Summary
यहाँ हम माउस बछड़ों के लिए परिभाषित यांत्रिक भार लागू करने के लिए और सहवर्ती इंट्रामस्क्युलर दबाव परिवर्तन की निगरानी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रयोगात्मक प्रणाली है कि हम विकसित किया है शारीरिक व्यायाम और मालिश के लाभकारी प्रभाव के पीछे तंत्र की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है.
Abstract
मालिश आम तौर पर दर्द और सूजन से राहत के लिए फायदेमंद माना जाता है. हालांकि पिछले अध्ययन ों कंकाल की मांसपेशियों पर मालिश के विरोधी भड़काऊ प्रभाव की सूचना दी है, पीछे आणविक तंत्र खराब समझ रहे हैं. हमने हाल ही में स्थानीय चक्रीय संपीड़न (एलसीसी) लागू करने के लिए एक सरल उपकरण विकसित किया है, जो अलग आयाम के साथ इंट्रामस्क्युलर दबाव तरंगों को उत्पन्न कर सकता है। इस उपकरण का उपयोग करके, हमने दिखा दिया है कि एलसीसी सिटू में मैक्रोफेज की भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को रोकदेता है और स्थिरीकरण-प्रेरित मांसपेशी शोष को कम करता है। यहाँ, हम अनुकूलन और एलसीसी के आवेदन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन स्थिरीकरण प्रेरित सूजन और माउस hindlimbs के कंकाल की मांसपेशियों के शोष के खिलाफ एक मालिश की तरह हस्तक्षेप के रूप में. प्रोटोकॉल है कि हम विकसित किया है शारीरिक व्यायाम और मालिश के लाभकारी प्रभाव अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है. हमारे प्रयोगात्मक प्रणाली मांसपेशी homeostasis के यांत्रिक विनियमन स्पष्ट करने के लिए विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण का एक प्रोटोटाइप प्रदान करता है, हालांकि आगे के विकास के लिए और अधिक व्यापक अध्ययन के लिए किए जाने की जरूरत है.
Introduction
मालिश आम तौर पर दोनों दर्द से राहत और प्रतिस्पर्धी एथलीटों और गैर athletes के बीच शारीरिक प्रदर्शन के सुधार के लिए फायदेमंद माना जाता है1,2. वास्तव में, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मालिश स्थानीय सूजन को दबा3 और बाद व्यायाम मांसपेशियों की क्षति से वसूली का संकेत देता है4,5. मालिश के लाभकारी प्रभाव अंतर्निहित आणविक तंत्र काफी हद तक अज्ञात रहते हैं.
मालिश पर मशीनी जांच के साथ कठिनाइयों में से एक प्रयोगात्मक तकनीक जिसके द्वारा मालिश की तरह हस्तक्षेप का परीक्षण कर रहे हैं की पुन: उत्पादनक्षमता से संबंधित है. पिछले अध्ययनों में, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं है कि मालिश नकल ज्यादातर शारीरिक हस्तक्षेप के आवेदन शामिल चिकित्सकों के शरीर के अंगों का उपयोग कर, जैसे हथेलियों और उंगलियों6,7,8. इससे उनके परिमाण, आवृत्ति, अवधि और विधा को ठीक से पुन: उत्पन्न करना कठिन हो जाता है।
कई उपकरणों को लक्षित ऊतकों के लिए परिभाषित यांत्रिक भार लागू करने के लिए विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, ज़ेंग एट अल ने चूहों के हिंदलिंब्स9 और वांग एट अल के लिए लंबाई-वार यांत्रिक लोडिंग के लिए एक वायवीय प्रणाली विकसित की है। वास्तविक समय प्रतिक्रिया नियंत्रण10| उनकी तुलना में, हमारे स्थानीय चक्रीय संपीड़न (LCC) प्रणाली बहुत आसान है, निर्माण के लिए अब तक कम लागत की मांग. फिर भी, हम इंट्रामस्क्युलर दबाव परिवर्तन है कि हल्के मांसपेशियों में संकुचन के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं पुन: पेश कर सकते हैं. इस उपकरण का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है कि मालिश की तरह यांत्रिक हस्तक्षेप स्थानीय अंतरालीय तरल पदार्थ गतिशीलता modulate और स्थिरीकरण प्रेरित मांसपेशी शोष11को कम.
यहाँ, हम अपने डिवाइस और प्रोटोकॉल है, जो मदद कर सकता है व्यायाम और मालिश के सकारात्मक प्रभाव के पीछे आणविक तंत्र का पता लगाने के विवरण का वर्णन. प्रोटोकॉल की रूपरेखा अनुपूरक चित्र 1के रूप में प्रस्तुत की गई है।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों विकलांग व्यक्तियों के लिए राष्ट्रीय पुनर्वास केंद्र की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के तहत आयोजित किया गया.
1. माउस द्विपक्षीय हिंडिंब्स की अचलीकरण
नोट: पुरुष C57BL/6 चूहों की उम्र में प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया 11 - 12 सप्ताह कम से कम 7 दिनों के लिए acclimation के बाद.
- सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम/किग्रा अर्थात) का उपयोग करके माउस को पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज करें। सुनिश्चित करें कि चूहे एक hindlimb toe चुटकी का जवाब नहीं है.
नोट: चूहों के भोजन गतिविधि पर संभावित प्रभाव को कम करने के लिए सुबह 10 बजे से 7 बजे के बीच स्थिरीकरण की प्रक्रिया का संचालन करें। - घुटने के जोड़ों के साथ एक सुपाच्य स्थिति में रखी माउस के द्विपक्षीय hindlimbs के लिए शल्य चिकित्सा टेप लागू करें बढ़ाया और टखने के जोड़ों plantar-flexed.
- किसी एल्यूमीनियम तार को L4-5 स्पाइन स्तर पर ट्रंक पर रखें तथा तार को विठ्ठल स्तर के प्रत्येक मोड़ के बीच 5 मिमी अंतराल के साथ एक सर्पिल विन्यास में तार को तार ित कर दें। सुनिश्चित करें कि तार को बहुत कसकर तार न करें और स्थानीय रक्त प्रवाह को परेशान करने से बचें।
- तारों से बचने की संभावना को कम करने के लिए, मैन्युअल रूप से एल्यूमीनियम तार के विन्यास का समायोजन करके 90 डिग्री अपहरण की स्थिति में कूल्हे जोड़ों स्थिर.
- चूहों को उनके मूल पिंजरों में वापस करें। 3 ज बाद में, सुनिश्चित करें कि वे संज्ञाहरण से उबरने और हमेशा की तरह भोजन और पानी के लिए उपयोग.
- घर 3 - 6 स्थिर चूहों स्थिरीकरण से पहले के रूप में पिंजरे प्रति.
2. माउस गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों के इंट्रामस्क्युलर दबाव का मापन
नोट: बेलनाकार इकाइयों के कई अलग अलग वजन (36 जी, 66 जी, और 200 जी) दबाव निगरानी एलसीसी के साथ संयुक्त प्रयोगों में परीक्षण किया गया. यह माप मांसपेशियों की सूजन और शोष का विश्लेषण करने के लिए प्रयोगों से अलग से आयोजित किया गया था (अधिक विवरण के लिए चरण 3 - 5 देखें) यानी, दबाव माप के अधीन चूहों हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था।
- क्योंकि दबाव माप अधिक आक्रामक प्रक्रियाओं शामिल है (उदाहरण के लिए, त्वचा चीरा और सुई प्रविष्टि) के रूप में hindlimb तारों और LCC की तुलना में, तीन संवेदनाहारी एजेंटों के मिश्रण का उपयोग करें (medetomidine 0.75 mg/kg, midazolam 4.0 mg/kg, और butorphanol 5.0 mg/ आई.पी.)। सुनिश्चित करें कि चूहे हिंदलिंब को चुटकी का जवाब नहीं देते हैं।
- माउस को प्रवण स्थिति में रखें, एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ depilating और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा की सतह अर्द्ध बाँझ के साथ depilating के बाद पीछे बछड़ा पर एक स्केलपेल के साथ एक 2 मिमी चीरा बनाने- और Chlorhexidine-soaked शोषक कपास.
- त्वचा की सतह के लिए एक अस्पष्ट कोण (150 डिग्री - 170 डिग्री) पर गैस्ट्रोकेनमियस मांसपेशियों में एक 20 जी indwelling सुई डालें।
- एक गाइड के रूप में सुई के प्लास्टिक म्यान का उपयोग करना, रक्तचाप telemeter के एक सेंसर जगह (सामग्री की तालिकादेखें) gastrocnemius मांसपेशियों के मध्य में, और फिर मांसपेशियों से म्यान हटा दें.
- 4-0 नायलॉन सीवन के साथ त्वचा suturing के बाद, चूहों में बछड़ा करने के लिए बेलनाकार इकाइयों के कई अलग अलग वजन के साथ LCC लागू (अधिक जानकारी के लिए चरण 3 देखें), और जैविक संकेत विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इंट्रामस्क्युलर दबाव की निगरानी (तालिका देखें सामग्री)।
- चूहों को उनके मूल पिंजरों में वापस करें। 3 ज बाद में, सुनिश्चित करें कि वे संज्ञाहरण से ठीक हो /
3. माउस बछड़ों पर स्थानीय चक्रीय संपीड़न (LCC)
- इंट्रामस्क्युलर दबाव माप और यूथेनाइज़िंग (यानी, ग्रीवा विस्थापन) को छोड़कर, संज्ञाहरण के लिए सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम/
- माउस को हिंदलिंब तारों से अलग करें और इसे घुटने के जोड़ों के साथ एक प्रवण स्थिति में रखें और टखने के जोड़ों को लचीला बनाया ताकि बछड़ों को ऊपर की ओर का सामना करना पड़े। मंच पर माउस hindlimbs तय नहीं है.
- बछडे पर एलसीसी लागू करें , बेलनाकार भार इकाई (चित्र 1ख) को कुशन पैडसेढककर , दिन में 30 मिनट प्रति दिन, 7 दिन के लिए 1 हर्ट्ज पर लागू करें।
- दैनिक LCC के प्रत्येक मुक्केबाज़ी के बाद, फिर से तार माउस hindlimbs.
4. गैस्ट्रोकेनिमियस का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण
- तीन एनेस्थेटिक एजेंटों के मिश्रण के इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण/एनालेजेसिया के तहत गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था द्वारा चूहे को यूथेनाइज करें (मेडेटोमीडिन 0.75 मिलीग्राम/किग्रा, मिडाज़ोलम 4.0 मिलीग्राम/किग्रा, और ब्यूटोफोरपोल 5.0 मिलीग्राम/किलोग्राम)।
- पीछे बछड़ा सतह depilating के बाद, एक त्वचा चीरा बनाने के लिए, और एक शल्य कैंची का उपयोग कर tibio-fibular हड्डी से अलग करके गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों को विभाजित और जल्दी से उन्हें एक इष्टतम काटने तापमान यौगिक समाधान में फ्रीज।
- एक cryostat का उपयोग करना, कांच स्लाइड पर gastrocnemius मांसपेशियों के क्रायो अनुभाग नमूने तैयार करते हैं. विश्लेषण तक एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूनों को स्टोर करें।
- फ्रीजर से विश्लेषण किया जा करने के लिए gastrocnemius क्रायो अनुभाग नमूने बाहर ले लो और कमरे के तापमान पर हवा सुखाने से उन्हें निर्जलित।
- स्लाइड पर सभी क्रायो-अनुभागों में शामिल क्षेत्र को आरेखित करने के लिए एक तरल अवरोधक पेन का उपयोग करें। वृत्त समाधानों को स्लाइड से बहने से रोकदेगा.
- स्लाइड को ट्रे में रखकर नमूनों को सुखाने से बचें जिसमें पानी से लथपथ कागज के कपड़े से एक नम वातावरण बनाया जाता है।
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बफर (फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) जिसमें 0.25% केसीन, वाहक प्रोटीन, और 0.015 एम सोडियम अज़ीड को अवरुद्ध करने के 100 डिग्री सेल्सियस लागू करें।
- पीबीएस-टी के साथ दो बार इनक्यूबेट करके स्लाइड्स को कुल्ला करें (पीबीएस जिसमें 0.1% पॉलीऑक्सीएथिलीन sorbitan मोनोलॉरेट (सामग्री की तालिकादेखें ) 5 मिनट के लिए।
- प्रत्येक नमूने पर पीबीएस के साथ पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 डिग्री सेल्सियस लागू करें, एक ढक्कन के साथ ट्रे को कवर करें, और कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस-टी (प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट) के साथ 3 बार धोएं।
- प्रत्येक नमूने पर पीबीएस के साथ पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 डिग्री सेल्सियस लागू करें और कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: विरोधी laminin धुंधला के लिए, एलेक्सा फ्लोर 568-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें। विरोधी F4/80 के लिए, विरोधी MCP-1, और विरोधी TNF-जेड, एलेक्सा फ्लोर 568- या 488-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें. - पीबीएस-टी (प्रत्येक धोने के लिए 5 मिनट) के साथ 3 बार धोएं।
- प्रत्येक नमूने पर पीबीएस-टी के साथ पतला डीएपीआई समाधान के 100 डिग्री सेल्सियल लागू करें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस-टी (प्रत्येक के लिए 5 मिनट) के साथ 3 बार धोएं।
- बढ़ते मध्यम के साथ नमूने माउंट और उन्हें coverslips के साथ कवर.
5. गैस्ट्रोकेनिमियस का हिस्टो-मॉर्फोमीट्रिक विश्लेषण
- एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर नमूना स्लाइड प्लेस (सामग्री की मेजदेखें) और उचित फिल्टर के साथ एक 20 डिग्री उद्देश्य का उपयोग कर नमूने को देखने (DAPI-बी, उत्तेजना के लिए 360/40 एनएम और उत्सर्जन के लिए 460/50 एनएम; GFP-बी, 470/40 एनएम उत्तेजना के लिए और उत्सर्जन के लिए 535/ FRITC, 540/25 एनएम उत्तेजना के लिए और उत्सर्जन के लिए 605/
- छवि विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करना (सामग्री की तालिकादेखें), प्रत्येक मायोफाइबर के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र (CSA) को मापने, और F4/80-, MCP-1-, और TNF-जेड-सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या की गणना.
नोट: तहखाने झिल्ली विरोधी laminin-2 इम्यूनोस्टेनिंग के साथ कल्पना के आंतरिक मार्जिन अनुरेखण द्वारा प्रत्येक मायोफाइबर के सीएसए का निर्धारण।
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Representative Results
हमारी पिछली टिप्पणियों के अनुरूप12, गैस्ट्रोकेनियस मायोफाइबर्स के सीएसए में हिंडिम्ब स्थिरीकरण (चित्र 2ए , बी) की कमी काफी कम हो गई थी । इसके अलावा, हमारे इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला विश्लेषण से पता चला कि एमसीपी-1 और टीएनएफ-जेड को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं, जिनमें से दोनों सूजन प्रक्रियाओं को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं13,14, गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों में काफी वृद्धि हुई स्थिर हिंडिम्ब्स के ऊतक (MCP-1: चित्र 2C,F,H; टीएनएफ--जेड: चित्र 2D,G,I) । F4/80 के साथ सकारात्मक रूप से दाग कोशिकाओं में वृद्धि के साथ, मैक्रोफेज के लिए एक मार्कर (चित्र 2सी-ई, एच, मैं), हिंदलिम स्थिरीकरण बछड़ा मांसपेशी शोष को भड़काने के लिए दिखाई दिया जिसमें स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रियाओं सहित मैक्रोफेज संचय। हम तो जांच करने के लिए कि क्या LCC, एक मालिश की तरह यांत्रिक हस्तक्षेप की मांग की, इस स्थिरीकरण प्रेरित मांसपेशियों की सूजन और शोष संग्राहक.
कई अलग अलग LCC परिमाण है कि हम बेलनाकार इकाई के वजन को बदलने के द्वारा परीक्षण के अलावा, एक के लिए इसी 50 mmHg इंट्रामस्क्युलर दबाव तरंगों (एलसीसी के साथ 66 g, चित्रा 3A)सबसे कुशलता से कम करने के लिए दिखाई दिया मायोफाइबर सीएसए में अचलन-प्रेरित कमी और गैस्ट्रोकेनमियस मांसपेशियों में मैक्रोफेज संचय में वृद्धि(चित्र 3 ख)। मायोफाइबर सीएसए और मैक्रोफेज संचय के परिणामों के आधार पर, हमने आगे के अध्ययन के लिए 66 ग्राम एलसीसी का इस्तेमाल किया। विशेष रूप से, एलसीसी प्रेरित इंट्रामस्क्युलर दबाव तरंगों, जिनके शिखर परिमाण बेलनाकार इकाई वजन पर निर्भर थे, अत्यधिक समान थे (चित्र 3ए), पर एक यांत्रिक हस्तक्षेप के रूप में एलसीसी की स्थिरता और पुन: उत्पादनीयता का संकेत कंकाल की मांसपेशियों.
एलसीसी (1 हर्ट्ज, प्रति दिन 30 मिनट, 7 दिन) काफी gastrocnemius मांसपेशियों के मायोफाइबर सीएसए में स्थिरीकरण प्रेरित कम हो जाती है कम (चित्र 4ए, बी)। इसके अलावा, एलसीसी आंशिक रूप से triceps surae मांसपेशियों के करार बल में स्थिरीकरण प्रेरित कमी स्वभाव (चित्र 4C)। इसके अलावा, एलसीसी ने स्थिर हिंदमिलम्ब्स के फ्4/80-सकारात्मक, टीएनएफ-जेड-पॉजिटिव, एफ 4/80-, एम सी पी-1, और गैस्ट्रोसेमिअस मांसपेशियों के ऊतकों में सकारात्मक कोशिकाओं में वृद्धि को स्थिर किया (एफ 4/80, चित्रा 4डी, एफ; MCP-1, चित्रा 4डी,जी; टीएनएफ-जेड, चित्र ांधंत 4ई, ह) सामूहिक रूप से, एलसीसी, जो 50 mmHg के आयाम के साथ इंट्रामस्क्युलर दबाव तरंगों को उत्पन्न करता है, अचलीकरण प्रेरित मांसपेशी शोष और मैक्रोफेज संचय सहित स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम करता है।
चित्र 1: माउस द्विपक्षीय hindlimb अचलीकरण और स्थानीय चक्रीय संपीड़न (LCC) आवेदन.
(ए)द्विपक्षीय माउस हिंडम्स कूल्हे के जोड़ों का अपहरण कर लिया, घुटने के जोड़ों बढ़ाया, और टखने के जोड़ों plantar-flexed के साथ सर्पिल तारों द्वारा स्थिर किया गया. (बी) एलसीसी डिवाइस। (ग)माउस बछिया पर एलसीसी के लिए प्रायोगिक व्यवस्था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: माउस हिंदलिम्ब अचलीकरण, जो atrophies बछड़ा मांसपेशियों, एक स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया लाती है.
(क)गैस्ट्रोकेमियस मांसपेशियों के एंटी-लेमिनिन-2 इम्यूनोफ्लोरेसेंस के क्रॉस-सेक्शनल माइक्रोग्राफिक छवियों। उच्च आवर्धन छवियों (दाएं) कम आवर्धन छवियों (बाएं) में आयतों द्वारा इंगित क्षेत्रों को देखें। स्केल बार, 100 डिग्री मी. (बी) अचलीकरण प्रेरित मांसपेशी शोष. गैस्ट्रोनिमियस मायोफाइबर्स का सीएसए हिंदलिम्ब स्थिरीकरण की अवधि के साथ कम हो गया। सीएसए की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 100 मायोफाइबर बेतरतीब ढंग से चुने गए थे। डेटा का अर्थ है - एस.डी. *, पी एंड एलटी; 0.05, पोस्ट हॉक बोनफेरोनी परीक्षण के साथ एक-तरफा ANOVA (n ] 3 चूहे प्रत्येक समूह के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं। (सी और डी) एंटी-एमसीपी-1 (सी में हरा) और एंटी-टीएनएफ-जेड (डी में हरा) और एंटी-एफ 4/80 (लाल) इम्यूनोस्टेनिंग की माइक्रोग्राफिक छवियों। मर्ज की गई प्रस्तुति (हरा और लाल) के लिए, निम्न और उच्च आवर्धन छवियां (A) के रूप में रखी जाती हैं. तीर F4/80 और MCP-1 (C) या TNF-जेड (डी) स्केल बार, 100 डिग्री सेल्सियस (ई-I) विरोधी MCP-1, विरोधी TNF-जेड, और विरोधी F4/80 इम्यूनोस्टेनिंग के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को दोगुना करने के लिए इंगित करते हैं। द्वि-विक्षिंभी रंधे की अवधि के संदर्भ में स्थिरीकरण के प्रभावों का विश्लेषण किया गया। सांख्यिकीय विश्लेषण 'दिन 0' नमूने के संदर्भ में आयोजित किया गया था (गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों चूहों कि स्थिर करने के अधीन नहीं थे). डेटा का अर्थ है - एस.डी. *, पी एंड एलटी; 0.05, पोस्ट हॉक बोनफेरोनी परीक्षण के साथ एक-तरफा ANOVA (n ] 3 चूहे प्रत्येक समूह के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं। यह आंकड़ा अनुमति11के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: स्थिरीकरण प्रेरित मांसपेशी शोष और सूजन प्रतिक्रिया पर विभिन्न परिमाण के साथ एलसीसी के प्रभाव.
(क)बेलनाकार इकाई के भार को बदलकर एलसीसी के विभिन्न परिमाणों का अनुप्रयोग। स्केल बार, 1 एस 36-जी, 66-जी और 200-जी बेलनाकार इकाइयों का उत्पादन 45 mmHg, 50 mmHg और 140 mmHg इंट्रामस्क्युलर दबाव तरंगों, क्रमशः. (ख)36-जी, 66-जी और 200-जी बेलनाकार इकाइयों के साथ स्थिर हिंड्रोम्स के लिए एलसीसी अनुप्रयोग के प्रभावों की तुलना। gastrocnemius मायोफाइबर्स के सीएसए (बाएं) और F4/80-सकारात्मक कोशिकाओं (दाएं) LCC लागू बछड़ा के उन नियंत्रण hindlimb, जो LCC के संपर्क में नहीं था के लिए रिश्तेदार मूल्यों के रूप में परिमाणित किया गया, प्रत्येक माउस में. डेटा का अर्थ है - एस.डी. *, पी एंड एलटी; 0.05, पोस्ट हॉक बोनफेरोनी परीक्षण के साथ एक-तरफा ANOVA (n ] 4 चूहे प्रत्येक समूह के लिए) के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। यह आंकड़ा अनुमति11के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: एलसीसी स्थिरीकरण प्रेरित मांसपेशी शोष और सूजन प्रतिक्रिया attenuates.
(ए, बी) एलसीसी आवेदन द्वारा स्थिरीकरण प्रेरित मांसपेशी शोष का उन्मूलन। गैस्ट्रोकेनियस मायोफाइबर्स (बी) का सीएसए का विश्लेषण चित्र 2 खके रूप में किया गया था। डेटा का अर्थ है के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं - एस.डी. *, पी और lt; 0.05; * *, पी एंड एलटी; 0.01, पोस्ट हॉक Bonferroni परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA (एन - 6 चूहों प्रत्येक समूह के लिए). (ग) स्थिरीकरण के बाद ट्राइसेप्स सुरे पेशियों के करार बल में कमी और एलसीसी द्वारा इसके आंशिक पुनर्स्थापना। डेटा का अर्थ है - S.D. *, P.lt; 0.05, युग्मित छात्र का टी परीक्षण (n ] 4 चूहों को नियंत्रण के लिए, n $ 5 चूहों को स्थिरीकरण समूह के लिए प्रस्तुत किया जाता है)। (डी, ई) एंटी-एमसीपी-1 (डी में हरे रंग), एंटी-टीएनएफ-जेड (ई में हरे) और एंटी-एफ 4/80 (लाल) इम्यूनोफ्लोरेसेंस की माइक्रोग्राफिक छवियों को जुटाने (ऊपर) के गैस्ट्रोकेनमियस मांसपेशियों के धुंधला और बिना (मध्य) और (नीचे) एलसीसी आवेदन के साथ प्रस्तुत किए जाते हैं चित्र 2सी, डी में। स्केल बार, 100 डिग्री मी.(एफ-एच) एंटी-एमसीपी-1, एंटी-टीएनएफ-जेड, और एंटी-एफ 4/ हम के साथ और LCC आवेदन के बिना immobilized hindlimbs के बछड़ा मांसपेशियों की तुलना में. डेटा का अर्थ है के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं - एस.डी. *, पी और lt; 0.05; * *, पी एंड एलटी; 0.01, पोस्ट हॉक Bonferroni परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA (एन - 6 चूहों प्रत्येक समूह के लिए). यह आंकड़ा अनुमति11के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक चित्र 1: प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए.
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Discussion
हम एक मालिश की तरह यांत्रिक उत्तेजना, जो विरोधी भड़काऊ प्रभाव है लागू करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है. हमारी प्रणाली लाभ निम्नलिखित है, तब भी जब उन लोगों के साथ तुलना में पहले की सूचना दी. सबसे पहले, पिछले अध्ययनों ने मात्रात्मक रूप से यांत्रिक बलों को परिभाषित नहीं किया2 लागू किया या शरीर की सतह पर माप के आधार पर उनके परिमाणको परिभाषित किया, लेकिन ऊतकों के अंदर नहीं10. इसके विपरीत, हम एक रक्तचाप telemeter का उपयोग कर इंट्रामस्क्युलर दबाव मापा. दूसरा, हमारे उपकरण की सरल संरचना (चित्र 1ख) ने हमें अपेक्षाकृत कम लागत पर उच्च संगति और पुन: उत्पादनीयता (चित्र 3क) के साथ प्रणाली का निर्माण करने की अनुमति दी। तीसरा, हमारे हस्तक्षेप (LCC) इंट्रामस्क्युलर दबाव परिवर्तन के संबंध में शारीरिक गतिविधि (हल्के मांसपेशियों में संकुचन) से संबंधित है (50 mmHg15). हमारा दृष्टिकोण मालिश की तरह हस्तक्षेप के लिए एक वैज्ञानिक आधार प्रदान करेगा एक संभव चिकित्सकीय / निवारक प्रक्रिया है कि शारीरिक निष्क्रियता के अवगुण को कम के रूप में16.
हमारे प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम माउस hindlimbs की स्थिति है (प्रोटोकॉल चरण 3.3). हम बछड़ा मांसपेशियों के लिए सीधा दिशा में LCC लागू करने की जरूरत है; अन्यथा, मांसपेशियों के ऊतकों को आंशिक रूप से निचोड़ा और क्षतिग्रस्त हो जाएगा, यहां तक कि जब 66-जी बेलनाकार इकाई का उपयोग किया जाता है।
LCC विधि की सीमा संज्ञाहरण की आवश्यकता भी शामिल है, जो मांसपेशियों के चयापचय पर कुछ प्रभाव हो सकता है. इसके अलावा, हम पूरी तरह से छोटे मांसपेशियों में संकुचन है कि LCC आवेदन के दौरान तेज प्रभावों के लिए एक पलटा के रूप में कारण हो सकता है के प्रभावों को रोक नहीं सकते.
अंत में, हमने दिखा दिया है कि अंतरालीय द्रव आंदोलन LCC प्रभाव11मध्यस्थता करता है। हम चक्रीय संपीड़न के मोड को संशोधित करके अंतरालीय प्रवाह को अधिक कुशलता से प्रेरित करने में सक्षम हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, साइनॉइडी मोड का संपीड़न हमारे वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए गए तीव्र स्ट्रोक की तुलना में बेहतर हो सकता है।
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Disclosures
लेखक ों की घोषणा करते हैं कि पांडुलिपि से कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।
Acknowledgments
हम परियोजना के दौरान उनके लगातार समर्थन के लिए के.Nakanishi, के हमामोतो, एन Kume, और के Tsurumi धन्यवाद. यह काम जापानी स्वास्थ्य, श्रम और कल्याण मंत्रालय से इंट्रामरल रिसर्च फंड द्वारा समर्थित भाग में था; विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान में सहायता; निजी विश्वविद्यालयों में सामरिक अनुसंधान फाउंडेशन के लिए MEXT समर्थित कार्यक्रम, 2015-2019 जापानी शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (S1511017) से.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum wire | DAISO JAPAN | B028 | An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire |
| Blood pressure telemeter | Millar | SPR-671 | A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy. |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500) | Invitrogen | A11034 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500)) | Invitrogen | A11077 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| ImageJ | NIH | N/A | Analysis software for image |
| LabChart8 | ADInstrumens | Analysis software for acquiring biological signals. | |
| Prolong gold | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Prolong gold is for mounting stained samples. |
| Protein Block Serum-Free | Dako | X090930-2 | For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures. |
| Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Sigma Aldrich | L0663 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500) | Abcam | ab6640 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab25124 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab66579 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Surgical tape | 3M Japan | 1530EP-0 | Surgical tape is used to restrict joint movement. |
References
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