Summary
Här beskriver vi protokollen för att tillämpa definierade mekaniska laster på mus kalvar och för övervakning av samtidiga intramuskulärt tryckförändringar. De experimentella system som vi har utvecklat kan vara användbara för att undersöka mekanismen bakom de gynnsamma effekterna av fysisk träning och massage.
Abstract
Massage är allmänt erkänd för att vara fördelaktigt för att lindra smärta och inflammation. Även om tidigare studier har rapporterat antiinflammatoriska effekter av massage på skelettmuskulaturen, de molekylära mekanismerna bakom är dåligt förstådda. Vi har nyligen utvecklat en enkel enhet för att tillämpa lokala cykliska komprimering (LCC), som kan generera intramuskulärt tryckvågor med varierande amplituder. Med hjälp av denna enhet, vi har visat att LCC modulerar inflammatoriska reaktioner av makrofager in situ och lindrar immobilisering-inducerad muskelatrofi. Här beskriver vi protokoll för optimering och tillämpning av LCC som en massage-liknande ingripande mot immobilisering-inducerad inflammation och atrofi av skelettmuskulaturen av musen bakbenen. Det protokoll som vi har utvecklat kan vara användbart för att undersöka mekanismen bakom gynnsamma effekter av fysisk träning och massage. Vårt experimentella system ger en prototyp av den analytiska metoden för att belysa den mekaniska regleringen av muskelhomeostas, även om ytterligare utveckling måste göras för mer omfattande studier.
Introduction
Massage är allmänt erkänd för att vara fördelaktigt för både smärtlindring och förbättring av den fysiska prestandan bland tävlingsidrottare och icke-idrottare både1,2. I själva verket, tidigare studier har visat att massage undertrycker lokal inflammation3 och frågar återhämtning från efter träningen muskel skada4,5. Molekylära mekanismer bakom de positiva effekterna av massage är i stort sett okända.
En av svårigheterna med den mekanistiska utredningen om massage avser reproducerbarheten av experimentella tekniker genom vilka massageliknande interventioner testas. I tidigare studier, experimentella procedurer som imiterar massage främst innebär tillämpning av fysiska ingrepp med hjälp av utövare kroppsdelar, såsom handflator och fingrar6,7,8. Detta gör det svårt att exakt återge deras storlek, frekvens, varaktighet, och läge.
Många enheter har utvecklats för att tillämpa definierade mekaniska laster på målvävnaderna. Till exempel har Zeng et al. utvecklat ett pneumatiskt system för längdmässigt mekanisk lastning till råttor ' hindextremiteter9 och Wang et al. har utvecklat en mekatronisk enhet som kan tillämpa massage-liknande mekaniska laster till bakbenen av råttor och kaniner med feedback-kontroll i realtid10. Jämfört med dem, vår lokala cykliska kompression (LCC) system är mycket enklare, kräver mycket mindre kostnader för byggande. Icke desto mindre, vi kan reproducera de intramuskulära tryckförändringar som genereras under den milda muskelkontraktion. Med hjälp av denna enhet, har vi framgångsrikt visat att massage-liknande mekaniska interventioner modulera lokala interstitiell Fluid dynamik och lindra immobilisering-inducerad muskelatrofi11.
Här beskriver vi detaljerna för vår enhet och protokollet, som kan hjälpa till att utforska de molekylära mekanismerna bakom de positiva effekterna av övningar och massage. Protokollets schematik presenteras som en kompletterande figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes under godkännande av den institutionella djuromsorg och användning kommittén för den nationella rehabiliterings Center för personer med funktionshinder.
1. immobilisering av musen bilaterala bakbenen
Obs: manliga C57BL/6 möss användes för experiment vid en ålder av 11-12 veckor efter acklimatisering i minst 7 dagar.
- På lämpligt sätt bedra en mus med hjälp av natrium pentobarbital (50 mg/kg i.p.). Se till att möss inte svarar på en tå nypa bakben.
Anmärkning: genomföra förfarandet för immobilisering mellan 10 a.m. och 7 p.m. för att minimera de möjliga effekterna på utfodring aktivitet möss. - Applicera kirurgiska band till de bilaterala bakbenen av musen som i liggande läge med knä lederna förlängd och fotled plantar-flexade.
- Placera en aluminiumtråd (se tabell över material) på stammen vid L4-5 ryggrads nivå och spole tråden i en spiral konfiguration runt bakbenen med 5 mm mellanrum mellan varje sväng av spiral lagret (figur 1a). Se till att inte spole tråden för hårt och undvika att störa det lokala blodflödet.
- För att minimera möjligheten att fly från ledningar, immobilisera höftlederna vid positionen av 90 ° bortförande genom att manuellt justera konfigurationen av aluminiumtråd.
- Återlämna mössen till sina ursprungliga burar. 3 h senare, se till att de återhämta sig från anestesi och tillgång till mat och vatten som vanligt.
- Hus 3-6 immobiliserade möss per bur som före immobilisering.
2. mätning av intramuskulärt tryck av mus gastrocnemius muskler
Anmärkning: flera olika vikter på cylindriska enheter (36 g, 66 g och 200 g) testades i experiment med tryckövervakning kombinerat med LCC. Denna mätning utfördes separat från experimenten för att analysera muskelinflammation och atrofi (se steg 3-5 för mer information) dvs. de möss som utsätts för tryck mätning användes inte för histologiska analyser.
- Eftersom tryck mätning innebär mer invasiva ingrepp (t. ex. hud snitt och nål insättning) jämfört med bakbenet ledningar och LCC, använda en blandning av tre anestesimedel (Medetomidin 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg, och butorfanol 5,0 mg/kg, i.p.). Se till att möss inte svarar på bakbenen tå nypa.
- Lägg musen i en liggande position, gör en 2-mm snitt med en skalpell på den bakre kalven efter depilating med en elektrisk rakapparat och semi-sterilisering huden ytan med 70% etanol-och klorhexidin-indränkt absorberande bomull.
- Sätt i en 20 G inneboende nål i gastrocnemius muskeln i en trubbig vinkel (150 °-170 °) till hudytan.
- Med hjälp av plastslida av nålen som en guide, placera en sensor av blodtrycket telemeter (se tabell över material) i mitten av magen av gastrocnemius muskler, och sedan ta bort slidan från muskeln.
- Efter suturering av huden med 4-0 nylon sutur, tillämpa LCC med flera olika vikter av cylindriska enheter till kalven i möss (se steg 3 för mer information), och övervaka intramuskulärt tryck med hjälp av programvara för biologisk signal analys (se tabell över Material).
- Återlämna mössen till sina ursprungliga burar. 3 h senare, se till att de återhämta sig från anestesi/analgesi och har tillgång till mat och vatten som vanligt.
3. lokala cykliska kompression (LCC) på mus kalvar
- Med undantag för intramuskulär tryck mätning och euthanizing (dvs., cervikal dislokation), Använd natrium pentobarbital (50 mg/kg i.p.) för anestesi.
- Lossa musen från bakbenen ledningar och lägga den i en liggande position med knä lederna utvidgas och vristen lederna plantar-böjd så att kalvarna inför uppåt. Fixa inte musen bakbenen på scenen.
- Applicera LCC på kalven genom att vertikalt flytta en cylindrisk viktenhet (figur 1b) täckt med en dyna pad (figur 1c) vid 1 Hz i 30 min per dag, 7 dagar.
- Efter varje omgång dagliga LCC, re-wire musen bakbenen.
4. immunohistokemisk analys av gastrocnemius
- Euthanize musen genom cervikal dislokation under adekvat anestesi/analgesi genom intraperitoneal injektion av en blandning av tre anestesimedel (Medetomidin 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg, och butorfanol 5,0 mg/kg).
- Efter avhårning den bakre kalv ytan, göra en hud snitt, och dissekera gastrocnemius muskler genom att separera från tibio-fibular ben med hjälp av en kirurgisk sax och snabbt frysa dem i en optimal skärtemperatur sammansatta lösning.
- Med hjälp av en kryostat, förbereda Cryo-sektionen prover av gastrocnemius muskler på glas diabilder. Förvara proverna i a-80 ° c frys till analys.
- Ta ut gastrocnemius Cryo-sektionen prover som ska analyseras från frysen och torka dem med lufttorkning i rumstemperatur.
- Använd en vätske blockerare penna för att rita ett område som innehåller alla kryo-sektioner på bilden. Cirkeln kommer att förhindra att lösningarna rinner av bilden.
- Undvik torkning av proverna genom att placera bilderna i ett magasin där en fuktig miljö skapas med vattendränkt pappersduk.
- Applicera 100 μL blockerande buffert (fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 0,25% kasein, bärare protein och 0,015 M natriumazid) i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Skölj glidbanorna två gånger genom att inkuberas med PBS-T (PBS innehållande 0,1% polyoxyetylensorbitanmonolaurat (se tabell över material) i 5 min.
- Applicera 100 μL primär antikropp utspädd med PBS på varje prov, täck facket med ett lock och inkubera över natten vid rumstemperatur.
- Tvätta 3 gånger med PBS-T (5 min för varje tvätt).
- Applicera 100 μL sekundär antikropp utspädd med PBS på varje prov och inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
Anmärkning: Använd Alexa fluor 568-konjugerad sekundär antikropp för färgning av anti-laminin. För anti-F4/80, anti-MCP-1 och anti-TNF-α, Använd Alexa fluor 568-eller 488-konjugerad sekundär antikropp. - Tvätta 3 gånger med PBS-T (5 min för varje tvätt).
- Applicera 100 μL DAPI-lösning utspädd med PBS-T på varje prov och inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta 3 gånger med PBS-T (5 min för varje).
- Montera proverna med monteringsmedel och täck dem med täckglas.
5. histo-morphometrisk analys av gastrocnemius
- Placera prov glasen på ett fluorescensmikroskop (se tabell över material) och se proverna med ett 20 × mål med lämpliga filter (DAPI-B, 360/40 Nm för excitation och 460/50 Nm för utsläpp. GFP-B, 470/40 Nm för excitation och 535/50 Nm för utsläpp; FRITC, 540/25 nm för excitation och 605/55 Nm för emission.
- Använda programvaran för bildanalys (se tabell över material), mäta tvärsnittsarea (CSA) av varje myofiber, och räkna antalet F4/80-, MCP-1-, och TNF-α-positiva celler.
Anmärkning: Bestäm CSA av varje myofiber genom att spåra den inre marginalen av basalmembranet visualiseras med anti-laminin-2 immunofärgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I enlighet med våra tidigare observationer12, CSA av gastrocnemius myofibers minskade signifikant genom bakbenen immobilisering (figur 2A, B). Dessutom avslöjade vår immunofluorescensfärgning att celler som uttrycker MCP-1 och TNF-α, som båda spelar nyckelroller i regleringen av inflammatoriska processer13,14, signifikant ökade i gastrocnemius-muskeln vävnader av immobiliserade bakben (MCP-1: figur 2C, F, H; TNF-α: figur 2D, G, I). Tillsammans med ökningen av celler positivt färgade med F4/80, en markör för makrofager (figur 2C-E, H, i), var hindlem immobilisering att inleda kalv muskelatrofi med lokala inflammatoriska reaktioner inklusive ackumulering av makrofage. Vi försökte sedan undersöka om LCC, en massage-liknande mekanisk intervention, modulerade denna immobilisering-inducerad muskelinflammation och atrofi.
Bland flera olika LCC-magnituder som vi testade genom att ändra vikten på den cylindriska enheten, den motsvarande 50 mmHg intramuskulärt tryckvågor (LCC med 66 g, figur 3a) verkade mest effektivt lindra immobilisering-inducerad minskning av myofiber CSA och ökning av makrofagackumulering i gastrocnemius muskler (figur 3b). Baserat på resultaten av myofiber CSA och makrofagackumulering, vi anställda 66 g LCC för ytterligare studier. I synnerhet var de LCC-inducerade intramuskulära tryckvågorna, vars maximala magnituder var beroende av den cylindriska enhets vikten, mycket enhetliga (figur 3a), vilket indikerar enhetligheten och reproducerbarheten hos LCC som en mekanisk intervention på skelettmuskulaturen.
LCC (1 Hz, 30 min per dag, 7 dagar) avsevärt lindras immobilisering-inducerad minskningar av myofiber CSA av gastrocnemius muskler (figur 4A, B). Vidare, LCC delvis härdat immobilisering-inducerad minskning av upphandlande kraft triceps vaden muskler (figur 4c). Dessutom dämpade LCC ökningarna i F4/80-positiva, TNF-α-positiva, F4/80-, MCP-1-, och TNF-α-positiva celler i gastrocnemius muskelvävnad av immobiliserade bakbenen (F4/80, figur 4D, F; MCP-1, figur 4D, G; TNF-α, figur 4E, H). Kollektivt, LCC, som genererar intramuskulärt tryckvågor med en amplitud på 50 mmHg, lindras immobilisering-inducerad muskelatrofi och lokala inflammatoriska reaktioner inklusive makrofagackumulering.
Figur 1: mus bilateral immobilisering av bakbenen och ett lokalt cykliskt komprimeringsprogram (LCC).
(A) bilaterala mus bakbenen var immobiliserade av spiral ledningar med höftlederna bortförda, knä lederna utvidgas, och vristlederna plantar-böjd. (B) LCC-enhet. Cexperimentellt set-up för LCC på mus kalven. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mus bakbenen immobilisering, som förtvinar vadmusklerna, inducerar en lokal inflammatorisk reaktion.
A) tvärsnitts mikrografiska bilder av anti-laminin-2-färgning av gastrocnemius-muskler i immunofluorescensteknik. Bilder med hög förstoring (höger) refererar till de områden som anges med rektanglar i bilder med låg förstoring (vänster). Skalstreck, 100 μm.B) immobilisering inducerad muskelatrofi. CSA av gastrocnemius myofibers minskade med tiden för hindlem immobilisering. Att kvantifiera CSA, 100 myofibers valdes slumpmässigt. Data presenteras som medel ± SD-*, P < 0,05, enkelriktad ANOVA med post hoc Bonferroni-test (n = 3 möss för varje grupp). (C och D) Mikrografiska bilder av anti-MCP-1 (grön i C) och anti-TNF-α (grön i D) och anti-F4/80 (röd) immunofärgning. För sammanfogad presentation (grön och röd) läggs bilder med låg och hög förstoring som i (A). Pilar pekar på dubbla positiva celler för F4/80 och MCP-1 (C) eller TNF-α (D) skalstreck, 100 μm. (E-I) kvantifiering av anti-MCP-1, anti-TNF-α och anti-F4/80 immunofärgning. Effekter av immobilisering analyserades med hänvisning till perioden av bilaterala bakben immobilisering. Statistisk analys utfördes med hänvisning till "dag 0" prover (gastrocnemius muskler från möss som inte var utsatta för immobilisering). Data presenteras som medel ± SD-*, P < 0,05, enkelriktad ANOVA med post hoc Bonferroni-test (n = 3 möss för varje grupp). Denna siffra har modifierats med tillåtelse11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: effekter av LCC med olika magnitud på immobilisering-inducerad muskelatrofi och inflammation svar.
(A) tillämpning av olika MAGNITUDER av LCC genom att ändra vikten på den cylindriska enheten. Scale bar, 1 s. 36-g, 66-g och 200-g cylindriska enheter producerade 45 mmHg, 50 mmHg och 140 mmHg intramuskulär tryckvågor, respektive. B) jämförelse av effekterna av LCC-ansökan på immobiliserade bakben med 36-g, 66-g och cylindriska enheter på 200 g. CSA av gastrocnemius myofibers (vänster) och F4/80-positiva celler (höger) av LCC-tillämpad kalv kvantifierades som relativa värden till de av kontrollen hindlimb, som inte utsattes för LCC, i varje mus. Data presenteras som medel ± SD-*, P < 0,05, enkelriktad ANOVA med post hoc Bonferroni-test (n = 4 möss för varje grupp). Denna siffra har modifierats med tillåtelse11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: LCC dämpar immobiliseringsinducerad muskelatrofi och inflammatorisk respons.
(a, B) Lindring av immobilisering-inducerad muskelatrofi av LCC ansökan. CSA av gastrocnemius myofibers (B) analyserades som i figur 2b. Data presenteras som medel ± SD-*, P < 0,05; * *, P < 0,01, enkelriktad ANOVA med post hoc Bonferroni-test (n = 6 möss för varje grupp). (C) minskningen av upphandlande kraft triceps vaden muskler efter immobilisering och dess partiella restaurering av LCC. Data presenteras som medel ± SD *, P < 0,05, Parade Students t-test (n = 4 möss för kontroll, n = 5 möss för immobilisering grupp). (D, E) Micrographic bilder av anti-MCP-1 (grön i D), anti-TNF-α (grön i E) och anti-F4/80 (röd) immunofluorescensteknik färgning av gastrocnemius muskler av mobiliserade (topp) och immobiliserade bakbenen utan (mitten) och med (botten) LCC ansökan presenteras som i figur 2C, D. Skala staplar, 100 μm. (F-H) kvantifiering av anti-MCP-1, anti-TNF-α och anti-F4/80 immunofärgning. Vi jämförde vadmusklerna i immobiliserade bakbenen med och utan LCC ansökan. Data presenteras som medel ± SD-*, P < 0,05; * *, P < 0,01, enkelriktad ANOVA med post hoc Bonferroni-test (n = 6 möss för varje grupp). Denna siffra har modifierats med tillåtelse11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: schematisk representation av experimentella protokoll. Vänligen klicka här för att ladda ner figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit en metod för att tillämpa en massage-liknande mekanisk stimulans, som har anti-inflammatoriska effekter. Vårt system har följande fördelar även jämfört med de som rapporteras tidigare. Först, tidigare studier inte kvantitativt definiera de mekaniska krafterna appliceras2 eller definierade deras magnituder baserat på mätningen på kroppsytan, men inte inuti vävnaderna10. I motsats, vi mätt intramuskulärt tryck med ett blodtryck telemeter. För det andra tillät den enkla strukturen i vår apparat (figur 1b) oss att konstruera systemet med hög konsistens och reproducerbarhet (figur 3a) till en relativt låg kostnad. För det tredje avser vår intervention (LCC) fysisk aktivitet (mild muskelkontraktion) när det gäller intramuskulärt tryckförändringar (50 mmHg15). Vår strategi kommer att ge en vetenskaplig grund för massage-liknande intervention som en möjlig terapeutisk/förebyggande förfarande som minskar svagheten fysisk inaktivitet16.
Det mest kritiska steget i vårt protokoll är placeringen av mus bakbenen (protokoll steg 3,3). Vi måste tillämpa LCC i riktning vinkelrätt mot vadmusklerna; annars kommer muskelvävnad delvis pressas och skadas även när 66-g cylindriska enheten används.
Begränsningen av LCC-metoden inkluderar kravet på anestesi, vilket kan ha vissa effekter på muskel metabolism. Dessutom kan vi inte helt utesluta påverkan av små muskelkontraktion som kan orsakas som en reflex till skarpa effekter under LCC ansökan.
Sammanfattningsvis har vi visat att interstitiell vätskerörelse förmedlar LCC-effekterna11. Vi kanske kan inducera interstitiellt flöde mer effektivt genom att ändra läget för cyklisk komprimering. Till exempel kan komprimering av sinusformad läge vara bättre jämfört med skarpa stroke används i vår nuvarande studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några konkurrerande intressen i samband med manuskriptet.
Acknowledgments
Vi tackar K. Nakanishi, K. Hamamoto, N. Kume och K. Tsurumi för deras konsekventa stöd under hela projektet. Detta arbete stöddes delvis av intramural forskningsfond från det japanska ministeriet för hälsa, arbete och välfärd; Bidrag-in-Aid för vetenskaplig forskning från det Japan samhället för befordran av vetenskap; MEXT-stöttat program för strategiska forskningsstiftelsen vid privata universitet, 2015-2019 från det japanska ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (S1511017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum wire | DAISO JAPAN | B028 | An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire |
| Blood pressure telemeter | Millar | SPR-671 | A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy. |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500) | Invitrogen | A11034 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500)) | Invitrogen | A11077 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| ImageJ | NIH | N/A | Analysis software for image |
| LabChart8 | ADInstrumens | Analysis software for acquiring biological signals. | |
| Prolong gold | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Prolong gold is for mounting stained samples. |
| Protein Block Serum-Free | Dako | X090930-2 | For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures. |
| Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Sigma Aldrich | L0663 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500) | Abcam | ab6640 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab25124 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab66579 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Surgical tape | 3M Japan | 1530EP-0 | Surgical tape is used to restrict joint movement. |
References
- Furlan, A. D., Imamura, M., Dryden, T., Irvin, E. Massage for low back pain: an updated systematic review within the framework of the Cochrane Back Review Group. Spine. 34 (16), 1669-1684 (2009).
- Robertson, A., Watt, J. M., Galloway, S. D. R. Effects of leg massage on recovery from high intensity cycling exercise. British Journal of Sports Medicine. 38 (2), 173-176 (2004).
- Waters-Banker, C., Butterfield, T. A., Dupont-Versteegden, E. E. Immunomodulatory effects of massage on nonperturbed skeletal muscle in rats. Journal of Applied Physiology. 116 (2), 164-175 (2014).
- Haas, C., et al. Massage timing affects postexercise muscle recovery and inflammation in a rabbit model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (6), 1105-1112 (2013).
- Crane, J. D., et al. Massage therapy attenuates inflammatory signaling after exercise-induced muscle damage. Science Translational Medicine. 4 (119), 119ra113 (2012).
- Bove, G. M., Harris, M. Y., Zhao, H., Barbe, M. F. Manual therapy as an effective treatment for fibrosis in a rat model of upper extremity overuse injury. Journal of the Neurological Sciences. 361, 168-180 (2016).
- Andrzejewski, W., et al. Increased skeletal muscle expression of VEGF induced by massage and exercise. Folia Histochemica et Cytobiologica. 53 (2), 145-151 (2015).
- Mantovani Junior, N., et al. Effects of massage as a recuperative technique on autonomic modulation of heart rate and cardiorespiratory parameters: a study protocol for a randomized clinical trial. Trials. 19 (1), 459 (2018).
- Zeng, H., Butterfield, S., Agarwal, F., Haq, T., Zhao, Y. An engineering approach for quantitative analysis of the lengthwise strokes in massage therapies. Journal of Medical Devices. 2 (4), (2008).
- Wang, Q., et al. A mechatronic system for quantitative application and assessment of massage-like actions in small animals. Annals of Biomedical Engineering. 42 (1), 36-49 (2014).
- Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
- Onda, A., et al. A New mouse model of skeletal muscle atrophy using spiral wire immobilization. Muscle Nerve. 54 (4), 788-791 (2016).
- Luster, A. D.
- Reid, M. B., Li, Y. P. Tumor necrosis factor-α and muscle wasting: a cellular perspective. Respiratory Research. 2 (5), 269-272 (2001).
- Baumann, J. U., Sutherland, M. D., Hangg, A. Intramuscular pressure during walking: An experimental study using the wick catheter technique. Clinical Orthopaedics Related Research. 145, 292-299 (1979).
- Lee, I., et al. Effect of physical inactivity on major non-communicable diseases worldwide: an analysis of burden of disease and life expectancy. Lancet. 380, 219-229 (2012).
