Summary
ここでは、定義された機械的負荷をマウスの子牛に適用し、それに付着する筋肉内圧力変化を監視するためのプロトコルについて説明する。我々が開発した実験システムは、身体運動やマッサージの有益な効果の背後にあるメカニズムを調べるための有用性がある。
Abstract
マッサージは、一般的に痛みや炎症を緩和するために有益であると認識されています。以前の研究は、骨格筋にマッサージの抗炎症効果を報告しているが, 背後にある分子メカニズムが十分に理解されていません。.我々は最近、振幅の変化で筋肉内圧力波を発生させることができる局所周期的圧縮(LCC)を適用する簡単な装置を開発した。この装置を用いて、LCCは、その中でマクロファージの炎症反応を調節し、固定化誘発筋萎縮を緩和することを実証した。ここでは、LCCの最適化と適用に関するプロトコルを、マウス後肢の骨格筋の固定化誘発炎症および萎縮に対するマッサージ様介入として説明する。我々が開発したプロトコルは、身体運動やマッサージの有益な効果の根底にあるメカニズムを調査するのに役立ちます。我々の実験システムは、筋肉恒常症の機械的調節を解明するための分析アプローチのプロトタイプを提供するが、より包括的な研究のためにさらなる開発を行う必要がある。
Introduction
マッサージは、一般的に、痛みの軽減と競争力のある選手と非アスリートの間の物理的なパフォーマンスの改善の両方に有益であると認識されています1,2.実際、以前の研究では、マッサージが局所的な炎症3を抑制し、運動後の筋肉損傷4、5からの回復を促すことが示されている。マッサージの有益な効果の根底にある分子メカニズムは、ほとんど知られていないまま.
マッサージに関する機械的調査の難しさの一つは、マッサージのような介入がテストされる実験技術の再現性に関する。以前の研究では、マッサージを模倣する実験的処置は、主に手のひらや指などの開業医の身体部分を使用した物理的介入の適用を伴う6、7、8。そのため、大きさ、周波数、持続時間、モードを正確に再現することが困難になります。
多くの装置は、定義された機械的負荷を標的組織に適用するために開発された。例えば、Zeng et al.はラットの後肢9に対する長さごとの機械的負荷のための空気システムを開発し、Wangららはラットとウサギの後肢にマッサージのような機械的負荷を適用できるメカトロニクスデバイスを開発しました。リアルタイムフィードバックコントロール10.それらに比べて、私たちのローカル周期的な圧縮(LCC)システムははるかに簡単で、建設のためのはるかに少ないコストを要求します。それにもかかわらず、軽度の筋肉収縮時に発生する筋肉内圧変化を再現することができます。この装置を用いて、我々は、マッサージのような機械的介入が局所間質流体力学を調節し、固定化誘発筋萎縮11を緩和することを実証した。
ここでは、エクササイズやマッサージの肯定的な効果の背後にある分子メカニズムを探求するのに役立つ可能性のあるデバイスとプロトコルの詳細を説明します。プロトコルの回路図は、補足図 1として示されます。
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Protocol
すべての動物実験は、国立障害者リハビリテーションセンターの施設動物ケア利用委員会の承認を得て実施されました。
1. マウスの両側後肢の固定化
注:オスC57BL/6マウスは、少なくとも7日間順化後11〜12週間の実験に使用した。
- ペントバルビタールナトリウム(50mg/kg i.p.)を用いてマウスを適切に麻酔する。マウスが後肢のつま先のピンチに反応しないことを確認します。
注:マウスの摂食活動に及ぼす影響を最小限に抑えるために、午前10時から午後7時の間に固定化の手順を行います。 - 膝関節を拡張し、足首関節の足底屈曲を持つ上の位置に置かれたマウスの両側の後肢に外科テープを適用します。
- L4-5脊椎レベルのトランクにアルミ線(材料の表を参照)を配置し、らせん層の各ターンの間に5mmのギャップを持つ後肢の周りの螺旋状構成でワイヤをコイルします(図1A)。ワイヤーをきつく巻きすぎないようにし、局所的な血流を妨げないようにしてください。
- 配線からの脱出の可能性を最小限に抑えるために、手動でアルミニウムワイヤーの構成を調整することにより、90°の誘拐の位置で股関節を固定する。
- マウスを元のケージに戻します。3時間後、彼らは麻酔から回復し、通常どおり食べ物や水へのアクセスを確認してください。
- ハウス3-6固定化マウスは、固定化前と同様にケージ当たり6匹である。
2. マウス胃腸筋の筋肉内圧の測定
注:LCCと組み合わせた圧力モニタリング実験では、円筒単位(36g、66g、および200g)のいくつかの異なる重量を試験した。この測定は、筋肉の炎症および萎縮を分析する実験とは別に行われた(詳細についてはステップ3-5を参照)、すなわち、圧力測定を受けたマウスは組織学的分析に使用されなかった。
- 圧力測定は、後肢配線およびLCCと比較して、より侵襲的な手順(例えば、皮膚切開および針挿入)を伴うので、3つの麻酔薬(メデトミジン0.75mg/kg、ミダゾラム4.0mg/kg、およびブトルオール5.0mg/kg)の混合物を使用する。i.p.)。マウスが後肢のつま先のピンチに反応しないことを確認します。
- マウスを起こしやすい位置に置き、電気剃毛で脱毛し、70%のエタノールとクロルヘキシジン浸漬吸収性綿で皮膚表面を半殺菌した後、後子牛にメスで2mm切開を行います。
- 皮膚表面に鈍器角(150°–170°)で胃腸筋に20G留置針を挿入します。
- 針のプラスチックシースをガイドとして使用して、血圧テレメータのセンサー(材料の表を参照)を胃腸筋の中腹に置き、筋肉からシースを取り除きます。
- 4-0ナイロン縫合糸で皮膚を縫合した後、マウスの子牛に円筒単位のいくつかの異なる重みを持つLCCを適用し(詳細についてはステップ3を参照)、生体信号分析のためのソフトウェアを使用して筋肉内圧を監視します(表を参照)材料)。
- マウスを元のケージに戻します。3時間後、麻酔/鎮鎮薬から回復し、通常どおり食べ物と水にアクセスできるようにしてください。
3. マウス子牛の局所周期的圧縮(LCC)
- 筋肉内圧測定と安楽死(子宮頸部脱臼)を除き、麻酔にはペントバルビタールナトリウム(50mg/kg i.p.)を使用してください。
- 後肢配線からマウスを外し、膝関節を伸ばし、足首関節の足底を曲げて子牛が上向きに向くように、その位置に置きます。ステージ上でマウスの後肢を固定しないでください。
- クッションパッドで覆われた円筒形の重量ユニット(図1B)を1日30分、7日間1Hzで垂直に動かして、ふくらはぎにLCCを適用します。
- 毎日のLCCの各試合の後、マウスの後肢を再配線します。
4. 胃腸血症の免疫組織化学分析
- 3つの麻酔薬(メデトミジン0.75mg/kg、ミダゾラム4.0mg/kg、ブタルフォルノール5.0mg/kg)の混合物の経皮注射による十分な麻酔/鎮血管下での子宮頸部脱臼によりマウスを安楽死させる。
- 後子ふくらはぎ表面を脱毛した後、皮膚切開を行い、外科用はさみを用いて脛骨骨から分離して胃腸筋を解剖し、最適な切断温度化合物溶液で素早く凍結する。
- クライオスタットを使用して、ガラススライド上の胃腸筋のクライオセクションサンプルを準備します。分析するまで-80°Cの冷凍庫にサンプルを保管します。
- 冷凍庫から分析する胃腸凍結切除サンプルを取り出し、室温で空気乾燥して脱水します。
- 液体ブロッカーペンを使用して、スライド上のすべてのクライオセクションを含む領域を描画します。円は、ソリューションがスライドから流れ出るのを防ぎます。
- 湿った環境が水浸しの紙布で作成されるトレイにスライドを配置することにより、サンプルの乾燥を避けてください。
- 100 μLのブロッキングバッファー(0.25%カゼイン、キャリアタンパク質、および0.015Mアジドを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS))を室温で30分間塗布します。
- PBS-T(0.1%ポリオキシエチレンソルビタン単価を含むPBS)で5分間インキュベーションしてスライドを2回すすいでください。
- 各サンプルにPBSで希釈した一次抗体を100μL塗布し、トレイを蓋で覆い、室温で一晩インキュベートします。
- PBS-Tで3回洗います(各洗浄につき5分)。
- 各試料にPBSで希釈した二次抗体を100μLに塗布し、室温で1時間インキュベートします。
注:抗ラミニン染色には、Alexa Fluor 568-共役二次抗体を使用してください。抗F4/80、抗MCP-1、抗TNF-αの場合は、Alexa Fluor 568-または488結合二次抗体を使用します。 - PBS-Tで3回洗います(各洗浄につき5分)。
- 各サンプルにPBS-Tで希釈したDAPI溶液を100μLで塗布し、室温で3分間インキュベートします。
- PBS-Tで3回洗う(各5分)。
- 取り付け媒体でサンプルを取り付け、カバースリップで覆います。
5. 胃腸血症のヒストモルモメトリック分析
- サンプルスライドを蛍光顕微鏡(材料の表を参照)に配置し、適切なフィルタ(DAPI-B、励起のための360/40 nm、発光のための460/50 nm)で20×目的を使用してサンプルを表示します。GFP-B、励起のための470/40 nmおよび放出のための535/50 nm;FRITC、励起のための540/25 nmおよび放出のための605/55 nm。
- 画像解析ソフトウェア(材料表参照)を使用して、各筋線維の断面積(CSA)を測定し、F4/80-、MCP-1-、およびTNF-α陽性細胞の数をカウントします。
注:抗ラミニン-2免疫染色で可視化された基板膜の内部マージンをトレースすることにより、各筋線維のCSAを決定します。
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Representative Results
我々の以前の観察12と一致して、胃炎筋線維のCSAは後肢固定化によって有意に減少した(図2A,B)。さらに、我々の免疫蛍光染色分析は、MCP-1およびTNF-αを発現する細胞が、いずれも炎症過程13、14を調節する上で重要な役割を果たしていることを明らかにし、胃腸筋において有意に増加した。固定化された後肢の組織(MCP-1:図2C,F,H;TNF-α:図 2D,G,I)。F4/80で陽性染色された細胞の増加と共に、マクロファージのマーカー(図2C-E,H,I)は、後肢の固定化が局所炎症反応を伴うふくらはぎ筋萎縮を誘発するように見えたマクロファージの蓄積。その後、マッサージのような機械的介入であるLCCが、この固定化誘発性筋炎症と萎縮を調節したかどうかを調べようとした。
※ 円筒状ユニットの重量圧の重量を変更して試験したいくつかの異LCC等の重な以下に対しから以下に対応以下に対応以下に対応以下に対以下以下以下以下以下以下以下以下以下以下ミオファイバーCSAの固定化誘発減少および胃腸筋におけるマクロファージ蓄積の増加(図3B)。筋線維CSAとマクロファージ蓄積の結果をもとに、66g LCCを採用してさらなる研究を行いました。特に、ピークマグニチュードが円筒単位重量に依存していたLCC誘発性筋肉内圧力波は、非常に均一であった(図3A)。骨格筋。
LCC(1Hz、1日30分、7日)は、胃筋筋の筋線維CSAにおける固定化誘発減少を有意に緩和した(図4A,B)。さらに、LCCは三頭筋の収縮力の固定化誘発減少を部分的に緩和した(図4C)。さらに、LCCは、固定化後肢の胃結合筋組織におけるF4/80陽性、TNF-α陽性、F4/80--、MCP-1-およびTNF-α陽性細胞の増加を緩和した(F4/80、図4D、F;MCP-1,図 4D,G;TNF-α,図4E,H)。総称して、50mmHgの振幅で筋肉内圧力波を発生させるLCCは、固定化誘発筋萎縮およびマクロファージ蓄積を含む局所炎症反応を緩和した。
図1:マウスの両側後肢固定化および局所周期的圧縮(LCC)アプリケーション。
(A)両側マウスの後肢は、股関節を誘拐し、膝関節を伸ばし、足首関節を曲げたスパイラル配線によって固定化した。(B) LCCデバイス。(C)マウスふくらはぎのLCCの実験的セットアップ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ふくらはぎの筋肉を萎縮させるマウス後肢固定化は、局所的な炎症反応を誘発する。
(A)胃腸筋の抗ラミニン-2免疫蛍光染色の断面顕微鏡画像。高倍率画像(右)は、低倍率画像(左)の長方形で示される領域を指します。スケールバー, 100 μm. (B) 固定化誘発筋萎縮.胃腸筋筋繊維のCSAは、後肢固定化の期間とともに減少した。CSAを定量するために、100の筋線維がランダムに選択された。データは、±S.D.*、P<0.05、ポストホックボンフェローニ試験を有する片道分散分析(各群に対してn=3匹のマウス)として提示される。 (C および D)抗MCP-1(Cの緑色)および抗TNF-α(Dの緑色)および抗F4/80(赤色)免疫染色の顕微鏡画像。マージされたプレゼンテーション(緑と赤)の場合、低倍率と高倍率の画像は(A)のように配置されます。矢印は、F4/80およびMCP-1(C)またはTNF-α(D)スケールバー、100μm(E-I)抗MCP-1、抗TNF-α、および抗F4/80免疫染色の二重陽性細胞を指します。固定化の効果を、両側後肢固定化の期間を参考にして分析した。統計分析は、「0日目」サンプル(固定化を受けていないマウスからの胃筋肉)を参照して行った。データは、±S.D.*、P<0.05、ポストホックボンフェローニ試験を有する片道分散分析(各群に対してn=3匹のマウス)として提示される。 この数値は、アクセス許可11で変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:固定化誘発筋萎縮および炎症反応に対する異なる大きさのLCCの影響
(A)円筒形単位の重量を変更してLCCの大きさを異なる応用。スケールバー、1 s. 36g、66gおよび200gの円筒形単位はそれぞれ45 mmHg、50 mmHgおよび140 mmHgの筋肉内圧力波を作り出した。(B)LCCアプリケーションの固定化後肢に対する効果を36g、66g、200g円筒単位と比較した。LCC適用子牛の胃腸筋筋繊維(左)およびF4/80陽性細胞(右)のCSAを、各マウスにおいて、LCCに曝露されなかった対照後肢の相対値として定量した。データは、±S.D.*、P<0.05、ポストホックボンフェローニ試験を有する片道分散分析(各群に対してn=4匹のマウス)として提示される。 この数値は、アクセス許可11で変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:LCCは固定化誘発筋萎縮および炎症反応を減衰させる。
(A, B)LCCアプリケーションによる固定化誘発筋萎縮の緩和胃腸筋筋繊維(B)のCSAを図2Bのように分析した。データは、平均±S.D.*、P <0.05として提示されます。**, P < 0.01, ポストホックボンフェローニ試験付き一方通行のANOVA (n = 各グループに対して6匹のマウス)(C)固定化後の三頭筋の収縮力の低下及びLCCによる部分的な回復データは、平均±S.D.*、P<0.05、対対学生のt検定(対照用n=4マウス、固定化群用n=5マウス)として提示される。 (D,E)抗MCP-1(Dの緑色)、抗TNF-α(E)および抗F4/80(赤色)の免疫蛍光染色の抗MCP-1の顕微鏡画像(上)と固定化された後肢(中央)なし、および(下)LCCアプリケーションとして提示される図 2C,D.スケールバー、100μm.(F-H)抗MCP-1、抗TNF-α、抗F4/80免疫染色の定量。LCCアプリケーションの有無にかかわらず、固定化後肢のふくらはぎ筋を比較した。データは、平均±S.D.*、P <0.05として提示されます。**, P < 0.01, ポストホックボンフェローニ試験付き一方通行のANOVA (n = 各グループに対して6匹のマウス)この数値は、アクセス許可11で変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:実験プロトコルの概略表現。図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、抗炎症作用を有するマッサージのような機械的刺激を適用する方法を説明した。当社のシステムは、以前に報告されたものと比較した場合でも、次の利点があります。第1に、以前の研究では、2を加える機械的力を定量的に定義したり、体表面での測定に基づいてその大きさを定義したりはしなかったが、組織10の内部には定義されなかった。対照的に、血圧テレメータを用いて筋肉内血圧を測定した。第二に、装置のシンプルな構造(図1B)により、比較的低コストで高い一貫性と再現性を持つシステムを構築することができました(図3A)。第三に、我々の介入(LCC)は、筋肉内圧変化(50 mmHg15)に関する身体活動(軽度の筋肉収縮)に関する。我々のアプローチは、身体的不活動のデメリットを軽減する可能な治療/予防手順としてマッサージのような介入のための科学的基礎を提供します16.
プロトコルで最も重要なステップは、マウスの後肢の位置決めです(プロトコルステップ3.3)。私たちは、ふくらはぎの筋肉に垂直な方向にLCCを適用する必要があります。それ以外の場合は、66g円筒形ユニットを使用した場合でも、筋肉組織が部分的に圧迫され、損傷を受けます。
LCC法の限界は、筋肉代謝にいくつかの影響を与える可能性がある麻酔の要件を含む。また、LCC応用時の反射として引き起こされる可能性のある小さな筋肉収縮の影響を完全に排除することはできません。
結論として、間質流体運動がLCC効果11を媒介することを実証した。周期的圧縮のモードを変更することで、間質流をより効率的に誘導できる可能性があります。例えば、現在の研究で使用されている鋭いストロークと比較して、前弦波モードの圧縮が優れている場合があります。
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Disclosures
著者らは、原稿に関連する競合する利益がないと宣言する。
Acknowledgments
プロジェクトを通じて一貫したご支援を賜り、中西K.浜本、久米N.久米、鶴見K.K.に感謝申し上げます。この研究の一環として、厚生労働省の研究基金が支援しています。日本学術振興会による科学研究助成金文部科学省の私立大学戦略研究財団支援プログラム(2015~2019年)(S1511017)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum wire | DAISO JAPAN | B028 | An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire |
| Blood pressure telemeter | Millar | SPR-671 | A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy. |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500) | Invitrogen | A11034 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500)) | Invitrogen | A11077 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| ImageJ | NIH | N/A | Analysis software for image |
| LabChart8 | ADInstrumens | Analysis software for acquiring biological signals. | |
| Prolong gold | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Prolong gold is for mounting stained samples. |
| Protein Block Serum-Free | Dako | X090930-2 | For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures. |
| Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Sigma Aldrich | L0663 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500) | Abcam | ab6640 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab25124 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab66579 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Surgical tape | 3M Japan | 1530EP-0 | Surgical tape is used to restrict joint movement. |
References
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