обеспечивая меньший объем меньшего левого легкого (рисунок8A). Здесь была продемонстрирована актуальность этой корректировки на дозу введения IB к вызванным BLM фиброзной травмой легких. Корректировка дозы смягчает травму левого легкого (который получил меньше BLM), при одновременном увеличении травмы правого легкого(рисунок 9A). Эта повышенная симметрия совпадает со снижением изменчивости травм легких, о чем свидетельствует измерение легочной функции(рисунок 9B).
Есть несколько важных шагов в протоколе, в том числе необходимость иметь стенд, способный легко и неоднократно изменять положение животных (т.е. вращение). Более важным является способность определить, когда селективная легочная каниляция была достигнута. Как описано в разделе 4.12, использование спирометра (в котором колонка воды демонстрирует приливнуювентиляцию) обеспечивает успешную трахеальную канистру 3. Наблюдение мышиной тагипноэ согласуется с дистальной наклонной правой легкой канистры, в то время как отсутствие одышки (несмотря на сопротивление чувства с катетером вставки) предложило кануляцию левого легкого. Используя эти неоперативные методы локализации, оператор должен быть в состоянии точно направлять IB каннулосивации и экспериментального осаждения агента.
Этот подход имеет ряд ограничений. ИТ-модель доставки агентов привлекательна своей простотой. Это требует умеренной степени практики и технических навыков, хотя опытный оператор все еще может быстро выполнять эту технику в окне изофрурановой анестезии. Однако необходимые дополнительные технические навыки/практика могут быть легко компенсированы преимуществами такого подхода в экспериментах, в ходе проведения экспериментов, в ходе которого приоритетотворит либо селективный агент/доставку сиРНК/клетки, либо повышение однородности осаждения агента. Дополнительным ограничением для этого метода является неопределенность в отношении длины вставки катетера. Как подробно описано в таблице 1, 79 мужчин и женщин мышей были измерены для оценки глубины вставки катетера, необходимых для селективного IB cannulation. Эти данные служат в качестве ресурса для выполнения оператором нашего протокола. Тем не менее, мы не можем уверенно экстраполировать наш ресурс на другие штаммы мыши (в том числе нокаут мышей) или болезненно ожирением мышей. Кроме того, мы не измерили, есть ли различия в объеме воздушного пространства (лобар, сегментальный), которые варьируются в зависимости от веса. Таким образом, вполне возможно, что крупные мыши могут быть в состоянии разместить большие объемы зависания с ib администрации. Таким образом, оператор должен выполнить начальный этап оптимизации/устранения проблем (с использованием зависания EBD), чтобы гарантировать, что наша техника хорошо адаптирована к желаемой модели мыши.
Таким образом, в этом докладе описывается новый метод IB, который может быть использован для выборочного администрирования экспериментальных агентов в одном легком или адаптированы для обеспечения симметричного распределения по обоим легким. Эти преимущества оправдывают незначительное увеличение сложности по сравнению со стандартными ИТ-технологиями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована грантом NHLBI HL125371 e.P.S. и грантом DOD (CDMRP) W81XWH-17-1-0051 в Y.Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G shielded IV Catheter | BD | 381423 | |
| Bleomycin | Enzo life sciences | BML-AP302-0010 | |
| Compact Mini rodent anesthesia machine | DRE Veterinary | 9280 | |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC | |
| LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-30W | |
| Low temperature cautery with fine tip | Bovie | AA02 | |
| Precisionglide needle, 18G x 1" | BD | 305195 | Beveled tip, 12 mm in length |
| Xylazine | AKORN | NDC 59399-110-20 | |
| Zatamine | VetOne | NDC 13985-702-10 | Ketamine |
References
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106 (3), 984-987 (2009).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
- Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung. Laboratory Investigation. 71 (1), 149-153 (1994).
- Thrall, R. S., McCormick, J. R., Jack, R. M., McReynolds, R. A., Ward, P. A. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat: inhibition by indomethacin. American Journal of Pathology. 95 (1), 117-130 (1979).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), L379-L399 (2008).
- Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44 (8), e604-e613 (2016).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13 (6), 349-358 (2000).
