Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Imaging Integrin spenning og mobilnettet Force Submicron oppløsning med en integrerende spenning Sensor

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

Integrin spenning spiller viktige roller i ulike celle-funksjoner. En integrerende spenning, sensoren er integrin spenning kalibrert med picoNewton (pN) følsomhet og fotografert submicron oppløsning.

Abstract

Molekylær spenningen av integrin-ligand obligasjoner er grunnleggende mekanisk signalet i integrin veien som spiller viktige roller i mange celle-funksjoner og atferd. Hvis du vil kalibrere og image integrin spenning med høy kraft følsomhet og romlig oppløsning, utviklet vi en integrerende spenning sensor (ITS), en DNA-baserte fluorescerende spenning sensor. ITS er aktivert for å fluoresce Hvis opprettholde en molekylær spenning, således omdanner force fluorescerende signalet på molekylært nivå. Spenning terskelen for dens aktivisering er tunable mellom 10 til 60 pN som også dekker dynamikkområdet integrin spenning i celler. På et substrat podet med en ITS er integrin spenningen av tilhenger celler visualisert ved fluorescens og fotografert submicron oppløsning. ITS er også kompatibel med cellen strukturelle imaging i både live cellene og fast. ITS har vært anvendt til studiet av blodplater sammentrekning og celle migrasjon. Dette papiret detaljer prosedyren for syntese og anvendelse av ITS i studiet av integrin overførte mobilnettet kraft.

Introduction

Celler er avhengige av integrins å følge og utøve mobilnettet styrker til ekstracellulær matrix. Integrin-mediert celle vedheft og kraft overføring er avgjørende for celle spredning1,2, overføring3,4og overlevelse5,6,7. På lang sikt påvirker integrin biomekaniske signalering også celle spredning8,9,10 og differensiering11,12. Forskere har utviklet ulike metoder for å måle og kart integrin overførte mobilnettet styrker på cellen matrise grensesnittet. Disse metodene er basert på elastiske undergrunnen13, matrise av micropost14, eller atomic force mikroskopi (AFM)15,16. Elastisk undergrunnen og micropost metoder stole på deformasjon av underlag å rapportere mobilnettet stress og har begrensninger i romlig oppløsning og tvinge følsomhet. AFM har høy kraft følsomhet, men det kan ikke oppdage styrken på flere steder samtidig, gjør det vanskelig å tilordne mobilnettet makt overføres av integrins.

De siste årene, ble flere teknikker utviklet for å studere mobilnettet kraft på molekylært nivå. En samling av molekylære spenning sensor basert på polyetylenglykol17,18, edderkopp silke peptid19og DNA20,21,22,23 ble utviklet for å visualisere og overvåke spenningen av molekylære proteiner. Blant disse teknikkene, ble DNA først vedtatt som syntese materialet i spenningen måle tjore (TGT), et rupturable linker som modulerer øvre grense for integrin spenninger i lever celler22,24. Senere, DNA og fluorescens resonans overføring teknikk var kombinert for å skape hårnål DNA-baserte fluorescerende spenning sensorer først Chens gruppe23 og Salaita's group20. Hårnål DNA-baserte spenning sensoren rapporter integrin spenning i sanntid og har vært anvendt til studiet av en rekke cellulære funksjoner21. Etterpå kombinert Wangs lab en TGT med fluorophore-avsluttes paret å rapporten integrin spenning. Denne sensoren kalles en ITS25,26. ITS er basert på double-strandet DNA (dsDNA) og har et bredere dynamisk område (10-60 pN) for integrin spenning kalibrering. I motsetning til hårnål DNA-baserte sensorer, ITS rapporterer ikke mobilnettet kraft i sanntid, men registrerer alle historiske integrin hendelser som fotavtrykk av mobilnettet force; Dette signalet opphopning prosessen forbedrer sensitiviteten for mobilnettet styrke tenkelig, gjør det mulig å bilde mobilnettet force selv med en low-end fluorescens mikroskop. Syntese av ITS er relativt mer praktisk da det er skapt av hybridizing to single-strandet DNAs (ssDNA).

ITS er en 18-base-sammen dsDNA konjugert med biotin, en fluorophore, en avsluttes (svart hull avsluttes 2 [BHQ2])27og en syklisk arginylglycylaspartic syre (RGD) peptid28 som en integrin peptid ligand (figur 1). Den lavere stranden er konjugert med fluorophore (Cy3 brukes i dette manuskriptet, mens andre fargestoffer, som Cy5 eller Alexa serien, har også vært påvist mulig i vår lab) og biotin koden, som ITS er blokkert på et substrat av biotin-avidin bånd. Den øvre stranden er konjugert med RGD peptid og svart hull avsluttes, som slukker Cy3 med ca 98% slukke effektivitet26,27. Med protokollen presentert i dette papiret, er belegg tettheten av ITS på et substrat rundt 1100/µm2. Dette er tettheten vi tidligere kalibrert for 18 bp biotinylated dsDNA belagt på neutrAvidin-functionalized underlaget ved å følge samme belegg protokollen29. Når celler overholder underlaget belagt med ITS, integrin binder ITS gjennom RGD og overfører spenning til ITS. ITS har en bestemt spenning toleranse (Ttol) som er definert som spenningen terskelen som mekanisk skiller dsDNA av ITS innen 2 s22. DENS ruptur av integrin spenning fører til separasjon av avsluttes fra fargestoff som senere avgir fluorescens. Som et resultat, usynlig integrin spenningen konverteres til et fluorescens signal og mobilnettet styrken kan tilordnes av fluorescens tenkelig.

For å demonstrere anvendelsen av ITS, bruker vi fisk keratocyte her, brukte celle modell for celle migrasjon studie30,31,32, CHO-K1 celle, brukte nonmotile celle linje og NIH 3T3 fibroblast. Coimaging av integrin spenning og celle strukturer er også gjennomført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC, 8-16-8333-I) ved Iowa State University.

1. syntese av integrerende spenning sensoren

  1. Tilpasse og bestille ssDNAs (se Tabell for materiale).
    Merk: SsDNA sekvensene er som følger. Den øvre stranden er /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. Lavere tråder er som følger:
    12 pN ITS: 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/
    23 pN ITS: 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT/ CCC
    33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
    43 pN ITS: 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
    54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
    Her, /5ThioMC6-D / representerer en thiol modifikator C6 S-S (disulfide) på 5' slutten. /3BHQ_2/ representerer et svart hull avsluttes 2 på 3 slutten. 3Bio/5Biosg/og /iBiodT/ er biotinylation 3, 5' slutten, og på thymine av interne DNA, henholdsvis. /iCy3/ representerer en Cy3 inn i interne ryggraden i ssDNA. Disse kodene brukes av spesifikke kommersielle leverandøren her og kan være forskjellige i andre DNA-selskaper.
  2. Bøy RGD peptid til SH-ssDNA-avsluttes.
    Merk: De anvendte reagensene er fosfat-bufret saltvann (PBS), sulfosuccinimidyl 4 (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), RGD peptid og tris-(2-carboxyethyl) phosphine hydroklorid, også kjent som TCEP-HCl.
    1. Deprotect thiol modifikatoren på øvre strand DNA bruker TCEP løsning.
      Merk: Thiol-modifisert DNAs bestilt fra en kommersiell kilde leveres i oksidert skjemaet med svovel atomene beskyttet med en disulfide obligasjonslån som må reduseres før RGD-DNA Bøyning. TCEP er en luktfri reduksjon reagens som brukes for thiol deprotection.
      1. Oppløse 14,3 mg av TCEP-HCl i 300 µL av vann. Justere pH av TCEP løsningen ~7.2–7.4 med 1 M NaOH løsning (150 µL), ved hjelp av pH test papirer. Legge til rent vann for å lage et endelig antall 0,5 mL. Siste TCEP konsentrasjonen er 100 mM.
        Merk: Det anbefales å få TCEP løsning frisk hver tid til DNA thiol deprotection. Unngå strømpe TCEP løsning i lang tid.
      2. Legg 100 µL 0,5 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning og 400 µL av vann til TCEP løsning.
      3. Legge til 10 µL av TCEP + EDTA løsningen 20 µL av 1 mM thiol-DNA-BHQ2 i PBS. La løsningen reagere for 30 min ved romtemperatur.
        Merk: Disulfide obligasjonslån med 5' thiol modifikator C6 S-S Bøyning på denne ssDNA vil være kløyvde av TCEP, forlate gruppen thiol klar for reaksjon med maleimide i neste trinn. TCEP påvirke ikke følgende thiol-maleimide reaksjon; Dermed er det ikke nødvendig å passivate TCEP etter dette trinnet.
    2. Bøy RGD-NH2 med sulfo-SMCC.
      1. Oppløse 5 mg RGD-NH2 i 100 µL av PBS hente 11 mM RGD-NH2.
      2. Legge til 200 µL av rent vann til røret med 2 mg av sulfo-SMCC (premeasured av leverandøren). Smash sulfo-SMCC solid med Pipetter tips og kraftig Pipetter samtidig å lette oppløsende SMCC i vannet. Konsentrasjonen av sulfo-SMCC blir 23 mM.
        Merk: Fordi NHS ester i sulfo-SMCC er underlagt hydrolyse og har en levetid på noen få minutter, dette opp delaktiviteten skal være ferdig innen 1 min å unngå overdreven tap av NHS ester på grunn av hydrolyse. Bruk rent vann for å oppløse sulfo-SMCC fordi løselighet i PBS eller andre buffere er dårlig.
      3. Legge 40 µL av sulfo-SMCC løsning til 100 µL RGD-NH2 løsningen og ruge det for 20 min.
        Merk: NHS ester i sulfo-SMCC vil reagere med Amin gruppen i RGD-NH2, danner et amid bånd som kobler RGD og sulfo-SMCC.
    3. Bøy RGD-SMCC med det SH-ssDNA-avsluttes.
      1. Bland løsningene i trinn 1.2.1 og 1.2.2 og ruge blandingen 1t ved romtemperatur. Flytter løsningen til et kjøleskap sett på 4 ° C og la den videre reagere over natten. Thiol bøyd på øvre strand DNA reagere med maleimide på sulfo-SMCC, danner en thioether gruppe som forbinder RGD med den øvre stranden DNA.
    4. Utføre etanol nedbør for å rense RGD-ssDNA-avsluttes fra Ureagert sulfo-SMCC, RGD og TCEP.
      1. Chill 10 mL av 100% etanol i et 15 mL konisk rør i en 20 ° C fryseren i minst 30 min.
      2. Bland en 3 M NaCl løsning, DNA løsning og kjølt etanol i Volumforholdet 1:10:25. Holde blandet væsken i 20 ° C fryser i 30 minutter eller til DNA bidrar.
      3. Sentrifuge væsken 10.000 x g for 30 min. forkaste nedbryting.
      4. Legge til PBS DNA-pellets. Måle DNA konsentrasjonen med en spectrometer.
    5. (Valgfritt) Utføre DNA geleelektroforese for å få en høyere RGD-ssDNA-renhet.
      Merk: Med over protokollen, ca 70-90% av ssDNA vil bli bøyd med RGD. Hvis høyere renhet, kan DNA geleelektroforese også utføres for å skille konjugert DNA fra unconjugated DNA.
      1. Sett sammen en loddrett geleelektroforese system.
      2. Forberede en 10% polyakrylamid gel løsning ved å blande 50 mL av rent vann, 20 mL av 40% akrylamid gel, 8 mL 10 x tris borate EDTA (TBE) buffer og 800 µL av 10% ammonium persulfate (APS).
      3. Legge til 80 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) gel løsningen. Hell løsningen i glass kammeret av geleelektroforese. Sette inn en enkelt-og kam for å opprette en godt over gel. Vent i 10 min til gel er krysskoblet.
      4. Bland DNA løsningen med 100% glyserol i Volumforholdet 1:1. Fjerne kam og laste DNA løsningen gel godt.
      5. Kjør gel med en spenning på 200 V. observere to DNA band der henger en er konjugert DNA.
      6. Avskåret gel bandet konjugert DNA og terninger det i små biter.
      7. Samle terninger gel i to 1,5 mL sentrifuge rør med filtre. Legg til 500 µL av PBS hver rør.
      8. Sette PBS-gjennomvåt gel i et mørkt sted ved romtemperatur for 1 dag. DNA vil diffus ut av gel bitene i PBS.
      9. Samle inn DNA løsningen ved sentrifugering rør 1000 x g i 2 minutter.
      10. Utføre en ny runde med etanol nedbør (trinn 1.2.4) å samle inn DNA.
  3. Syntetisere ITS av hybridizing RGD-ssDNA-avsluttes og fargestoff-ssDNA-biotin.
    1. Bland løsninger av den øvre stranden og den lavere stranden DNAs i molar forholdet 1.1:1. Hold blandingen på 4 ° C over natten for å produsere ITS av DNA hybridisering.
      Merk: 1.1:1 for DNA hybridisering molar forholdet brukes i stedet for 1:1. Overdreven RGD-ssDNA-avsluttes brukes til å sikre at alle fargestoff-ssDNA-biotin vil hybridize med RGD-ssDNA-avsluttes. RGD-ssDNA-avsluttes uten hybridisering vil bli vasket under overflate belegg, som ikke påvirker dens overflate belegg kvaliteten.
    2. Aliquot og lager dens løsningen ved 20 ° C for langsiktig lagring.
      NOTE Lagring bufferen er PBS og lagring konsentrasjonen bør normalt være over 10 µM. For regelmessig bruk, kan dens løsning lagres på 4 ° C for noen uker uten merkbar utskriftskvalitet.

2. utarbeidelse av sine overflater av immobilizing ITS glassbunn Petri retter

Merk: De anvendte reagensene er biotinylated bovin serum albumin (BSA-biotin), avidin protein og dens. Chill alle reagenser og PBS buffer rundt 0 ° c på isen med en is bøtte.

  1. Last 200 µL 0,1 mg/ml BSA-biotin i PBS på av et glass bunn Petriskål (29 mm i diameter, med en 14 mm godt). Inkuber det i 30 min på 4 ° C i kjøleskap. BSA-biotin er fysisk adsorbert på glassplaten.
  2. Suge ut løsningen fra det godt med en pipette og legge 200 µL av PBS brønnen å vaske overflaten. Gjenta dette 3 x for å fullføre vask.
  3. Inkuber 200 µL av 50 µg/mL avidin proteinet i brønnen i 30 min på 4 ° C. Vaske det 3 x med PBS. Etter dette trinnet avidin protein binder til BSA-biotin og blir immobilisert på glassplaten.
  4. Inkuber 200 µL av 0,1 µM ITS brønnen i 30 min på 4 ° C. Vask parabolen med 3 x med PBS. La PBS brønnen til celle plating. Etter dette trinnet, ITS med biotin koden binder til avidin protein og blir immobilisert på overflaten.
    Merk: En forholdsregel kritiske belegg kvalitet og homogenitet under dens immobilisering er å aldri la Petriskål overflaten tørke opp. Holde alle reagenser og PBS 4 ° C eller rundt 0 ° C på is med en is bøtte bidrar til å redusere vann Fordampningshastighet under vask trinnene, når PBS trekkes fra brønnen.

3. celle plating på sine overflater

  1. Kultur fisk keratocytes.
    Merk: Her gullfisk (Carassius auratus) er brukt som et eksempel, men andre fiskearter kan også fungere.
    1. Plukke et stykke fisk skala fra en fisk en flat-tip TWEEZER. Forsiktig trykk skalaen på av et glass bunn Petriskål, med innsiden av skalaen å kontakte glasset. Venter ~ 30 s fisk skalaen å følge godt glassoverflaten av fatet.
    2. Legg 1 mL av Iscoves endret Dulbecco's medium (IMDM) komplett medium for å fullt ut dekker fisk skala. Holde Petriskål i en mørk og fuktig 6 – 48 h ved romtemperatur.
      Merk: IMDM komplett mediet inneholder 79% IMDM + 20% fosterets bovin serum (FBS) + 1% penicillin. Ingen ekstra tilførsel av oksygen eller CO2 er nødvendig. Noen silkepapir ruller fuktet med vann kan stå i for å opprettholde høy luftfuktighet i boksen. Fisk keratocytes vil overføre av fisk skala som ark celleområde etter noen timer. Dette kan observeres med vev kultur mikroskop. Cellene er vanligvis levedyktig på 48 timer.
  2. Løsne og plate keratocytes cellene på sin overflater.
    1. Fjerne mediet fra Petriskål der fisk skalaen ble kultivert. Vask vel 1 x med cellen frakobling løsning, og legge frakobling løsning for å dekke fisk skala og ruge i 3 minutter.
      Merk: Oppskriften på cellen frakobling EDTA løsning er som følger: 100 mL 10 x Hanks' balansert Salt løsning (HBSS) + 10 mL 1 M HEPES (pH 7.6) + 10 mL av 7,5% natrium bikarbonat + 2,4 mL 500 mM EDTA + 1 L H2O. PH justeres 7,4.
    2. Suge ut alle cellen frakobling løsning og legge IMDM komplett medium. Spre keratocytes av mild pipettering. Justere celle løsning tettheten til ønsket nivå (1 x 104– 1 x 105/mL). Plate cellene i sin overflaten (utarbeidet etter inndeling 2). Inkuber cellene i romtemperatur i 30 min før bildebehandling.
      Merk: Cellen teller kan gjøres med en hemocytometer etter frakobling cellene med frakobling løsning. Cellen plating tetthet er relativt lav slik at keratocytes har rikelig med areal å migrere.
  3. Plate CHO-K1 cellene og NIH 3T3 på sine overflater.
    Merk: Mediet for CHO-K1 celler er 89% Ham F12 + 10% FBS + 1% penicillin. Mediet for NIH 3T3 celler er 89% Dulbecco endret Eagle's medium (DMEM) + 10% kalv bovin serum (CBS) + 1% penicillin. Kultur forholdene er 37 ° C og 5% CO2.
    1. Kultur CHO-K1 celler eller NIH 3T3 celler til 80%-100% samløpet i en Petriskål (eller kultur kolbe).
    2. Varme cellen frakobling løsning og kultur medium til 37 ° C.
    3. Fjern alle kultur medium i Petriskål med en pipette. Vask cellene 1 x med cellen frakobling løsning. Dekker cellene med frakobling løsning og ruge det ved 37 ° C i 10 min.
    4. Spre cellene av pipettering. Samle celle løsningen og sentrifuge det 300 x g i 3 minutter.
    5. Suge ut nedbryting og legge fullstendig medium eller serum-free medium.
    6. Justere celle løsning tettheten til ønsket nivå (1 x 105 -1 x 106/mL). Plate cellene på sin overflater (utarbeidet etter inndeling 2). Inkuber cellene på 37 ° C i 1-2 h før imaging og 30 min før videoopptak.

4. bildebehandling, videoopptak, og sanntids integrin spenning kartlegging

  1. Quasi-Real-Time imaging integrin spenning i lever celler
    1. Inkuber keratocytes på sine overflater (utarbeidet etter inndeling 2) i 30 min ved romtemperatur eller ruge CHO-K1 celler eller NIH 3T3 celler 1t på sine overflater i en inkubator på 37 ° C.
    2. Montere Petriskål på en fluorescens mikroskop scene. Utføre mobilnettet force bildebehandling med en eksponeringstid på 1 s. Forstørrelsen er 40 x eller 100 x.
    3. Ta en video av sine bilder med en ramme intervall 20 s for keratocytes eller 1-2 min for CHO-K1 celler eller NIH 3T3 celler.
    4. Bruk MATLAB eller et annet bilde analyseverktøyet trekke en forrige ramme av dens video fra et bilde til å beregne dens signalet nylig produsert i siste ramme intervall. Nylig produsert sin signalet representerer integrin spenningen generert i siste ramme intervall, og dermed rapportering mobilnettet kraften i en quasi-real-time måte.
  2. Coimaging av integrin spenning og cellestruktur i immunostained celler
    1. Etter trinn 3.2.2 eller trinn 3.3.6 kan utføre immunostaining for å merke målet strukturelle proteiner.
      Merk: Bruk forskjellige farger bare for å unngå fluorescens crosstalk mellom integrin spenning bildebehandling og celle strukturelle bildebehandling. I dette manuskriptet Cy5 fluorophore ble brukt for phalloidin og Alexa 488 ble brukt for vinculin flekker. Konsentrasjonen av både primære og sekundære antistoff er 2,5 µg/mL. Konsentrasjonen for phalloidin er 1,5 enheter/µL.
    2. Utføre multifluorescent kanal imaging å erverve en integrin spenning kart og celle strukturelle bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med ITS, ble integrin spenning kart over fisk keratocytes fanget. Det viser at en keratocyte overfører og genererer integrin spenning på to force spor (figur 2A). Oppløsningen av force kartet ble kalibrert skal 0,4 µm (figur 2B). Høy integrin spenning konsentrerer til bakre marg (figur 3A). ITS viser også ulike spesifikke mønstre av andre celler. En nonmotile celle, NIH-3T3, danner et bestemt integrin spenning mønster (figur 3B) ganske forskjellig fra den raskt overføre keratocyte.

Med immunostaining coimaged fokal adhesjon og integrin spenningen av fisk keratocytes var (figur 4A). Forholdet mellom integrin spenning og cellestruktur i keratocytes ble studert i detalj av Wang et al.25. Integrin spenninger og stress fiber i CHO-K1 celler var også coimaged (figur 4B). Disse eksperimentene indikerer at ITS lar coimaging celle adhesjon og celle strukturer samtidig under lignende tenkelig innstillinger, og dermed tilrettelegge studiet av celle struktur/force samspill.

Figure 1
Figur 1: skjemaer over av dens. ITS er en dsDNA dekorert med en RGD ligand, en fluorescens avsluttes, en farge og en biotin kode. Fargestoff (grønne fylte sirkelen) er slukket av avsluttes. Under integrin spenning, dsDNA er sprukket og Cy3 er frigjort fra slukke og avgir fluorescens som kan gjenkjennes av fluorescerende mikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Integrin spenning kart over en fisk keratocyte og submicron oppløsning ITS. (A) under rask migrering en keratocyte konsekvent genererer en integrin spenning kart i to force spor. (B) avstanden mellom to force spor er vanligvis 40 µm. Romlig oppløsning av mobilnettet force kartet fotografert av ITS er rundt 0,4 µm. Lineær profil Cy3 fluorescerende intensiteten i området merket ved en kort rød linje i nedre venstre panel beregnes for kalibrering av oppløsningen i mobilnettet force bildebehandling. Resultatet er vises i nedre høyre panel og utstyrt med en Gaussisk kurve. Baren skala = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: sanntid integrin spenning kart fisk keratocyte og NIH-3T3. (A) A fisk keratocyte og dens integrin spenning kartet. (Venstre) En motile fisk keratocyte. (Nederst til venstre) Integrin spenning kart over keratocyte rapportert av ITS. (Øverst til høyre) Sanntid integrin spenning ble innhentet av frame subtraksjon. Det viser at nygenererte integrin spenningen er colocalized med cellen bakre kant. (Nederst til høyre) Integrin spenning kart (grønn) og sanntid integrin spenning (rosa) presenteres i en sammenslått figur. Baren skala = 10 µm. (B) en NIH-3T3 fibroblast og dens integrin spenning kart. (Venstre) En NIH-3T3 fibroblast. (Nederst til venstre) Integrin spenning kart over NIH-3T3-fibroblast. Integrin spenning ble generert i stripemønsteret. (Øverst til høyre) Sanntid integrin spenning viser at nygenererte integrin spenning hovedsakelig danner på cellen perifere regionen. (Nederst til høyre) Integrin spenning kart (grønn) og sanntid integrin spenning (rosa) presenteres i en sammenslått figur. Baren skala = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Coimaging av integrin spenning og celle struktur. (A) Coimaging integrin spenning, vinculin og F-utgangen i en keratocyte. Keratocyte ble løst og immunostained vinculin og F-utgangen. (B) Coimaging integrin spenning, vinculin og F-utgangen i en CHO-K1 celle. Baren skala = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ITS er en svært tilgjengelig ennå kraftfull teknikk for mobilnettet tvinge kartlegging både syntese og program. Med alle materialer klar, kan ITS syntetiseres innen 1 dag. Under eksperimenter, er bare tre trinn av overflate belegg nødvendig før cellen plating. Nylig forenklet vi ytterligere belegg prosedyren til ett trinn ved å koble direkte ITS til storfe serum albumin, som muliggjør direkte fysisk adsorpsjon av ITS glass eller polystyren overflater33. ITS bringer fluorescerende intensiteten av mobilnettet force signal til et tilsvarende nivå av mobilnettet strukturelle imaging. Praktisk syntese og prøve forberedelse, beskjedne krav til mikroskopi, og høy følsomhet for mobilnettet styrke gjør ITS en robust og pålitelig teknikk for studiet av cellen mekanikk. I dette papiret presenterte vi en omfattende prosedyre for syntese og program.

Bøye RGD er ligand med ssDNA den mest kritiske prosedyren i sin syntese. Som nevnt i delen protokollen, er NHS ester på sulfo-SMCC ikke stabil i vann. Jo lenger det tar for å oppløse sulfo-SMCC i vann, mer sulfo-SMCC mister NHS ester til hydrolyse og blir "dud", som conjugates med DNA gjennom maleimide-thiol-reaksjon, men unnlater å bøye med RGD-NH2. Som et resultat en stor del av DNA molekyler vil være opptatt av det død sulfo-SMCC og kan ikke koble med RGD, fører til en lav avkastning på ssDNA-RGD. Derfor bør oppløsende sulfo-SMCC i vann fullføres raskt, vanligvis innen 1 min. Det anbefales også å sjekke avkastningen av ssDNA-RGD med geleelektroforese. Hvis avkastningen er høyere enn 80%, rensing er vanligvis unødvendig. Ellers anbefales DNA rensing av polyakrylamid gel. Utvinningsgrad på DNA av polyakrylamid gel er ca 60%-80%.

For å syntetisere en rimelig mengde RGD-ssDNA-BHQ2, bør startbeløpet for thiol-ssDNA-BHQ2 være minst 20 nmol (1 mM x 20 µL). Merk at DNA modifikasjoner redusere antallet ssDNA bestilt fra DNA selskaper. For eksempel hvis 1000 nmol av ssDNA med to endringer bestilles, kan garantert avkastning bare være 20 nmol. Hvis dette er tilfelle, kan du bestille minst 1000 nmol av ssDNA for RGD-ssDNA-Bøyning. Forskerne kan også utforme egne sekvenser for sin konstruksjoner. Normalt holde vi GC innholdet ITS høyere enn 70% å forbedre dsDNA termisk stabilitet. DNA sekvens analyse kan utføres for å minimere sannsynligheten for danner selv-hårnål, selv hybridisering, stabil sekundære struktur, etc. Analyseverktøyet er tilgjengelig online. I manuskriptet er den øvre stranden DNA den samme for ITSs med ulike Ttol. Vi variere biotin plasseringen på lavere strand DNA å oppnå en annen Ttol. Imidlertid kan varierer plasseringen av RGD på den øvre stranden også brukes for å finjustere Ttol av ITS. Beregningen av Ttol for en annen dsDNA geometri er levert av Wang og Ha22 og Mosayebi et al.34, spesielt for dsDNA i unzipping modus35,36 og skjær modus 37,38.

Selv om sine overflater registrerer alle integrin spenninger som har skjedd tidligere ved å ta en video av mobilnettet force kartet fortløpende, kan forskerne beregne integrin spenningen produsert i siste ramme intervallet ved å trekke det forrige delbildet gjeldende rammer å generere "quasi-real-time mobilnettet force kart". Ramme intervallet i sin video varierer avhengig av celletyper, men er vanligvis 20 s for rask overføring celler og 1-2 min for stasjonære celler. Metoden frame subtraksjon rapporter quasi-real-time integrin spenningen samtidig som du beholder høy følsomhet for integrin spenning bildebehandling på grunn av signalet opphopning effekten. Photobleaching er minimal mellom to påfølgende bilder og derfor har ingen observerbare innflytelse til frame subtraksjon metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av oppstart fondet ved Iowa State University og ved National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  3. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
  4. Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
  5. Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
  6. Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
  7. Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
  8. Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
  9. Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
  10. Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
  11. Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
  12. Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
  13. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  14. Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
  15. Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  16. Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
  17. Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
  18. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
  19. Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  20. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
  21. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  22. Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
  23. Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
  24. Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
  25. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  26. Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
  27. Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
  28. Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
  29. Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  30. Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
  31. Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
  32. Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
  33. Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
  34. Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
  35. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
  36. Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
  37. de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
  38. Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).

Tags

Retraksjon problemet 146 celle mekanikk mechanobiology integrin integrin spenning mobilnettet force kartlegging integrin spenning sensor
Imaging Integrin spenning og mobilnettet Force Submicron oppløsning med en integrerende spenning Sensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X.… More

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter