Summary
整合素张力在各种细胞功能中起着重要作用。利用集成张力传感器, 用 picoNewton (pN) 灵敏度校准整合素张力, 并以亚微米分辨率进行成像。
Abstract
整合素配体键传递的分子张力是整合素通路中的基本机械信号, 在许多细胞功能和行为中发挥着重要作用。为了对高力灵敏度和空间分辨率的图像整合子张力进行校准和图像整合, 我们开发了一种基于 dna 的集成张力传感器 (ITS)。如果维持分子张力, ITS 被激活以荧光, 从而在分子水平上将力转化为荧光信号。ITS 激活的张力阈值可在 10-60 pN 范围内进行调谐, 很好地覆盖了细胞内整合蛋白张力的动态范围。在用 ITS 接枝的基板上, 用荧光显示粘附细胞的整合素张力, 并以亚微米分辨率进行成像。ITS 还与活细胞和固定细胞的细胞结构成像兼容。ITS 已成功地应用于血小板收缩和细胞迁移的研究。本文详细介绍了智能交通系统的合成和应用在整合物传递细胞力研究中的应用。
Introduction
细胞依靠整合素来粘附和施加细胞外基质的细胞力。整合素介导的细胞粘附和力传递是细胞扩散1,2、迁移3,4 和生存5, 6,7的关键。从长期来看, 整合素生物力学信号也会影响细胞增殖8、9、10 和分化11、12.研究人员已经开发出了各种方法来测量和映射细胞矩阵界面上的整合蛋白传递的细胞力。这些方法是基于弹性底层13, 阵列的微柱 14, 或原子力显微镜 (afm)15,16。弹性底层和微柱方法依靠基板的变形来报告细胞应力, 在空间分辨率和力敏感性方面存在局限性。AFM 具有较高的力灵敏度, 但不能同时检测多个点的力, 因此很难绘制整合物传递的细胞力图。
近年来, 在分子水平上研究细胞力的几种技术已经发展起来。开发了一套基于聚乙二醇17、18、蜘蛛丝肽 19和 dna20、21、22 、23的分子张力传感器。可视化和监测分子蛋白传递的张力。在这些技术中, dna 首先被用作张力量系系 (tgt) 的合成材料, tgt 是一种可破坏的链接器, 可调节活细胞22,24中整合素张力的上限。后来, DNA 和荧光共振转移技术结合起来, 首先由陈氏23组和萨拉伊塔第20组创建了基于发夹 dna 的荧光张力传感器。基于发夹 dna 的张力传感器实时报告整合蛋白张力, 已成功地应用于一系列细胞功能21的研究。随后, 王的实验室将 TGT 与氟淬火器对结合起来, 报告整合素张力。这个传感器被命名为 its25,26。ITS 基于双链 DNA (dsDNA), 具有更广泛的动态范围 (10-60 pN) 的整合素张力校准。与基于发夹 dna 的传感器不同的是, ITS 不实时地报告蜂窝力, 而是将所有历史整合事件记录为细胞力的足迹;这种信号积累过程提高了细胞力成像的灵敏度, 即使使用低端荧光显微镜也可以对细胞力进行成像。ITS 的合成相对更方便, 因为它是通过杂交两个单链 Dna (ssDNA) 而产生的。
ITS 是一个18基配对 dsDNA 与生物素、荧光蛋白、淬火剂 (黑洞淬火 2 [BHQ2])27和环状精氨酰糖基环氨酸 (rgd) 肽28作为整合素肽配体 (图 1)结合而成。较低的链与荧光体结合 (Cy3 在本手稿中使用, 而其他染料, 如 Cy5 或亚历克莎系列, 也已被证明是可行的, 在我们的实验室) 和生物素标签, its 被固定在基板上的生物素-阿维丁键。上链与 rgd 肽和黑洞淬火结合, 淬火 cy3 约98% 淬火效率 26,27。根据本文提出的协议, ITS 在基板上的涂层密度约为 1100/μm 2.这是我们先前通过遵循相同的涂层协议29在中和功能化基板上包覆的 18 bp 生物基化 dsdna 的密度。当细胞粘附在涂有 ITS 的基板上时, 整合蛋白通过 RGD 将 its 结合起来, 并将张力传递到 ITS。ITS 有一个特定的张力耐受性 (ttol), 它被定义为在 dsDNA 内机械分离 Its dsDNA 的张力阈值。ITS 被整合蛋白张力断裂导致淬火器与随后发出荧光的染料分离。因此, 将不可见的整合素张力转化为荧光信号, 并通过荧光成像映射细胞力。
为了证明 its 的应用, 我们在这里使用鱼类角化细胞, 这是一种广泛使用的细胞迁移模型,用于细胞迁移研究 30,31, 32, chok1 细胞, 一种常用的非运动细胞系, 和 nih 3t3 成纤维细胞。还对整合素张力和细胞结构进行了成像。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了爱荷华州立大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC, 8-16-8331-i) 的批准。
1. 集成张力传感器的合成
- 自定义和订购 ssDNAs (请参阅材料表)。
注: ssDNA 序列如下所示。上链是/5Thiomc6-dgg AGG acg cg GCC/3BHQ_2/。较低的股如下所示。
12 pn its:5 cycc CCG CGT CCT CCT c/3 bi/3
23 PN IT:5 cycc CCG CGT CCC/BIODT/CCC
33 PN IT:5 cycc CCG CTG Cg/biodt/cct CCC
43 pn its:5 cycc CCG Cc/ibibiodt cgt CCT CCC
54 pn its:5 生物/cycc CCG CGT CGT CCT CCC
在这里,/5Thiomc6-dpc 代表 5 ' 末端的硫醇改性剂 C6s-s (二硫醚)。/3BHQ_2/代表 3 ' 端的黑洞淬火2。分别在 3 ' 端、5 ' 端和内部 DNA 的胸腺胺上进行了生物素化。/Icp-3/表示插入到 ssDNA 内部主干中的 Cy3。这些代码由这里使用的特定商业供应商使用, 在其他 DNA 公司可能有所不同。 - 将 rgd 肽结合到 Shssdna-quencher。
注: 使用的试剂是磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 磺胺酰亚胺基 4-(n-马来酰咪甲基) 环己基-1-羧酸 (磺化-smcc), RGD 肽和三 (2-羧基乙基) 盐酸磷化氢, 也称为 Tce-hl。- 利用 TCEP 溶液对上链 DNA 的硫醇改性剂进行保护。
注: 从商业来源订购的硫醇改性 Dna 以氧化形式运输, 硫磺原子受二硫键保护, 需要在 RGD-DNA 共轭之前减少。TCEP 是一种用于硫醇除保护的无臭还原试剂。- 在300Μl 的水中溶解14.3 毫克的 Tce-hcl。使用 pH 测试纸, 使用 1 M NaOH 溶液 (约 150Μl) 将 TCEP 溶液的 pH 值调整到 ~ 7.2–4. 4。加入纯净水, 使最终体积达到0.5 毫升。最后的 TCEP 浓度为 100 mM。
注: 建议每次都使 TCEP 溶液新鲜, 以实现 DNA 硫醇的脱除。避免长时间储存 TCEP 解决方案。 - 在 TCEP 溶液中加入100μl 的 0.5 m 乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液和400μl 的水。
- 在 PBS 中加入10Μl 的 TCEP + EDTA 溶液, 使其达到20μl 的 1 Mm 硫醇-DNA-BHQ2。让溶液在室温下反应30分钟。
注: 5 ' 硫醇改性剂 C6 S-S 共轭在这个 ssDNA 的二硫键将被 TCEP 切割, 使硫醇基团在接下来的步骤中准备好与马来酰亚胺反应。TCEP 不会干扰以下硫代马来酰亚胺反应;因此, 在这一步之后, 没有必要对 TCEP 进行钝化处理。
- 在300Μl 的水中溶解14.3 毫克的 Tce-hcl。使用 pH 测试纸, 使用 1 M NaOH 溶液 (约 150Μl) 将 TCEP 溶液的 pH 值调整到 ~ 7.2–4. 4。加入纯净水, 使最终体积达到0.5 毫升。最后的 TCEP 浓度为 100 mM。
- 共轭 RGD-NH2与磺化-smcc。
- 在100μl 的 PBS 中溶解5毫克 RGD-NH2 , 以获得 11 mm RGD-NH2。
- 在试管中加入200Μl 的纯净水, 加入2毫克的亚托-smcc (由供应商预先测量)。同时用移液器尖端和大力移液器粉碎亚基-smcc 固体, 以方便将 SMCC 溶解在水中。亚硫酸盐-smcc 的浓度为 23 mM。
注: 由于磺化-smcc 中的 NHS 酯受到水解, 并有几分钟的使用寿命, 因此应在1分钟内完成此溶解步骤, 以避免因水解而导致 NHS 酯过度损失。使用纯净水溶解亚硫-smcc, 因为它在 PBS 或其他缓冲液中的溶解度较差。 - 在 100μl Rgd-nh 2 溶液中加入40μl 的磺基-smcc溶液, 孵育20分钟。
注: 磺气收集体系酯将与 RGDD-NH2中的胺基团发生反应, 形成连接 rgd 和磺化物-smcc 的酰胺键。
- 将 RGD-SMCC 与 Sh-sdna-quencher 结合在一起。
- 将1.2.1 步骤制备的溶液混合, 1.2.2, 在室温下孵育混合物1小时。将溶液移动到4°c 的冰箱上, 让它在一夜之间做出进一步的反应。在上链 DNA 上共轭的硫醇会与马来酰亚胺在亚硫-smcc 上发生反应, 形成一个将 RGD 与上链 DNA 连接的硫醚基团。
- 进行乙醇沉淀, 从未反应的亚硫酸盐-smcc、RGD 和 TCEP 中纯化 Rgdd-sdna-quencher。
- 在-20°c 的冷冻机中, 在15毫升锥形管中冷却10% 乙醇, 至少30分钟。
- 以1:10:25 的体积比混合3m 氯化钠溶液、DNA 溶液和冷冻乙醇。将混合液体保存在-20°c 的冰柜中30分钟或直到 DNA 沉淀。
- 以 10, 000 x g离心液体 30分钟, 丢弃上清液。
- 将 PBS 添加到 DNA 颗粒中。使用光谱仪测量 DNA 浓度。
- (可选)进行 DNA 电泳, 以获得更高的 Rgd-sdna 纯度。
注: 使用上述协议, 约 70%-90% 的 ssDNA 将与 RGD 结合。如果需要更高的纯度, 也可以进行 DNA 电泳, 将共轭 DNA 与未结合的 DNA 分离。- 组装垂直电泳系统。
- 通过混合50毫升的纯净水、20% 的40% 丙烯酰胺凝胶、10倍-硼酸盐-edta (TBE) 缓冲液的8毫升和10% 过硫酸铵 (aps) 的 800Μl, 制备10% 的聚丙烯酰凝胶溶液。
- 在凝胶溶液中加入80μl 四甲基乙二胺 (TEMED)。将溶液倒进电泳系统的玻璃室。插入单孔梳子, 在凝胶上创建井。等待 10分钟, 直到凝胶交联。
- 将 DNA 溶液与100% 甘油混合, 体积比为1:1。取下梳子, 将 DNA 溶液加载到凝胶上。
- 在 200 V 的电压下运行凝胶观察两个 DNA 带, 其中滞后的是共轭 DNA。
- 用共轭 DICE 切割凝胶带, 并将其切割成小块。
- 收集在两个 1.5 mL 离心管与过滤器的切碎凝胶。在每个管中添加500Μl 的 PBS。
- 将 pbs 浸泡的凝胶放在室温下的黑暗地方1天。DNA 将从凝胶块扩散到 PBS 中。
- 通过以 1, 000 x克的方式将管材离心 2分钟, 收集 dna 溶液。
- 进行另一轮乙醇沉淀 (步骤 1.2.4) 来收集 DNA。
- 利用 TCEP 溶液对上链 DNA 的硫醇改性剂进行保护。
- 将 Rgd-sdna-quencher 和染料-Ssdna-bitin 杂交合成 its。
- 以1.1:1 的摩尔比混合上钢绞线和下链 Dna 的溶液。将混合物保持在4°c 过夜, 通过 DNA 杂交产生 its。
注: DNA 杂交的摩尔比为 1.1:1, 而不是1:1。过多的 Rgd-sdna-quencher 用于确保所有 Dysdna-b杂素都能与 Rgd-sdna-quencher 杂交。在表面涂层过程中, 无需杂交的 Rgd-sdna-quencher 将被冲走, 这不会影响 ITS 表面涂层质量。 - 在-20°c 的温度下倾斜并存储 ITS 溶液, 以便进行长期储存。
注: 存储缓冲液为 PBS, 存储浓度一般应在10μm 以上。对于常规使用, ITS 解决方案可以在4°c 下存储数周, 而不会明显的质量恶化。
- 以1.1:1 的摩尔比混合上钢绞线和下链 Dna 的溶液。将混合物保持在4°c 过夜, 通过 DNA 杂交产生 its。
2. 将 its 固定在玻璃底 Petri 盘上制备 ITS 表面
注: 所使用的试剂是生物素化牛血清白蛋白 (Bsa-biin)、avidin 蛋白和 ITS。用冰桶将所有试剂和 PBS 缓冲液冷却到0°c 左右。
- 在 PBS 中将 0.1Μml bsa-生物素的200μl 装入玻璃底培养皿的井 (直径29毫米, 井14毫米)。在4°c 时, 在冰箱中孵化30分钟。Bsa-生物素在玻璃表面被物理吸附。
- 使用移液器从井里取出溶液, 然后将200μl 的 PBS 添加回井中清洗表面。重复此3倍完成清洗。
- 在4°c 条件下, 在井内培养 200μl 50μgml avidin 蛋白30分钟。用 PBS 清洗3倍。在这一步之后, 阿维丁蛋白与 bsa-生物素结合, 并在玻璃表面固定化。
- 在4°c 条件下, 在井内培养 200μl 0.1Μm its 30分钟。用 PBS 用3倍洗碗。将 PBS 留在井中, 直到细胞电镀。在这一步之后, 带有生物素标记的 ITS 与阿维丁蛋白结合, 并在表面固定化。
注: 在 ITS 固定过程中, 对 ITS 涂层质量和均匀性至关重要的一个预防措施是, 千万不要让培养皿表面干涸。将所有试剂和 PBS 保持在4°c 或0°c 左右的冰上, 并在冰桶上, 有助于降低清洗过程中的水分蒸发率, 当 PBS 从井中抽出时。
3. 在 ITS 表面电镀电池
- 培养鱼类角质细胞。
注: 这里, 金鱼 (金银花) 是一个例子, 但其他鱼类物种也可能工作。- 用平尖的从鱼身上摘下一块鱼鳞片。轻轻地将刻度压在玻璃底培养皿的井上, 刻度的内侧与玻璃接触。等待 ~ 30秒, 鱼的鳞片, 以很好地坚持到玻璃表面的菜。
- 添加1毫升的 Iscove 的修改杜尔贝科的培养基 (IMDM) 完整的中等, 以完全覆盖鱼的规模。在室温下, 将培养皿放在黑暗潮湿的盒子里6-48小时。
注: IMDM 培养基含有79% 的 IMDM + 20% 的胎牛血清 (FBS) + 1% 青霉素。不需要额外的氧气或二氧化碳供应。一些浸泡在水中的纸巾卷可以留在盒子里, 以保持盒子里的高湿度。几个小时后, 鱼肉精细胞将作为细胞片从鱼鳞中迁移出去。这可以用组织培养显微镜观察到。这些细胞一般在48小时内存活。
- 分离并在 ITS 表面的角质细胞细胞板。
- 从培养鱼鳞的培养皿中取出培养基。用细胞分离液清洗1x 井, 加入分离液, 覆盖鱼鳞, 孵育3分钟。
注: 细胞分离 EDTA 溶液的配方如下: 100 mL 的 10倍 Hanks 的平衡盐溶液 (HBSS) + 10 ml 的 1 m hepes (pH 7.6) + 10 ml 7.5% 碳酸氢钠 + 2.4 ml 的 500 Mem EDTA + 1 l 的 h 2 o.PH 值调整为7.4。 - 取出所有细胞分离溶液, 加入 IMDM 完整培养基。通过温和的移液分散角质细胞。将电池溶液密度调整到所需水平 (1 x10–1x 10/ml)。将细胞贴在 ITS 表面 (根据第2节准备)。在室温下对细胞进行培养 30分钟, 然后进行成像。
注: 细胞计数可以用血液细胞计完成后, 分离细胞与分离溶液。细胞电镀密度相对较低, 因此角质细胞有足够的表面积进行迁移。
- 从培养鱼鳞的培养皿中取出培养基。用细胞分离液清洗1x 井, 加入分离液, 覆盖鱼鳞, 孵育3分钟。
- 板 Cho-k1 细胞和 NIH 3T3 细胞在 ITS 表面。
注: Cha-k1 细胞的培养基为89% 火腿的 F12 + 10% FBS + 1% 青霉素。NIH 3T3 细胞的培养基为 89% Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) + 10% 小牛血清 (CBS) + 1% 青霉素。培养条件为37°C 和 5% co 2.- 培养 CHI-K1 细胞或 NIH 3T3 细胞到 80%-100% 融合在培养皿 (或培养瓶)。
- 将细胞分离溶液加热至 37°c, 培养培养基。
- 用移液器去除培养皿中的所有培养基。用细胞分离液清洗细胞1x。用分离溶液覆盖细胞, 在37°c 孵育10分钟。
- 通过移液分散细胞。收集电池溶液, 并在 300 x g 离心 3分钟。
- 吸出上清液, 加入完整的培养基或无血清介质。
- 将电池溶液密度调整到所需水平 (1 x10 5–1 x 10/ml)。将细胞排列在 ITS 表面 (根据第2节准备)。在成像前, 在37°c 下将细胞培养1–2小时, 或在录像前30分钟。
4. 成像、视频录制和实时积分张力映射
-
活细胞整合蛋白张力的准实时成像
- 在 ITS 表面孵育角质细胞 (根据第2节准备) 在室温下孵育 30分钟, 或在37°c 的孵化器中在 ITS 表面孵育 Cha-k1 细胞或 NIH 3T3 细胞1小时。
- 将培养皿安装在荧光显微镜舞台上。在曝光时间为1秒的情况下执行细胞力成像。放大倍率为40x 或100x。
- 拍摄 its 图像的视频, 其帧间隔为 20秒, 对于角质细胞, 或1-2分钟的 CHI-K1 细胞或 NIH 3T3 细胞。
- 使用 MATLAB 或其他图像分析工具从当前帧中减去 ITS 视频的前一帧, 以计算在最新帧间隔中新产生的 ITS 信号。新产生的 ITS 信号表示在最新帧间隔内产生的整合蛋白张力, 从而以准实时的方式报告细胞力。
-
免疫染色细胞整合素张力与细胞结构的协象
- 在3.2.2 或一步3.3.6 后, 进行免疫染色以标记目标结构蛋白。
注: 使用不同的染料, 以避免整合素张力成像和细胞结构成像之间的荧光串扰。在这份手稿中, Cy5 荧光体被用于 phalloidin, 亚历克莎488用于长春新素染色。原代抗体和二级抗体的浓度均为2.5μgml。Phalloidin 的浓度为 1.5 unitsμμl。 - 执行多荧光通道成像, 以获得整合素张力图和细胞结构成像。
- 在3.2.2 或一步3.3.6 后, 进行免疫染色以标记目标结构蛋白。
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Representative Results
利用 ITS 捕获了鱼类角质细胞的整合素张力图。它表明, 角质细胞在两个力轨迹上迁移并产生整合素张力 (图 2 a)。力图的分辨率被校准为 0.4μm (图 2B)。高整合素张力集中在后缘 (图 3 a)。ITS 还显示了不同细胞的不同特定模式。非运动细胞 NIH-3T3 形成了与快速迁移的角质形成细胞的特定整合蛋白张力模式 (图 3b) 有很大的不同。
对鱼类角质细胞的免疫染色、局灶性粘连和整合素张力进行了共成像 (图 4a)。本文25人详细研究了角质形成细胞中整合素张力与细胞结构的关系.在 Cho-k1 细胞中也对整合素张力和应力纤维进行了共成像 (图 4b)。这些实验表明, ITS 可以在相似的成像环境下同时对细胞粘附力和细胞结构进行共成像, 从而促进细胞结构/力相互作用的研究。
图 1: 智能交通系统的原理图.ITS 是用 RGD 配体、荧光检测器、染料和生物素标签装饰的 dsDNA。染料 (绿色填充的圆圈) 被淬火器淬火。在整合蛋白张力下, dsDNA 破裂, 细胞从淬火中解脱出来, 并发出荧光显微镜检测到的荧光。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 鱼角质细胞的整合素张力图和 its 的亚微米分辨率.(A) 在快速迁移过程中, 角状细胞在两个力轨迹中持续生成整合素张力图。(B) 两个力轨之间的距离通常为40μm。ITS 成像的细胞力图的空间分辨率约为0.4μm。为校准细胞力成像中的分辨率, 计算左下角面板中带有短红线标记的区域的 Cy3 荧光强度的线性轮廓。结果显示在右下角面板中, 并配以高斯曲线。刻度栏 = 10μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 鱼类角质形成细胞和 NIH-3T3 的实时整合物张力图.(A) 鱼类角质形成细胞及其整合素张力图。(左上角)一种运动鱼角质形成细胞。(左下角)ITS 报道的角质形成细胞的整合素张力图。(右上角)通过框架减法得到了实时积分张力。结果表明, 新产生的整合蛋白张力与细胞后缘同相化。(右下角)在一个合并的图中, 给出了整合图 (绿色) 和实时积分张力图 (品红色)。刻度条 = 10μm (b) Nih-3t3 成纤维细胞及其整合素张力图。(左上角)NIH-3T3 成纤维细胞。(左下角)NIH-3T3 成纤维细胞的整合素张力图。整合素张力是在条纹图案中产生的。(右上角)实时整合蛋白张力表明, 新产生的整合素张力主要形成于细胞外周区。(右下角)在一个合并的图中, 给出了整合图 (绿色) 和实时积分张力图 (品红色)。刻度栏 = 10μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 整合蛋白张力和细胞结构的协象.(A) 角质形成细胞中整合素张力、长春花素和 f 肌动蛋白的协象。角质形成细胞固定和免疫染色, 以报告长春新蛋白和 f-肌动蛋白。(B) cho-k1 细胞中整合素张力、长春花素和 f-肌动蛋白的共同成像。刻度栏 = 10μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
ITS 是一种高度可访问但功能强大的细胞力映射技术, 在合成和应用方面都是有效的。在所有材料准备好的情况下, ITS 可以在1天内合成。在实验过程中, 在细胞电镀之前只需要三个步骤的表面涂层。最近, 我们进一步简化了涂层程序, 将 ITS 与牛血清白蛋白直接连接, 从而使 ITS 能够直接物理吸附到玻璃或聚苯乙烯表面 33.ITS 将细胞力信号的荧光强度提升到可比的细胞结构成像水平。易于合成和样品制备, 对显微镜要求有限, 对细胞力的敏感性高, 使 ITS 成为研究细胞力学的一种稳健可靠的技术。本文介绍了 ITS 合成和应用的综合程序。
将 RGD 配体与 ssDNA 结合是 ITS 合成中最关键的过程。正如协议部分所提到的, 亚管-smcc 的 NHS 酯在水中并不稳定。在水中溶解磺-smcc 所需的时间越长, 就越多的磺酸-smcc 酯失去 nhs 酯来水解并成为 "哑弹", 通过马来-硫醇反应与 dna 结合, 但未能与 RGD-NH2 结合。因此, 很大一部分 DNA 分子将被死的磺酸-smcc 占据, 无法与 RGD 连接, 导致 ssDNA-RGD 的低产率。因此, 应快速在水中溶解磺-smcc, 一般在1分钟内完成。还建议用电泳技术检测 Sdna-rgd 的收率。如果产量高于 80%, 一般不需要净化。否则, 建议使用聚丙烯酰胺凝胶进行 DNA 纯化。聚丙烯酰胺凝胶对 DNA 的回收率约为 60%-80%。
要合成合理数量的 RGD-ssDNA-BHQ2, 硫醇-Sdna-bhq2的起始量应至少为 20 nmol (1 Mm x 20μl)。请注意, DNA 修改可显著减少从 DNA 公司订购的 ssDNA 的数量。例如, 如果订购了两个修改的 1, 000 nmol ssDNA, 则保证的产量可能只有 20 nmol。如果是这种情况, 请为 RGD-ssDNA 共轭订购至少 1, 000 nmol 的 ssDNA。研究人员还可以为 ITS 结构设计自己的序列。通常情况下, 我们保持 GC 含量高于70% 的 its, 以提高 dsDNA 热稳定性。DNA 序列分析可以最大限度地降低自发夹、自杂交、稳定二级结构等形成的概率。分析工具可在网上查阅。在手稿中, 不同 t Tol的 its 的上链 dna 是相同的。我们改变下链 DNA 的生物素位置, 以获得不同的t托尔。然而, 改变 RGD 在上链上的位置也可以用来调整 ITS 的t级。王、哈22和莫赛比等人提供了不同 dsdna 几何形状的ttol计算, 特别是在解拉模式35、36和剪切模式下的 dsdna37,38。
尽管 ITS 表面记录了过去发生的所有整合素张力, 但通过连续记录细胞力图的视频, 研究人员可以通过减去上一帧来计算最新帧间隔中产生的整合素张力从当前帧生成 "准实时蜂窝力量图"。ITS 视频中的帧间隔因细胞类型而异, 但快速迁移细胞通常为 20秒, 固定细胞的帧间隔为1–2分钟。框架减法报告了准实时积分张力, 同时由于信号积累效应而保持了积分张力成像的高灵敏度。光漂白在两个连续图像之间是最小的, 因此对帧减法没有明显的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了爱荷华州立大学和国家普通医学研究所 (R35GM128747) 提供的启动基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
References
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