Summary
Nous décrivons ici les protocoles pour appliquer des charges mécaniques définies aux veaux de souris et pour surveiller les changements concomitants de pression intramusculaire. Les systèmes expérimentaux que nous avons développés peuvent être utiles pour étudier le mécanisme derrière les effets bénéfiques de l'exercice physique et le massage.
Abstract
Le massage est généralement reconnu comme bénéfique pour soulager la douleur et l'inflammation. Bien que des études antérieures aient rapporté des effets anti-inflammatoires du massage sur les muscles squelettiques, les mécanismes moléculaires derrière sont mal compris. Nous avons récemment développé un dispositif simple pour appliquer la compression cyclique locale (LCC), qui peut générer des ondes de pression intramusculaire avec des amplitudes variables. Utilisant ce dispositif, nous avons démontré que LCC module des réponses inflammatoires des macrophages in situ et soulage l'atrophie musculaire induite par l'immobilisation. Ici, nous décrivons des protocoles pour l'optimisation et l'application de LCC comme intervention mass-like contre l'inflammation induite par l'immobilisation et l'atrophie des muscles squelettiques des membres postérieurs de souris. Le protocole que nous avons développé peut être utile pour étudier le mécanisme sous-jacent aux effets bénéfiques de l'exercice physique et le massage. Notre système expérimental fournit un prototype de l'approche analytique pour élucider la régulation mécanique de l'homéostasie musculaire, bien que d'autres développements doivent être faits pour des études plus complètes.
Introduction
Le massage est généralement reconnu comme bénéfique à la fois pour soulager la douleur et l'amélioration de la performance physique chez les athlètes de compétition et les non-athlètes1,2. En fait, des études antérieures ont montré que le massage supprime l'inflammation locale3 et incite à la récupération des dommages musculaires post-exercice4,5. Les mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets bénéfiques du massage restent largement inconnus.
L'une des difficultés avec l'enquête mécaniste sur le massage est liée à la reproductibilité des techniques expérimentales par lesquelles des interventions de massage sont testées. Dans des études antérieures, les procédures expérimentales qui imitent le massage impliquent principalement l'application d'interventions physiques utilisant les parties du corps des praticiens, telles que les paumes et les doigts6,7,8. Il est donc difficile de reproduire avec précision leur ampleur, leur fréquence, leur durée et leur mode.
De nombreux dispositifs ont été développés pour appliquer des charges mécaniques définies sur les tissus cibles. Par exemple, Zeng et coll. ont mis au point un système pneumatique pour la charge mécanique de longueur des membres postérieurs des rats9 et Wang et coll. ont mis au point un dispositif méchatronique qui peut appliquer des charges mécaniques semblables à des massages aux membres postérieurs des rats et des lapins avec contrôle de rétroaction en temps réel10. Par rapport à eux, notre système local de compression cyclique (LCC) est beaucoup plus simple, exigeant beaucoup moins de coûts pour la construction. Néanmoins, nous pouvons reproduire les changements de pression intramusculaire qui sont générés pendant la légère contraction musculaire. À l'aide de ce dispositif, nous avons démontré avec succès que les interventions mécaniques semblables à des massages modulent la dynamique des fluides interstitiels locaux et atténuent l'atrophie musculaire induite par l'immobilisation11.
Ici, nous décrivons les détails de notre dispositif et le protocole, qui peut aider à explorer les mécanismes moléculaires derrière les effets positifs des exercices et des massages. Les schémas du protocole sont présentés sous la forme d'une figure supplémentaire 1.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées sous l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Centre national de réadaptation pour les personnes handicapées.
1. Immobilisation des membres postérieurs bilatéraux de souris
REMARQUE : Des souris mâles c57BL/6 ont été utilisées pour des expériences à l'âge de 11 - 12 semaines après l'acclimatation pendant au moins 7 jours.
- Anesthésiez adéquatement une souris à l'aide du pentobarbital de sodium (50 mg/kg i.p.). Assurez-vous que les souris ne répondent pas à une pincée d'orteil postérieur.
REMARQUE : Effectuez la procédure d'immobilisation entre 10 h et 19 h afin de minimiser les effets possibles sur l'activité alimentaire des souris. - Appliquer des rubans chirurgicaux sur les membres postérieurs bilatéraux de la souris posés en position de supine avec les articulations du genou prolongées et les articulations de la cheville plantaire.
- Placez un fil d'aluminium (voir Tableau des matériaux) sur le tronc au niveau de la colonne vertébrale L4-5 et enroulez le fil dans une configuration spirale autour des membres postérieurs avec des écarts de 5 mm entre chaque tour de la couche spirale (Figure 1A). Assurez-vous de ne pas enfiler le fil trop étroitement et éviter de perturber le flux sanguin local.
- Pour réduire au minimum la possibilité d'échapper au câblage, immobiliser les articulations de la hanche à la position de l'enlèvement de 90 degrés en ajustant manuellement la configuration du fil d'aluminium.
- Remettez les souris dans leurs cages d'origine. 3 h plus tard, assurez-vous qu'ils récupèrent de l'anesthésie et l'accès à la nourriture et à l'eau comme d'habitude.
- Maison 3 - 6 souris immobilisées par cage comme avant l'immobilisation.
2. Mesure de la pression intramusculaire des muscles gastrocnemius de souris
REMARQUE : Plusieurs poids différents des unités cylindriques (36 g, 66 g, et 200 g) ont été examinés dans les expériences de surveillance de pression combinées avec LCC. Cette mesure a été effectuée séparément des expériences pour analyser l'inflammation et l'atrophie musculaires (voir l'étape 3 - 5 pour plus de détails), c'est-à-dire que les souris soumises à la mesure de la pression n'ont pas été utilisées pour des analyses histologiques.
- Étant donné que la mesure de la pression implique des procédures plus invasives (p. ex., incision de la peau et insertion d'aiguilles) par rapport au câblage des membres postérieurs et au LCC, utilisez un mélange de trois agents anesthésiques (médetomidine 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg, butorphanol 5,0 mg/kg, i.p.). Assurez-vous que les souris ne répondent pas à la pince de l'orteil du membre postérieur.
- Placez la souris en position couchée, faites une incision de 2 mm avec un scalpel sur le mollet postérieur après avoir dépilée avec un rasage électrique et semi-stérilisé la surface de la peau avec 70% d'éthanol et de chlorhexidine imbibé de coton absorbant.
- Insérer une aiguille de 20 G dans le muscle gastrocnemius à un angle obtus (150 degrés et 170 degrés) à la surface de la peau.
- En utilisant la gaine en plastique de l'aiguille comme guide, placez un capteur du télémètre de pression artérielle (voir Tableau des matériaux) dans le ventre moyen du muscle gastrocnemius, puis retirez la gaine du muscle.
- Après avoir sutocisé la peau avec 4-0 suture en nylon, appliquer LCC avec plusieurs poids différents d'unités cylindriques au veau chez les souris (voir l'étape 3 pour plus de détails), et surveiller la pression intramusculaire à l'aide d'un logiciel pour l'analyse du signal biologique (voir tableau de Matériaux).
- Remettez les souris dans leurs cages d'origine. 3 h plus tard, assurez-vous qu'ils se remettent de l'anesthésie/analgésie et ont accès à la nourriture et à l'eau comme d'habitude.
3. Compression cyclique locale (LCC) sur les veaux de souris
- À l'exception de la mesure de la pression intramusculaire et de l'euthanasie (c.-à-d. la luxation cervicale), utilisez le pentobarbital de sodium (50 mg/kg i.p.) pour l'anesthésie.
- Désengagez la souris du câblage postérieur et placez-la en position couchée avec les articulations du genou prolongées et les articulations de la cheville plantaires de sorte que les mollets face vers le haut. Ne réparez pas les membres postérieurs de la souris sur la scène.
- Appliquer l'ALCC sur le veau en déplaçant verticalement une unité de poids cylindrique (figure 1B) recouverte d'un coussin(figure 1C)à 1 Hz pendant 30 min par jour, 7 jours.
- Après chaque accès de LCC quotidien, re-filer les membres postérieurs de la souris.
4. Analyse immunohistochimique du gastrocnemius
- Euthanasier la souris par luxation cervicale sous anesthésie adéquate/analgésie par injection intrapéritonéale d'un mélange de trois agents anesthésiques (médetomidine 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg, butorphanol 5,0 mg/kg).
- Après avoir dépilé la surface postérieure du mollet, faire une incision de la peau, et disséquer les muscles gastrocnemius en se séparant de l'os tibio-fibulaire à l'aide d'un ciseaux chirurgicaux et les congeler rapidement dans une solution optimale de température de coupe composé.
- À l'aide d'un cryostat, préparer des échantillons de cryosection des muscles gastrocnemius sur des lames de verre. Conserver les échantillons dans un congélateur de -80 oC jusqu'à l'analyse.
- Sortez les échantillons de cryosection gastrocnemius à analyser du congélateur et déshydratez-les par séchage à l'air à température ambiante.
- Utilisez un stylo bloqueur liquide pour dessiner une zone qui comprend toutes les cryo-sections sur la diapositive. Le cercle empêchera les solutions de s'écouler de la diapositive.
- Évitez de sécher les échantillons en plaçant les glissières dans un plateau dans lequel un environnement humide est créé avec du papier imbibé d'eau.
- Appliquer 100 l de tampon de blocage (saline tamponnée de phosphate (PBS) contenant 0,25 % de caséine, de protéine porteuse et 0,015 M d'azide de sodium) pendant 30 min à température ambiante.
- Rincer les diapositives deux fois en couvant avec PBS-T (PBS contenant 0,1% de polyoxyéthylène sorbitan monolaurate (voir Tableau des matériaux) pendant 5 min.
- Appliquer 100 l d'anticorps primaires dilués avec du PBS sur chaque échantillon, couvrir le plateau d'un couvercle et couver toute la nuit à température ambiante.
- Laver 3 fois avec PBS-T (5 min pour chaque lavage).
- Appliquer 100 l d'anticorps secondaire dilué avec du PBS sur chaque échantillon et couver pendant 1 h à température ambiante.
REMARQUE : Pour la coloration anti-laminin, utilisez l'anticorps secondaire Alexa Fluor 568-conjugué. Pour les anti-F4/80, les anti-MCP-1 et les anti-TNF-MD, utilisez un anticorps secondaire Alexa Fluor 568 ou 488 conjugués. - Laver 3 fois avec PBS-T (5 min pour chaque lavage).
- Appliquer 100 l l de solution DAPI diluée avec PBS-T sur chaque échantillon et couver pendant 3 min à température ambiante.
- Laver 3 fois avec PBS-T (5 min pour chacun).
- Monter les échantillons avec le milieu de montage et les recouvrir de couvertures.
5. Analyse histo-morphométrique du gastrocnemius
- Placez les diapositives de l'échantillon sur un microscope à fluorescence (voir tableau des matériaux)et affichez les échantillons à l'aide d'un objectif de 20 degrés à l'aide de filtres appropriés (DAPI-B, 360/40 nm pour l'excitation et 460/50 nm pour l'émission; GFP-B, 470/40 nm pour l'excitation et 535/50 nm pour l'émission; FRITC, 540/25 nm pour l'excitation et 605/55 nm pour l'émission.
- À l'aide du logiciel d'analyse d'images (voir tableau des matériaux),mesurez la zone transversale (CSA) de chaque myofibre, et comptez le nombre de cellules F4/80-, MCP-1-, et TNF---positifs.
REMARQUE : Déterminez l'ASC de chaque myofibre en traçant la marge interne de la membrane de sous-sol visualisée avec l'immunostaining anti-laminin-2.
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Representative Results
Conformément à nos observations précédentes12, l'ASC des myofibres gastrocnemius a été considérablement diminuée par immobilisation postérieure(figure 2A,B). En outre, notre analyse de coloration d'immunofluorescence a indiqué que les cellules exprimant MCP-1 et TNF-, qui jouent tous les deux des rôles clés en réglant des processus inflammatoires13,14, sensiblement augmenté dans le muscle gastrocnemius tissus des membres postérieurs immobilisés (MCP-1 : Figure 2C,F,H; TNF-: Figure 2D,G,I). Avec l'augmentation des cellules positivement tachées avec F4/80, un marqueur pour les macrophages (Figure 2C-E,H,I), l'immobilisation des membres postérieurs semblait provoquer l'atrophie musculaire du mollet impliquant des réponses inflammatoires locales, y compris l'accumulation de macrophages. Nous avons alors cherché à examiner si LCC, une intervention mécanique mass-like, a modulé cette inflammation et atrophie musculaires induites par l'immobilisation.
Parmi plusieurs magnitudes LCC différentes que nous avons testées en modifiant le poids de l'unité cylindrique, celle correspondant à des ondes de pression intramusculaire de 50 mmHg (LCC avec 66 g, Figure 3A) semblait alléger le plus efficacement diminution induite par l'immobilisation de l'ASC myofibre et augmentation de l'accumulation de macrophage dans les muscles gastrocnemius (Figure 3B). Basé sur les résultats de l'ACS myofibre et de l'accumulation de macrophage, nous avons employé 66 g LCC pour d'autres études. Notamment, les ondes de pression intramusculaire induites par le LCC, dont les magnitudes maximales dépendaient du poids de l'unité cylindrique, étaient très uniformes (figure 3A), indiquant la cohérence et la reproductibilité de LCC en tant qu'intervention mécanique sur muscles squelettiques.
LCC (1 Hz, 30 min par jour, 7 jours) a considérablement atténué les diminutions induites par l'immobilisation des muscles gastrocnemius myofiber(figure 4A,B). De plus, LCC a partiellement tempéré la diminution induite par l'immobilisation de la force contractante des muscles des triceps surae (figure 4C). De plus, LCC a tempéré l'augmentation des cellules F4/80-positives, TNF---positive, F4/80-, MCP-1-, et TNF----positive dans les tissus musculaires gastrocnemius des membres postérieurs immobilisés (F4/80, figure 4D,F; MCP-1, Figure 4D,G; TNF-, Figure 4E,H). Collectivement, LCC, qui génère des ondes de pression intramusculaire avec une amplitude de 50 mmHg, a atténué l'atrophie musculaire induite par l'immobilisation et les réponses inflammatoires locales, y compris l'accumulation de macrophages.
Figure 1 : Immobilisation bilatérale de la souris et application de compression cyclique locale (LCC).
(A) Les membres postérieurs bilatéraux de souris ont été immobilisés par le câblage en spirale avec les joints de hanche enlevés, les joints de genou prolongés, et les joints plantaires de cheville-flexed. (B) Dispositif LCC. (C) Mise en place expérimentale pour LCC sur le veau de souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : L'immobilisation de l'arrière-pays de la souris, qui atrophie les muscles du mollet, induit une réponse inflammatoire locale.
(A) Images micrographiques transversales de la coloration immunofluorescence d'anti-laminin-2 des muscles de gastrocnemius. Les images de grossissement élevé (à droite) se réfèrent aux zones indiquées par des rectangles dans les images de grossissement faible (à gauche). Barres d'échelle, 100 m. (B) Atrophie musculaire induite par l'immobilisation. CSA des myofibers de gastrocnemius a diminué avec la période de l'immobilisation de membre postérieur. Pour quantifier l'ASC, 100 myofibres ont été choisies au hasard. Les données sont présentées comme des moyens : S.D., P et lt; 0,05, ANOVA à sens unique avec test Bonferroni post hoc (n ' 3 souris pour chaque groupe). (C et D) Images micrographiques de l'immunostaining anti-MCP-1 (vert en C) et anti-TNF-MD (vert en D) et anti-F4/80 (rouge). Pour la présentation fusionnée (verte et rouge), les images de grossissement bas et élevés sont posées comme dans (A). Les flèches indiquent des cellules doubles positives pour les barres d'échelle F4/80 et MCP-1 (C) ou TNF-MD (D), 100 m. (E-I) Quantification de l'immunostaining anti-MCP-1, anti-TNF-MD et anti-F4/80. Les effets de l'immobilisation ont été analysés en référence à la période d'immobilisation bilatérale des membres postérieurs. L'analyse statistique a été effectuée en référence aux échantillons du « Jour 0 » (muscles gastrocnemius de souris qui n'ont pas été soumis à l'immobilisation). Les données sont présentées comme des moyens : S.D., P et lt; 0,05, ANOVA à sens unique avec test Bonferroni post hoc (n ' 3 souris pour chaque groupe). Ce chiffre a été modifié avec la permission11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Effets de LCC avec différentes magnitudes sur l'atrophie musculaire induite par l'immobilisation et la réponse d'inflammation.
(A) Application de différentes magnitudes de LCC en changeant le poids de l'unité cylindrique. Barre à l'échelle, 1 s. 36 g, 66 g et 200 g unités cylindriques produites 45 mmHg, 50 mmHg et 140 mmHg ondes de pression intramusculaire, respectivement. (B) Comparaison des effets de l'application de LCC aux membres postérieurs immobilisés avec des unités cylindriques de 36 g, 66 g et 200 g. L'ASC des myofibres gastrocnemius (à gauche) et des cellules F4/80-positives (droite) du veau LCC-appliqué ont été quantifiées en tant que valeurs relatives à ceux du membre postérieur témoin, qui n'a pas été exposé au LCC, dans chaque souris. Les données sont présentées comme des moyens : S.D., P et lt; 0,05, ANOVA à sens unique avec test Bonferroni post hoc (n - 4 souris pour chaque groupe). Ce chiffre a été modifié avec la permission11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Le LCC atténue l'atrophie musculaire induite par l'immobilisation et la réponse inflammatoire.
(A,B) Allègement de l'atrophie musculaire induite par l'immobilisation par application de LCC. L'ASC des myofibres gastrocnemius (B) a été analysée comme dans la figure 2B. Les données sont présentées comme des moyens : S.D., P et lt; 0,05; P ' lt; 0.01, anoce-sens unidirectionnelle avec test post hoc Bonferroni (n - 6 souris pour chaque groupe). (C) La diminution de la force contractante des muscles de surae de triceps après immobilisation et sa restauration partielle par LCC. Les données sont présentées comme des moyens : S.D., P et lt; 0,05, test t de l'étudiant jumelé (n ' 4 souris pour le contrôle, n ' 5 souris pour le groupe d'immobilisation). (D,E) Les images micrographiques de l'anti-MCP-1 (vert en D), de l'anti-TNF-MD (vert en E) et de l'immunofluorescence anti-F4/80 (rouge) de coloration des muscles gastrocnemius des muscles gastrocnemius mobilisés (en haut) et des postérieurs immobilisés sans (milieu) et avec (en bas) l'application DeCC sont présentées comme figure 2C,D. Barres d'échelle, 100 m. (F-H) Quantification de l'immunostaining anti-MCP-1, anti-TNF et anti-F4/80. Nous avons comparé les muscles de veau des membres postérieurs immobilisés avec et sans application de LCC. Les données sont présentées comme des moyens : S.D., P et lt; 0,05; P ' lt; 0.01, anoce-sens unidirectionnelle avec test post hoc Bonferroni (n - 6 souris pour chaque groupe). Ce chiffre a été modifié avec la permission11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Représentation schématique des protocoles expérimentaux. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.
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Discussion
Nous avons décrit une méthode pour appliquer un stimulus mécanique massage-like, qui a des effets anti-inflammatoires. Notre système a des avantages suivants, même par rapport à ceux signalés précédemment. Tout d'abord, les études précédentes n'ont pas défini quantitativement les forces mécaniques appliquées2 ou défini leurs magnitudes en fonction de la mesure à la surface du corps, mais pas à l'intérieur des tissus10. En revanche, nous avons mesuré la pression intramusculaire à l'aide d'un télémètre de pression artérielle. Deuxièmement, la structure simple de notre appareil (figure 1B) nous a permis de construire le système avec une grande cohérence et reproductibilité (Figure 3A) à un coût relativement faible. Troisièmement, notre intervention (LCC) se rapporte à l'activité physique (contraction musculaire légère) en ce qui concerne les changements de pression intramusculaire (50 mmHg15). Notre approche fournira une base scientifique pour l'intervention de massage-comme une procédure thérapeutique/préventive possible qui diminue l'inaptitude de l'inactivité physique16.
L'étape la plus critique de notre protocole est le positionnement des membres postérieurs de la souris (étape 3.3 du protocole). Nous devons appliquer LCC dans la direction perpendiculaire aux muscles du mollet; sinon, les tissus musculaires seront partiellement pressés et endommagés même lorsque l'unité cylindrique de 66 g est utilisée.
La limitation de la méthode LCC comprend l'exigence d'anesthésie, qui peut avoir certains effets sur le métabolisme musculaire. En outre, nous ne pouvons pas exclure entièrement les influences de la contraction musculaire minuscule qui peut être causée comme un réflexe à des impacts brusques lors de l'application LCC.
En conclusion, nous avons démontré que le mouvement fluide interstitiel médiatise les effets LCC11. Nous pouvons être en mesure d'induire un flux interstitiel plus efficacement en modifiant le mode de compression cyclique. Par exemple, la compression du mode sinusoïdal peut être meilleure par rapport aux coups aigus utilisés dans notre étude actuelle.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas d'intérêts concurrents associés au manuscrit.
Acknowledgments
Nous remercions K. Nakanishi, K. Hamamoto, N. Kume et K. Tsurumi pour leur soutien constant tout au long du projet. Ce travail a été en partie soutenu par le Fonds de recherche intra-muros du ministère japonais de la Santé, du Travail et du Bien-être social; Subventions d'aide pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science; Programme soutenu par MEXT pour la Fondation de recherche stratégique des universités privées, 2015-2019 du ministère japonais de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (S1511017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum wire | DAISO JAPAN | B028 | An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire |
| Blood pressure telemeter | Millar | SPR-671 | A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy. |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500) | Invitrogen | A11034 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500)) | Invitrogen | A11077 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| ImageJ | NIH | N/A | Analysis software for image |
| LabChart8 | ADInstrumens | Analysis software for acquiring biological signals. | |
| Prolong gold | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Prolong gold is for mounting stained samples. |
| Protein Block Serum-Free | Dako | X090930-2 | For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures. |
| Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Sigma Aldrich | L0663 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500) | Abcam | ab6640 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab25124 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab66579 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Surgical tape | 3M Japan | 1530EP-0 | Surgical tape is used to restrict joint movement. |
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