Summary
Aquí describimos los protocolos para aplicar cargas mecánicas definidas a los terneros de ratón y para monitorear los cambios de presión intramusculares concomitantes. Los sistemas experimentales que hemos desarrollado pueden ser útiles para investigar el mecanismo detrás de los efectos beneficiosos del ejercicio físico y el masaje.
Abstract
El masaje es generalmente reconocido para ser beneficioso para aliviar el dolor y la inflamación. Aunque estudios anteriores han reportado efectos antiinflamatorios del masaje en los músculos esqueléticos, los mecanismos moleculares detrás son mal entendidos. Recientemente hemos desarrollado un dispositivo simple para aplicar compresión cíclica local (LCC), que puede generar ondas de presión intramusculares con diferentes amplitudes. Usando este dispositivo, hemos demostrado que LCC modula las respuestas inflamatorias de los macrófagos in situ y alivia la atrofia muscular inducida por inmovilización. Aquí, describimos los protocolos para la optimización y aplicación de LCC como una intervención similar a un masaje contra la inflamación inducida por la inmovilización y la atrofia de los músculos esqueléticos de las extremidades posteriores del ratón. El protocolo que hemos desarrollado puede ser útil para investigar el mecanismo subyacente a los efectos beneficiosos del ejercicio físico y el masaje. Nuestro sistema experimental proporciona un prototipo del enfoque analítico para dilucidar la regulación mecánica de la homeostasis muscular, aunque es necesario seguir desarrollando para estudios más exhaustivos.
Introduction
Masaje es generalmente reconocido para ser beneficioso para el alivio del dolor y la mejora del rendimiento físico entre los atletas competitivos y no atletas por igual1,2. De hecho, estudios previos han demostrado que el masaje suprime la inflamación local3 y provoca la recuperación del daño muscular post-ejercicio4,5. Los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos beneficiosos del masaje siguen siendo en gran medida desconocidos.
Una de las dificultades con la investigación mecanicista sobre el masaje se refiere a la reproducibilidad de las técnicas experimentales mediante las cuales se prueban intervenciones similares a los masajes. En estudios anteriores, los procedimientos experimentales que imitan el masaje implican principalmente la aplicación de intervenciones físicas utilizando las partes del cuerpo de los practicantes, como palmas y dedos6,7,8. Esto hace que sea difícil reproducir con precisión su magnitud, frecuencia, duración y modo.
Muchos dispositivos han sido desarrollados para aplicar cargas mecánicas definidas a los tejidos objetivo. Por ejemplo, Zeng y otros han desarrollado un sistema neumático para la carga mecánica longitudinal a las patas traseras de las ratas9 y Wang et al. han desarrollado un dispositivo mecatrónico que puede aplicar cargas mecánicas similares a un masaje a las extremidades posteriores de ratas y conejos con control de retroalimentación en tiempo real10. En comparación con ellos, nuestro sistema de compresión cíclica local (LCC) es mucho más simple, exigiendo mucho menos costo para la construcción. Sin embargo, podemos reproducir los cambios de presión intramuscular que se generan durante la contracción muscular leve. Usando este dispositivo, hemos demostrado con éxito que las intervenciones mecánicas similares al masaje modulan la dinámica local del fluido intersticial y alivian la atrofia muscular inducida por la inmovilización11.
Aquí, describimos los detalles de nuestro dispositivo y el protocolo, que pueden ayudar a explorar los mecanismos moleculares detrás de los efectos positivos de los ejercicios y masajes. Los esquemas del protocolo se presentan como Figura Suplementaria 1.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Nacional de Rehabilitación para Personas con Discapacidad.
1. Inmovilización de las extremidades posteriores bilaterales del ratón
NOTA: Los ratones machoC57BL/6 se utilizaron para experimentos a la edad de 11 - 12 semanas después de la aclimatación durante al menos 7 días.
- Anestesiar adecuadamente un ratón con pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.). Asegúrese de que los ratones no respondan a un pellizco del dedo del dedo del pies de la extremidad posterior.
NOTA: Llevar a cabo el procedimiento de inmovilización entre las 10 a.m. y las 7 p.m. para minimizar los posibles efectos en la actividad de alimentación de los ratones. - Aplique cintas quirúrgicas a las extremidades posteriores bilaterales del ratón colocadas en una posición supina con las articulaciones de la rodilla extendidas y las articulaciones del tobillo plantar-flexibles.
- Coloque un alambre de aluminio (ver Tabla de Materiales)en el tronco a nivel de la columna vertebral L4-5 y enrolle el alambre en una configuración en espiral alrededor de las extremidades posteriores con espacios de 5 mm entre cada vuelta de la capa espiral(Figura 1A). Asegúrese de no enrollar el cable demasiado firmemente y evitar perturbar el flujo sanguíneo local.
- Para minimizar la posibilidad de escape del cableado, inmovilice las articulaciones de la cadera en la posición de abducción de 90o ajustando manualmente la configuración del cable de aluminio.
- Devuelva a los ratones a sus jaulas originales. 3 h más tarde, asegúrese de que se recuperan de la anestesia y el acceso a los alimentos y el agua como de costumbre.
- Casa 3 - 6 ratones inmovilizados por jaula como antes de la inmovilización.
2. Medición de la presión intramuscular de los músculos del ratón gastrocnemius
NOTA: Varios pesos diferentes de unidades cilíndricas (36 g, 66 g y 200 g) se probaron en los experimentos de monitoreo de presión combinados con LCC. Esta medición se llevó a cabo por separado de los experimentos para analizar la inflamación muscular y la atrofia (ver paso 3 - 5 para más detalles), es decir, los ratones sometidos a medición de presión no se utilizaron para análisis histológicos.
- Debido a que la medición de la presión implica procedimientos más invasivos (por ejemplo, incisión cutánea e inserción de agujas) en comparación con el cableado de las extremidades posteriores y LCC, utilice una mezcla de tres agentes anestésicos (medetomidina 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg y butorphanol 5,0 mg/kg, i.p.). Asegúrese de que los ratones no respondan al pellizco del dedo del pito trasero.
- Colocar el ratón en una posición propensa, hacer una incisión de 2 mm con un bisturí en la pantorrilla posterior después de depilar con una afeitadora eléctrica y semi-esterilizar la superficie de la piel con 70% de etanol y clorhexidina-empapado de algodón absorbente.
- Inserte una aguja de 20 G en el músculo gastrocnemius en un ángulo obtuso (150o – 170o) hacia la superficie de la piel.
- Usando la vaina de plástico de la aguja como guía, coloque un sensor del temímetro de presión arterial (ver Tabla de Materiales)en el vientre medio del músculo gastrocnemius, y luego retire la vaina del músculo.
- Después de suturar la piel con sutura de nylon 4-0, aplicar LCC con varios pesos diferentes de unidades cilíndricas a la pantorrilla en los ratones (ver paso 3 para más detalles), y controlar la presión intramuscular utilizando software para el análisis de señal biológica (ver Tabla de Materiales).
- Devuelva a los ratones a sus jaulas originales. 3 h más tarde, asegúrese de que se recuperan de la anestesia / analgesia y tienen acceso a alimentos y agua como de costumbre.
3. Compresión cíclica local (LCC) en terneros de ratón
- Excepto para la medición de la presión intramuscular y la eutanasia (es decir, la luxación cervical), utilice pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.) para la anestesia.
- Desconecte el ratón del cableado de las extremidades posteriores y colóquelo en una posición propensa con las articulaciones de la rodilla extendidas y las articulaciones del tobillo plantar-flexibles de modo que las pantorrillas se enfrentaran hacia arriba. No fije las patas traseras del ratón en el escenario.
- Aplique LCC a la pantorrilla moviendo verticalmente una unidad de peso cilíndrico(Figura 1B)cubierta con una almohadilla de cojín(Figura 1C)a 1 Hz durante 30 min por día, 7 días.
- Después de cada pelea de LCC diario, vuelva a cablear las extremidades posteriores del ratón.
4. Análisis inmunohistoquímico de gastrocnemius
- Eutanasia del ratón mediante luxación cervical bajo anestesia/analgesia adecuada mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de tres agentes anestésicos (medetomidina 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg y butorphanol 5,0 mg/kg).
- Después de depilar la superficie posterior de la pantorrilla, haga una incisión cutánea y diseccione los músculos gastrocnemius separándose del hueso tibio-fibular usando una tijera quirúrgica y congele rápidamente en una solución compuesta de temperatura de corte óptima.
- Con un criostato, prepare muestras de criosección de los músculos gastrocnemius en diapositivas de vidrio. Almacene las muestras en un congelador de -80 oC hasta su análisis.
- Saque las muestras de criosección gastrocnemius que se analizarán del congelador y deshidratalas por secado al aire a temperatura ambiente.
- Utilice una pluma bloqueadora de líquidos para dibujar un área que incluya todas las criosecciones de la diapositiva. El círculo evitará que las soluciones fluyan fuera de la diapositiva.
- Evite el secado de las muestras colocando los portaobjetos en una bandeja en la que se cree un ambiente húmedo con un paño de papel empapado en agua.
- Aplicar 100 l de tampón de bloqueo (salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0,25% de caseína, proteína portadora y azida sódica de 0,015 M) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Enjuague las diapositivas dos veces incubando con PBS-T (PBS que contiene 0,1% monolaurato de sorbitano de polioxietileno (ver Tabla de Materiales)durante 5 min.
- Aplicar 100 s de anticuerpo primario diluido con PBS en cada muestra, cubrir la bandeja con una tapa e incubar durante la noche a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces con PBS-T (5 min por cada lavado).
- Aplicar 100 éL de anticuerpo secundario diluido con PBS en cada muestra e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: Para la tinción anti-laminina, utilice anticuerpos secundarios conjugados Alexa Fluor 568. Para anticuerpos secundarios anti-F4/80, anti-MCP-1 y anti-TNF,, utilice Alexa Fluor 568- o 488-conjugado anticuerposecundario. - Lavar 3 veces con PBS-T (5 min por cada lavado).
- Aplicar 100 l de solución DAPI diluida con PBS-T en cada muestra e incubar durante 3 min a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces con PBS-T (5 min para cada uno).
- Monte las muestras con un medio de montaje y cúbralas con tapas.
5. Análisis histomorfométrico del gastrocnemio
- Coloque los portaobjetos de muestra en un microscopio de fluorescencia (ver Tabla de Materiales)y vea las muestras utilizando un objetivo de 20o con filtros apropiados (DAPI-B, 360/40 nm para excitación y 460/50 nm para la emisión; GFP-B, 470/40 nm para excitación y 535/50 nm para emisión; FRITC, 540/25 nm para excitación y 605/55 nm para emisión.
- Usando el software para el análisis de imágenes (ver Tabla de Materiales),mida el área transversal (CSA) de cada miofibra, y cuente el número de células f4/80-, MCP-1-, y TNF--positivas.
NOTA: Determinar la CSA de cada miofibra trazando el margen interno de la membrana del sótano visualizado con inmunomancha anti-laminina-2.
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Representative Results
En consonancia con nuestras observaciones anteriores12, la CSA de las miofibras gastercnemius se redujo significativamente por la inmovilización de las extremidades posteriores(Figura 2A,B). Además, nuestro análisis de tinción de inmunofluorescencia reveló que las células que expresan MCP-1 y TNF-o, que desempeñan un papel clave en la regulación de los procesos inflamatorios13,14, aumentaron significativamente en el músculo gastrocnemio tejidos de las extremidades posteriores inmovilizadas (MCP-1: Figura 2C,F,H; TNF--: Figura 2D,G,I). Junto con el aumento de las células manchadas positivamente con F4/80, un marcador para los macrófagos(Figura 2C-E,H,I),la inmovilización de las extremidades posteriores parecía instigar la atrofia muscular de la pantorrilla que implicaba respuestas inflamatorias locales, incluyendo respuestas inflamatorias locales, incluyendo acumulación de macrófagos. A continuación, tratamos de examinar si LCC, una intervención mecánica similar a un masaje, modulado esta inflamación muscular inducida por inmovilización y atrofia.
Entre varias magnitudes LCC diferentes que probamos cambiando el peso de la unidad cilíndrica, la correspondiente a ondas de presión intramusculares de 50 mmHg (LCC con 66 g, Figura 3A)parecía aliviar más eficientemente la disminución inducida por inmovilización en la AC de miofibra y aumento de la acumulación de macrófagos en los músculos de gastrocnemius(Figura 3B). En base a los resultados de la CSA de miofibra y la acumulación de macrófagos, empleamos 66 g de LCC para estudios posteriores. En particular, las ondas de presión intramuscular inducidas por LCC, cuyas magnitudes máximas dependían del peso unitario cilíndrico, fueron muy uniformes(Figura 3A),lo que indica la consistencia y reproducibilidad de LCC como intervención mecánica músculos esqueléticos.
LCC (1 Hz, 30 min por día, 7 días) alivió significativamente las disminuciones inducidas por la inmovilización en la CSA de miofibra de los músculos gastrocnemius(Figura 4A,B). Además, LCC templaba parcialmente la disminución inducida por la inmovilización en la fuerza de contracción de los músculos del triceps surae(Figura 4C). Además, LCC atemperó los aumentos en F4/80-positivo, TNF-positivo, F4/80-, MCP-1-, y TNF-o-positivo en los tejidos musculares gastrocnemius de las extremidades posteriores inmovilizadas (F4/80, Figura 4D,F; MCP-1, Figura 4D,G; TNF--, Figura 4E,H). Colectivamente, LCC, que genera ondas de presión intramusculares con una amplitud de 50 mmHg, atrofia muscular inducida por inmovilización aliviada y respuestas inflamatorias locales incluyendo acumulación de macrófagos.
Figura 1: Inmovilización bilateral de las extremidades posteriores del ratón y aplicación de compresión cíclica local (LCC).
(A) Las extremidades posteriores bilaterales del ratón fueron inmovilizadas por el cableado en espiral con las articulaciones de la cadera secuestradas, las articulaciones de la rodilla extendidas y las articulaciones del tobillo plantar-flexibles. (B) Dispositivo LCC. (C) Configuración experimental para LCC en la pantorrilla del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La inmovilización de las extremidades posteriores del ratón, que atrofia los músculos de la pantorrilla, induce una respuesta inflamatoria local.
(A) Imágenes micrográficas transversales de la tinción de inmunofluorescencia antilaminina-2 de los músculos gastrocnemius. Las imágenes de alto aumento (derecha) se refieren a las áreas indicadas por rectángulos en imágenes de bajo aumento (izquierda). Barras de escala, 100 m. (B) Atrofia muscular inducida por inmovilización. La AECT de las miofibras gastrocnemius disminuyó con el período de inmovilización de las extremidades posteriores. Para cuantificar CSA, se eligieron al azar 100 miofibers. Los datos se presentan como medias s.D. *, P < 0.05, ANOVA unidireccional con prueba de Bonferroni post hoc (n.o 3 ratones para cada grupo). (C y D) Imágenes micrográficas de inmunomancha anti-MCP-1 (verde en C) y anti-TNF-o (verde en D) y anti-F4/80 (rojo). Para la presentación combinada (verde y rojo), las imágenes de aumento bajo y alto se colocan como en (A). Las flechas apuntan a celdas positivas dobles para las barras de escala F4/80 y MCP-1 (C) o TNF-o (D), 100 m. (E-I) Cuantificación de la inmunomancha anti-MCP-1, anti-TNF-y anti-F4/80. Se analizaron los efectos de la inmovilización con referencia al período de inmovilización bilateral de las extremidades posteriores. Se realizaron análisis estadísticos con referencia a las muestras del 'Día 0' (músculos gastrocnemius de ratones que no fueron sometidos a inmovilización). Los datos se presentan como medias s.D. *, P < 0.05, ANOVA unidireccional con prueba de Bonferroni post hoc (n.o 3 ratones para cada grupo). Esta cifra se ha modificado con el permiso11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectos de LCC con diferentes magnitudes en la atrofia muscular inducida por inmovilización y la respuesta a la inflamación.
(A) Aplicación de diferentes magnitudes de LCC cambiando el peso de la unidad cilíndrica. Barra de escala, 1 s. 36-g, 66-g y 200-g unidades cilíndricas producidas 45 mmHg, 50 mmHg y 140 mmHg ondas de presión intramusculares, respectivamente. (B) Comparación de los efectos de la aplicación de LCC a las extremidades posteriores inmovilizadas con unidades cilíndricas de 36 g, 66 g y 200 g. CSA de las células gastrocnemius miofibers (izquierda) y F4/80-positivas (derecha) de la pantorrilla aplicada con LCC se cuantificaron como valores relativos a los de la extremidad posterior de control, que no estaba expuesta a LCC, en cada ratón. Los datos se presentan como medias s.D. *, P < 0.05, ANOVA unidireccional con prueba de Bonferroni post hoc (n .4 ratones para cada grupo). Esta cifra se ha modificado con el permiso11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: LCC atenúa la atrofia muscular inducida por inmovilización inmovilizada y la respuesta inflamatoria.
(A,B) Alivio de la atrofia muscular inducida por inmovilización por aplicación de LCC. CSA de gastrocnemius myofibers (B) se analizó como en la Figura 2B. Los datos se presentan como medias s.D. *, P < 0.05; **, P < 0.01, ANOVA unidireccional con prueba de Bonferroni post hoc (n 6 ratones para cada grupo). (C) La disminución de la fuerza de contracción de los músculos de los tríceps surae después de la inmovilización y su restauración parcial por LCC. Los datos se presentan como medias de S.D. *, P < 0.05, prueba t de estudiante emparejado (n a 4 ratones para el control, n a 5 ratones para el grupo de inmovilización). (D,E) Las imágenes micrográficas de las manchas de inmunofluorescencia anti-MCP-1 (verde en D), anti-TNF-o (verde en E) y anti-F4/80 (rojo) de los músculos gastrocnemius de las extremidades posteriores movilizadas (arriba) e inmovilizadas sin (medio) y con aplicación de LCC (abajo) se presentan como en la Figura 2C,D. Barras de escala, 100 m. (F-H) Cuantificación de la inmunomancha anti-MCP-1, anti-TNF-o y anti-F4/80. Comparamos los músculos de la pantorrilla de las extremidades posteriores inmovilizadas con y sin aplicación lCC. Los datos se presentan como medias s.D. *, P < 0.05; **, P < 0.01, ANOVA unidireccional con prueba de Bonferroni post hoc (n 6 ratones para cada grupo). Esta cifra se ha modificado con el permiso11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Representación esquemática de protocolos experimentales. Haga clic aquí para descargar la figura.
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Discussion
Hemos descrito un método para aplicar un estímulo mecánico similar al masaje, que tiene efectos antiinflamatorios. Nuestro sistema tiene ventajas de seguimiento incluso en comparación con las reportadas anteriormente. En primer lugar, estudios anteriores no definieron cuantitativamente las fuerzas mecánicas aplicadas2 o definieron sus magnitudes en función de la medición en la superficie corporal, pero no dentro de los tejidos10. Por el contrario, medimos la presión intramuscular utilizando un telemómetro de presión arterial. En segundo lugar, la estructura simple de nuestro dispositivo(Figura 1B)nos permitió construir el sistema con alta consistencia y reproducibilidad(Figura 3A)a un costo relativamente bajo. En tercer lugar, nuestra intervención (LCC) se refiere a la actividad física (contracción muscular leve) con respecto a los cambios de presión intramuscular (50 mmHg15). Nuestro enfoque proporcionará una base científica para la intervención similar al masaje como posible procedimiento terapéutico/preventivo que disminuye el demérito de la inactividad física16.
El paso más crítico en nuestro protocolo es el posicionamiento de las extremidades posteriores del ratón (paso 3.3 del protocolo). Necesitamos aplicar LCC en la dirección perpendicular a los músculos de la pantorrilla; de lo contrario, los tejidos musculares se exprimen y se dañan parcialmente incluso cuando se utiliza la unidad cilíndrica de 66 g.
La limitación del método LCC incluye el requisito de anestesia, que puede tener algunos efectos sobre el metabolismo muscular. Además, no podemos excluir por completo las influencias de la pequeña contracción muscular que pueden ser causadas como un reflejo de impactos agudos durante la aplicación de LCC.
En conclusión, hemos demostrado que el movimiento de fluido intersticial media los efectos LCC11. Podemos inducir el flujo intersticial de manera más eficiente modificando el modo de compresión cíclica. Por ejemplo, la compresión del modo sinusoidal puede ser mejor en comparación con los trazos bruscos utilizados en nuestro estudio actual.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses en competencia asociados con el manuscrito.
Acknowledgments
Agradecemos a K. Nakanishi, K. Hamamoto, N. Kume y K. Tsurumi por su apoyo constante durante todo el proyecto. Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo intramuros de investigación del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Los Estados Xacones; Subvenciones en Ayuda para la Investigación Científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia; Programa apoyado por MEXT para la Fundación de Investigación Estratégica en Universidades Privadas, 2015-2019 del Ministerio japonés de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (S1511017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum wire | DAISO JAPAN | B028 | An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire |
| Blood pressure telemeter | Millar | SPR-671 | A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy. |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500) | Invitrogen | A11034 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500)) | Invitrogen | A11077 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| ImageJ | NIH | N/A | Analysis software for image |
| LabChart8 | ADInstrumens | Analysis software for acquiring biological signals. | |
| Prolong gold | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Prolong gold is for mounting stained samples. |
| Protein Block Serum-Free | Dako | X090930-2 | For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures. |
| Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Sigma Aldrich | L0663 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500) | Abcam | ab6640 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab25124 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab66579 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Surgical tape | 3M Japan | 1530EP-0 | Surgical tape is used to restrict joint movement. |
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