Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Imaging integrine spanning en cellulaire kracht bij Submicron resolutie met de Sensor van een integratieve spanning

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

Integrine spanning speelt belangrijke rol in verschillende functies van de cel. Met de sensor van een integratieve spanning, is integrine spanning gekalibreerd met picoNewton (pN) gevoeligheid en beeld bij submicron resolutie.

Abstract

Moleculaire spanning langs integrine-ligand obligaties is het fundamentele mechanische signaal in het integrine-traject dat belangrijke rol in de vele functies van de cel en gedrag speelt. Als u wilt kalibreren en afbeelding van integrine spanning met hoge kracht gevoeligheid en ruimtelijke resolutie, ontwikkelden we een integratieve spanning sensor (ITS), een fluorescerende spanning op basis van DNA-sensor. Het ITS is geactiveerd om lichten als een moleculaire spanning, ondersteunen kracht dus omzetten in fluorescerende signaal op moleculair niveau. De drempel van de spanning voor ITS activering is afstembare in de range van 10 – 60 pN die goed dekt het dynamisch bereik van integrine spanning in cellen. Op een substraat met een ITS geënt, is de spanning van integrine Adherente cellen gevisualiseerd door fluorescentie en beeld bij submicron resolutie. Het ITS is ook compatibel met structurele beeldvorming van de cel zowel vaste cellen in levende cellen. Het ITS is met succes toegepast op de studie van bloedplaatjes contractie en cel migratie. Deze paper detailleert de procedure voor de synthese en de toepassing van ITS in de studie van integrine overdraagbare cellulaire kracht.

Introduction

Cellen, is afhankelijk van integrins houden en uitoefenen van cellulaire krachten aan de extracellulaire matrix. Integrine-gemedieerde cel adhesie en kracht overdracht zijn cruciaal voor cel verspreiding van1,2, migratie3,4en6,7van de5,van de overleving. Op de lange termijn beïnvloedt integrine biomechanische signalering ook cel proliferatie8,9,10 en differentiatie11,12. Onderzoekers hebben ontwikkeld verschillende methoden om te meten en kaart integrine overdraagbare mobiele troepen op het raakvlak van cel-matrix. Deze methoden zijn gebaseerd op elastische substraat13, matrix van micropost14, of atomic force microscopie (AFM)15,16. Elastische onderlaag en micropost methoden, is afhankelijk van de vervorming van substraten te melden van de cellulaire stress en hebben beperkingen op het gebied van de ruimtelijke resolutie en kracht van de gevoeligheid. AFM heeft hoge kracht gevoeligheid, maar het niet wordt gedetecteerd door kracht op meerdere plekken tegelijk, waardoor het moeilijk om toe te wijzen cellulaire kracht overgebracht door integrins.

In de afgelopen jaren werden verschillende technieken ontwikkeld om te bestuderen van cellulaire kracht op moleculair niveau. Een verzameling van moleculaire spanning sensoren gebaseerd op polyethyleenglycol17,18, spider silk peptide19en DNA20,21,22,23 werden ontwikkeld om Visualiseer en controleren van spanning overgebracht door moleculaire proteïnen. Onder deze technieken, werd DNA aangenomen als het materiaal van de synthese in de spanning meten ketting (TGT), een rupturable linker die de bovengrens van integrine spanningen in levende cellen22,24 moduleert. Later, DNA- en fluorescentie resonantie overdracht techniek werden samengevoegd tot haarspeld DNA gebaseerde fluorescerende spanning sensoren eerst door Chen's groep23 en Salaita de groep20. De sensor van de DNA-gebaseerde spanning haarspeld integrine spanning in real-time rapporten en is met succes toegepast op de studie van een reeks van cellulaire functies21. Daarna gecombineerd Wang's lab een TGT met het fluorophore-quencher-paar verslag integrine spanning. Deze sensor heet een ITS25,26. Het ITS is gebaseerd op double-stranded DNA (dsDNA) en heeft een bredere dynamische waaier (pN 10-60) voor integrine spanning kalibratie. In tegenstelling tot haarspeld DNA gebaseerde sensoren, ITS rapporteert niet in real-time cellulaire geldende maar registreert alle historische integrine gebeurtenissen als de voetafdruk van cellulaire geweld; Dit signaal accumulatieproces verbetert de gevoeligheid voor cellulaire force imaging, waardoor het haalbaar afbeelding cellulaire kracht zelfs met een low-end fluorescentie Microscoop. De synthese van ITS is relatief gemakkelijker als het is gemaakt door kwekers twee single-stranded Ani (ssDNA).

Het ITS is een 18-base-gepaarde dsDNA geconjugeerd met biotine, een fluorophore, een quencher (Black Hole Quencher 2 [BHQ2])27en een cyclische arginylglycylaspartic zuur (RGD) peptide28 als een integrine peptide ligand (Figuur 1). De onderste lijn is geconjugeerd met de fluorophore (Cy3 wordt gebruikt in dit manuscript, terwijl andere kleurstoffen, zoals Cy5 of Alexa serie, ook is bewezen haalbaar in ons lab) en de Biotine tag, waarmee de ITS is geïmmobiliseerd op een substraat door Biotine-avidin bond. Het bovenste deel is geconjugeerd met de RGD-peptide en de Quencher van de Black Hole, die Cy3 met ongeveer 98% blussen efficiëntie26,27 lest. Met het protocol gepresenteerd in deze paper, is de dichtheid van de coating van de ITS op een substraat rond 1100/µm2. Dit is de dichtheid die we eerder gekalibreerd voor 18 bp biotinyleerd dsDNA bekleed op het substraat neutrAvidin-matiemaatschappij volgens hetzelfde protocol29coating. Wanneer cellen zich aan het substraat bedekt met de ITS houden, integrine bindt de ITS via RGD en spanning aan de ITS verzendt. Het ITS is een specifieke spanning tolerantie (Ttol) die is gedefinieerd als de spanning drempel die mechanisch de dsDNA van ITS binnen 2 s22 scheidt. DE breuk door integrine spanning leidt tot de scheiding van de quencher van de kleurstof die vervolgens fluorescentie uitzendt. Dientengevolge, de onzichtbare integrine spanning wordt geconverteerd naar een fluorescentie-signaal en de cellulaire kracht kan worden toegewezen door fluorescentie imaging.

Om aan te tonen van de toepassing van ITS, gebruiken we vis keratocyte hier, een model van de gebruikte cel voor cel migratie studie30,31,32, CHO-K1 cel, een veelgebruikte nonmotile cellijn en NIH 3T3 fibroblast. Coimaging van integrine spanning en cel structuren wordt ook uitgevoerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC, 8-16-8333-I) van de Iowa State University.

1. synthese van de integratieve spanning sensor

  1. Aanpassen en bestellen van ssDNAs (Zie de Tabel van de materialen).
    Opmerking: De ssDNA-sequenties zijn als volgt. Het bovenste deel is /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. De lagere strengen zijn als volgt.
    12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio//5Cy3 /
    23 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT//5Cy3/CCC
    33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
    43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
    54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
    Hier, /5ThioMC6-D / vertegenwoordigt een thiol modifier C6 S-S (bisulfide) eind 5'. /3BHQ_2/ vertegenwoordigt een zwart gat Quencher 2 aan de 3'-eind. / 3Bio / / 5Biosg/en /iBiodT/ zijn biotinylation eind 3', 5' uiteindelijk en op de thymine van interne DNA, respectievelijk. /iCy3/ vertegenwoordigt een Cy3 ingevoegd in de interne ruggengraat van ssDNA. Deze codes worden gebruikt door de specifieke commerciële leverancier hier gebruikt en kunnen afwijken in andere DNA-bedrijven.
  2. Geconjugeerde RGD peptide aan de SH-ssDNA-quencher.
    Opmerking: De gebruikte reagentia zijn-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC), RGD peptide en tris-(2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride, ook bekend als TCEP-HCl.
    1. DEPROTECT de thiol modifier op het DNA van de bovenste deel met behulp van de TCEP oplossing.
      Opmerking: Thiol gemodificeerde Ani besteld bij een commerciële bron worden geleverd in geoxideerde vorm, met de zwavel atomen beschermd door een Zwavelbrug dat voorafgaand aan de RGD-DNA vervoeging moet worden teruggebracht. TCEP is een reukloos vermindering reagens gebruikt voor de thiol-deprotection.
      1. Los 14.3 mg TCEP-HCL in 300 µL van water. Breng de pH van de oplossing van de TCEP te ~7.2–7.4 met 1 M NaOH-oplossing (ongeveer 150 µL), met behulp van pH-examenteksten. Zuiver water tot een eindvolume van 0,5 mL toevoegen. De uiteindelijke TCEP-concentratie is 100 mM.
        Opmerking: Het wordt aanbevolen om TCEP oplossing vers telkens voor DNA thiol deprotection. Vermijd kous TCEP oplossing voor een lange tijd.
      2. Voeg 100 µL van 0.5 M ethyleendiamminetetra (EDTA) zuuroplossing en 400 µL van water aan de oplossing van TCEP.
      3. Voeg toe 10 µL van het TCEP + EDTA-oplossing aan 20 µL van 1 mM thiol-DNA-BHQ2 in PBS. Laat de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur reageren.
        Opmerking: De Zwavelbrug van 5' thiol modifier C6 S-S vervoeging op deze ssDNA zullen worden cleaved door TCEP, verlaat de thiol groep klaar voor reactie met maleimide in de volgende stappen. De TCEP doet geen afbreuk aan de volgende reactie van de thiol-maleimide; het is dus niet nodig om te passivate TCEP na deze stap.
    2. Geconjugeerde RGD-NH2 met sulfo-SMCC.
      1. Los 5 mg RGD-NH,2 in 100 µL van PBS te verkrijgen van 11 mM RGD-NH2.
      2. Voeg 200 µL van zuiver water aan de buis met 2 mg sulfo-SMCC (geleverd door de leverancier). Smash de solid sulfo-SMCC met een pipet tip en krachtig Pipetteer op hetzelfde moment om ontbinding van de SMCC in het water. De concentratie van sulfo-SMCC zullen 23 mM.
        Opmerking: Omdat de NHS ester in sulfo-SMCC onderworpen aan de hydrolyse is en een levensduur van een paar minuten heeft, deze oplossen stap moet worden afgerond binnen 1 min om te voorkomen dat overmatig verlies van de ester van de NHS als gevolg van hydrolyse. Het gebruik van zuiver water te ontbinden sulfo-SMCC omdat zijn oplosbaarheid in PBS of andere buffers slecht is.
      3. Voeg 40 µL van sulfo-SMCC oplossing aan de 100 µL RGD-NH2 oplossing en Incubeer het gedurende 20 min.
        Opmerking: De NHS ester in sulfo-SMCC reageren met de amine-groep in RGD-NH2, vorming van een amide-binding die RGD en sulfo-SMCC is gekoppeld.
    3. Conjugaat RGD-SMCC met de SH-ssDNA-quencher.
      1. Meng de oplossingen bereid in stappen 1.2.1 en 1.2.2 en laat het mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur inwerken. De oplossing naar een set van de koelkast bij 4 ° C en laat het verder reageren 's nachts. De thiol geconjugeerd op het bovenste onderdeel DNA zal reageren met maleimide op sulfo-SMCC, vormen een groep thioether die RGD met de bovenste streng DNA verbindt.
    4. Ethanol neerslag om te zuiveren RGD-ssDNA-quencher uit spoorverontreiniging sulfo-SMCC, RGD en TCEP uitvoeren.
      1. Chill 10 mL 100% ethanol in een conische tube van 15 mL in een vriezer van-20 ° C gedurende ten minste 30 minuten.
      2. Meng een 3 M NaCl-oplossing, een oplossing van DNA en gekoeld ethanol in een volumeverhouding van 1:10:25. Houd de gemengde vloeistof in een vriezer van-20 ° C gedurende 30 min of totdat het DNA wordt neergeslagen.
      3. Centrifugeer de vloeistof bij 10.000 x g gedurende 30 min. Verwijder het supernatant.
      4. PBS toevoegen aan de DNA-pellet. Het meten van de concentratie van de DNA met behulp van een spectrometer.
    5. (Optioneel) Voer de Elektroforese van het DNA om te krijgen een hogere zuiverheid van de RGD-ssDNA.
      Opmerking: Met het bovenstaande protocol, ongeveer 70%-90% van de ssDNA zal worden vervoegd met RGD. Als hogere zuiverheid wordt gewenst, kan ook DNA elektroforese worden uitgevoerd om te scheiden van geconjugeerd DNA van unconjugated DNA.
      1. Monteren van een systeem van verticale elektroforese.
      2. Bereid een polyacrylamidegel van 10%-oplossing door het mengen van 50 mL zuiver water, 20 mL 40% acrylamide gel, 8 mL 10 x tris-boraat-EDTA (FSME) buffer en 800 µL van 10% ammoniumnitraat persulfate (APS).
      3. Voeg 80 µL van tetramethylethylenediamine (TEMED) aan de gel-oplossing. Giet de oplossing in de glazen zaal van de Elektroforese van het systeem. Invoegen van een single-well kam om het maken van een put op de top van de gel. Wacht 10 minuten tot de gel kruisverwijzende is.
      4. Meng de DNA-oplossing met 100% glycerol in een volumeverhouding van 1:1. Verwijder de kam en de DNA-oplossing voor de gel goed laden.
      5. Stel de gel bij een spanning van 200 V. Let twee DNA bands waarin de achterblijvende één het geconjugeerd DNA is.
      6. De gel-band met het geconjugeerd DNA afgesneden en snijd het in kleine stukjes.
      7. Verzamel de blokjes gel in twee 1,5 mL centrifuge buizen met filters. Voeg 500 µL van PBS aan elke buis.
      8. Zet de PBS doordrenkte gel in een donkere plaats bij kamertemperatuur voor 1 dag. DNA zal diffuse uit de stukken van de gel in de PBS.
      9. Verzamelen van de DNA-oplossing door centrifugatie van de buizen bij 1.000 x g gedurende 2 min.
      10. Voer een andere ronde van ethanol neerslag (stap 1.2.4) voor het verzamelen van het DNA.
  3. Synthetiseren ITS door kwekers RGD-ssDNA-quencher en kleurstof-ssDNA-biotine.
    1. Meng de oplossingen van het bovenste deel en de lagere strand Ani bij een molaire verhouding van 1.1:1. Houd het mengsel bij 4 ° C's nachts tot de ITS door DNA hybridisatie.
      Opmerking: Een molaire verhouding van 1.1:1 voor DNA hybridisatie wordt gebruikt in plaats van 1:1. Buitensporige RGD-ssDNA-quencher wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat alle kleurstof-ssDNA-Biotine met RGD-ssDNA-quencher kruisen zal. RGD-ssDNA-quencher zonder hybridisatie zal tijdens oppervlakte coating, die zal niet van invloed op de kwaliteit van de oppervlaktelaag ITS worden afgewassen.
    2. Aliquot en winkel de ITS-oplossing bij-20 ° C voor lange termijn opslag.
      Opmerking: De opslag buffer PBS en de concentratie van de opslag moet over het algemeen boven 10 µM. Voor regelmatig gebruik, kan de oplossing voor een paar weken zonder merkbaar achteruitgang bij 4 ° C worden opgeslagen.

2. voorbereiding van de oppervlakken door immobilizing van de ITS op petrischalen glassbottom

Opmerking: De gebruikte reagentia zijn biotinyleerd bovien serumalbumine (BSA-Biotine), avidin eiwitten en ITS. Alle reagentia en PBS buffer tot ongeveer 0 ° C op ijs met een ijsemmer chill.

  1. Laden 200 µL van 0,1 mg/mL BSA-Biotine in PBS op de put van een glassbottom petrischaal (29 mm in diameter, met een 14 mm goed). Incubeer het gedurende 30 minuten bij 4 ° C in een koelkast. BSA-Biotine is fysiek geadsorbeerde op het glasoppervlak.
  2. Zuigen uit de oplossing van het goed met behulp van een precisiepipet en voeg 200 µL van PBS terug naar de put te wassen van het oppervlak. Herhaal dit 3 x Voltooi het wassen.
  3. Incubeer 200 µL van 50 µg Mo/mL avidin eiwitten in de put gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Wassen het 3 x met PBS. Na deze stap, de avidin proteïne bindt aan de BSA-Biotine en wordt geblokkeerd op het glasoppervlak.
  4. Incubeer 200 µL van 0.1 µM ITS in de put gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Wassen van de schotel met 3 x met PBS. Laat PBS in de put tot de cel beplating. Na deze stap, de ITS met de Biotine tag bindt aan de avidin proteïne en wordt geblokkeerd op het oppervlak.
    Opmerking: Een voorzorgsmaatregel cruciaal voor haar coatingkwaliteit en homogeniteit tijdens de ITS immobilisatie is nooit laten het oppervlak van de petrischaal opdrogen. Houden alle reagentia en PBS bij 4 ° C of rond 0 ° C op ijs met een ijsemmer helpt bij het verminderen van de verdampingssnelheid van water tijdens de stappen wassen, toen PBS is getrokken uit uit de put.

3. cel beplating op de oppervlakken

  1. Cultuur vis keratocytes.
    Opmerking: Hier, goudvis (Carassius auratus) wordt gebruikt als een voorbeeld, maar andere vissoorten kan ook werken.
    1. Een stukje vis schaal plukken van een vis met een flat-tip pincetten. Voorzichtig drukt u op de schaal op de put van een petrischaal glassbottom met de binnenzijde van de schaal contact opnemen met het glas. Wachten op ~ 30 s voor de schaal van de vis goed aan het glasoppervlak van de schotel te houden.
    2. Voeg 1 mL van de Iscove bewerkt Dulbecco van medium (IMDM) complete medium om de vis schaal volledig te dekken. Laat de petrischaal in een donkere en vochtige vak 6 – 48 uur bij kamertemperatuur.
      Opmerking: IMDM compleet medium bevat 79% IMDM + 20% foetale runderserum (FBS) + 1% penicilline. Geen extra aanvoer van zuurstof of CO2 nodig is. Een paar papieren zakdoekje rollen doorweekt met water kunnen worden overgelaten in het vak te handhaven van de hoge luchtvochtigheid in het vak. Vis keratocytes zal migreren uit de vis schaal als een vel cellen na een paar uur. Dit kan worden waargenomen met een Microscoop weefselkweek. De cellen zijn over het algemeen haalbare op 48 uur.
  2. Loskoppelen en plaat van de cellen van de keratocytes op ITS oppervlakken.
    1. Verwijder het medium van de petrischaal waarin de vis schaal werd gekweekt. De goed 1 x wassen met cel loskoppelen van de oplossing en voeg ontkoppelen oplossing om te dekken van de vis schaal en incubeer gedurende 3 minuten.
      Opmerking: Het recept voor de cel los van de EDTA-oplossing is als volgt: 100 mL 10 x Hanks evenwichtige zout oplossing (HBSS) + 10 mL van de 1 M HEPES (pH 7,6) + 10 mL van 7,5% natriumbicarbonaat + 2,4 mL van de EDTA 500 mM + 1 L H2O. De pH wordt aangepast aan 7.4.
    2. Zuigen uit alle cel loskoppelen van de oplossing en IMDM volledige medium toe te voegen. De keratocytes door het zachte pipetteren verspreiden. De celdichtheid van de oplossing naar het gewenste niveau (1 x 104– 1 x 105/mL) aanpassen. Plaat van de cellen op het oppervlak van de ITS (opgesteld overeenkomstig punt 2). Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten vóór imaging.
      Opmerking: Het tellen van de cel kan worden gedaan met een hemocytometer na het loskoppelen van de cellen met het loskoppelen van de oplossing. De cel plating dichtheid is relatief laag, zodat de keratocytes genoeg van de oppervlakte hebben te migreren.
  3. Plaat CHO-K1 cellen en NIH 3T3 cellen op de oppervlakken.
    Opmerking: Het medium voor CHO-K1 cellen is 89% Ham de F12 + 10% FBS + 1% penicilline. Het medium voor NIH 3T3 cellen is 89% Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) + 10% kalf runderserum (CBS) + 1% penicilline. De kweekomstandigheden zijn 37 ° C en 5% CO2.
    1. Cultuur CHO-K1 cellen of NIH 3T3 cellen tot 80 – 100% samenkomst in een petrischaal (of cultuur kolf).
    2. Warm de cel loskoppelen van de oplossing en kweekmedium tot 37 ° C.
    3. Verwijder alle kweekmedium in de petrischaal met een pipet. Wassen van de cellen 1 x met cel loskoppelen van de oplossing. Bedek de cellen met het loskoppelen van de oplossing en het incuberen bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
    4. De cellen verspreiden door pipetteren. Verzamelen van de cell-oplossing samen en Centrifugeer het bij 300 x g gedurende 3 minuten.
    5. Zuigen uit het supernatant en volledige medium of medium serumvrij toevoegen.
    6. De celdichtheid van de oplossing naar het gewenste niveau (1 x 105 – 1 x 106/mL) aanpassen. Plaat van de cellen op de oppervlakken van de ITS (opgesteld overeenkomstig punt 2). Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 1-2 uur voor imaging, of 30 minuten vóór de video-opname.

4. imaging, videoopname, en real-time integrine spanning mapping

  1. Toond beeldvorming van integrine spanning in levende cellen
    1. Keratocytes op de oppervlakken (opgesteld overeenkomstig punt 2) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen of Incubeer CHO-K1 cellen of NIH 3T3 cellen gedurende 1 uur op de oppervlakken in een incubator bij 37 ° C.
    2. Monteer de petrischaal op een fluorescentie Microscoop podium. Uitvoeren van cellulaire kracht beeldbewerking met een belichtingstijd van 1 s. De vergroting is 40 x of 100 x.
    3. Neem een video van de beelden met een interval van de frame van 20 s voor keratocytes, of 1-2 min voor CHO-K1 cellen of NIH 3T3 cellen.
    4. MATLAB of een andere afbeelding Analysetool gebruiken om te aftrekken van een vorige frame van de ITS-video van een huidige frame voor het berekenen van het signaal van de ITS nieuw geproduceerd in het laatste frame-interval. Het nieuw geproduceerde ITS signaal vertegenwoordigt de spanning van de integrine gegenereerd in het laatste frame-interval, waardoor de cellulaire force toond wijze rapportage.
  2. Coimaging van integrine spanning en cellulaire structuur in de immunostained cellen
    1. Voer na stap 3.2.2 of stap 3.3.6, immunokleuring ter gelegenheid van de doel-structurele eiwitten.
      Opmerking: Gebruik verschillende kleurstoffen te voorkomen van de fluorescentie Overspraak tussen integrine spanning beeldvorming en cel structurele imaging. In dit manuscript, Cy5 fluorophore werd gebruikt voor phalloidin en Alexa 488 werd gebruikt voor de kleuring van de vinculin. De concentratie van zowel de primaire als de secundaire antilichaam is 2,5 µg/mL. De concentratie voor phalloidin is 1,5 eenheden/µL.
    2. Multifluorescent kanaal imaging te verwerven van zowel een integrine spanning kaart en de cel structurele imaging uitvoeren

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met de ITS, werd de integrine spanning kaart van vis keratocytes gevangen. Hieruit blijkt dat een keratocyte migreert en integrine spanning op twee kracht tracks (figuur 2A genereert). De resolutie van de kaart van kracht was gekalibreerd om 0.4 µm (figuur 2B). Hoge integrine spanning concentreert zich op de achterste marge (figuur 3A). ITS toont ook verschillende specifieke patronen van verschillende cellen. Een nonmotile cel, NIH-3T3, vormt een specifieke integrine spanning patroon (figuur 3B) heel anders dan die van de snelle migratie keratocyte.

Met immunokleuring coimaged focal verklevingen en de spanning van integrine van vis keratocytes waren (figuur 4A). De relatie tussen integrine spanning en celstructuur in keratocytes werd in detail bestudeerd door Wang et al.25. Integrine spanning en stress vezels in CHO-K1 cellen hebben ook coimaged (figuur 4B). Deze experimenten blijkt dat de ITS dankzij de coimaging van de cel adhesie kracht en cel structuren tegelijk onder vergelijkbare imaging instellingen, teneinde de studie van cel structuur/kracht samenspel.

Figure 1
Figuur 1: schema van de de. Het ITS is een dsDNA versierd met een RGD-ligand, een fluorescentie-quencher, een kleurstof en een Biotine-tag. De kleurstof (groene gevulde cirkel) is uitgeblust door de quencher. Onder integrine spanning, de dsDNA is gescheurd en Cy3 is bevrijd van blussen en stoot fluorescentie die kan worden gedetecteerd door fluorescent microscopie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: integrine spanning kaart van een vis-keratocyte en de resolutie van de submicron van ITS. (A) tijdens de snelle migratie, genereert een keratocyte consequent een kaart van integrine spanning in twee sporen van kracht. (B) de afstand tussen de twee kracht tracks is meestal 40 µm. De ruimtelijke resolutie van de kaart van de cellulaire kracht beeld door de ITS is ongeveer 0.4 µm. Lineaire Profiel van de Cy3 fluorescerende intensiteit van het gebied gemarkeerd door een korte rode lijn in het lagere linker paneel wordt berekend voor de kalibratie van de resolutie in cellulaire kracht beeldbewerking. Het resultaat is getoond in de lagere rechter paneel en uitgerust met een Gauss-curve. De schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: kaart van de spanning van de Real-time integrine van een vis keratocyte en NIH-3T3. (A) A vis keratocyte en haar kaart van integrine spanning. (Linksboven) Een motile vis keratocyte. (Linksonder) De kaart van de spanning van het integrine van de keratocyte die zijn gemeld door de ITS. (Rechtsboven) Real-time integrine spanning werd verkregen door frame aftrekken. Het laat zien dat de nieuw gegenereerde integrine spanning is colocalized met de achterste rand van de cel. (Rechtsonder) Integrine spanning kaart (groen) en real-time integrine spanning (magenta) worden gepresenteerd in een samengevoegde afbeelding. De schaal bar = 10 µm. (B) een NIH-3T3 fibroblast en haar kaart van integrine spanning. (Linksboven) Een NIH-3T3 fibroblast. (Linksonder) De kaart van de spanning van het integrine van de NIH-3T3 fibroblast. Integrine spanning werd gemaakt in een strookpatroon. (Rechtsboven) Real-time integrine spanning laat zien dat de nieuw gegenereerde integrine spanning voornamelijk op de perifere regio van de cel vormt. (Rechtsonder) Integrine spanning kaart (groen) en real-time integrine spanning (magenta) worden gepresenteerd in een samengevoegde afbeelding. De schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Coimaging van integrine spanning en cel structuur. (A) Coimaging van integrine spanning, vinculin en F-actine in een keratocyte. De keratocyte werd vastgesteld en immunostained vinculin en F-actine te rapporteren. (B) Coimaging van integrine spanning, vinculin en F-actine in een cel CHO-K1. De schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het ITS is een zeer toegankelijke maar toch krachtige techniek voor mobiele dwingen toewijzing in termen van zowel de synthese en de toepassing. Met alle materialen klaar, kan de ITS gesynthetiseerd worden binnen 1 dag. Tijdens experimenten, zijn slechts drie stappen van de oppervlaktelaag nodig voorafgaand aan cel beplating. Onlangs, we verder vereenvoudigd de coating procedure naar een stap door de ITS rechtstreeks te koppelen aan bovien serumalbumine, waardoor directe fysieke adsorptie van ITS glas of polystyreen oppervlakken33. ITS brengt de fluorescerende intensiteit van cellulaire kracht signaal tot een vergelijkbaar niveau van cellulaire structurele imaging. De handige synthese en de bereiding van de monsters, de bescheiden eisen voor microscopie en hoge gevoeligheid voor cellulaire kracht maken de ITS een robuuste en betrouwbare techniek voor de studie van de mechanica van de cel. In deze paper presenteerden we een uitgebreide procedure voor de synthese en de toepassing.

Conjugating RGD is ligand met ssDNA de meest kritische procedure in de ITS-synthese. Zoals vermeld in de sectie protocol, is de NHS ester op sulfo-SMCC niet stabiel in water. Hoe langer het duurt om te ontbinden sulfo-SMCC in het water, de meer hoeveelheid sulfo-SMCC verliest NHS ester hydrolyse en wordt "blindganger", die conjugaten met DNA door de maleimide-thiol reactie maar niet conjugaat met RGD-NH2. Dientengevolge, een groot deel van de DNA moleculen zullen worden bezet door de dode sulfo-SMCC en niet koppelen met RGD, wat leidt tot een lage rendement van ssDNA-RGD. Om deze reden moet ontbinding van de sulfo-SMCC in water worden ingevuld snel, in het algemeen binnen 1 min. Het is ook aanbevolen om te controleren van het rendement van ssDNA-RGD met elektroforese. Als de opbrengst hoger is dan 80%, is zuivering over het algemeen niet nodig. Anders, DNA zuivering door polyacrylamidegel is aanbevolen. De opbrengst van DNA door polyacrylamidegel is ongeveer 60%-80%.

Om een redelijke hoeveelheid RGD-ssDNA-BHQ2synthetiseren, moet het beginbedrag thiol-ssDNA-BHQ2 ten minste 20 nmol (1 mM x 20 µL). Opmerking dat DNA wijzigingen aanzienlijk de hoeveelheid van de ssDNA van DNA bedrijven besteld verminderen. Bijvoorbeeld, als 1.000 nmol van ssDNA met twee wijzigingen is besteld, het gegarandeerde rendement alleen mogelijk 20 nmol. Als dit het geval, ten minste 1.000 nmol van ssDNA voor de vervoeging van de RGD-ssDNA bestellen Onderzoekers kunnen ook hun eigen reeksen voor haar constructies ontwerpen. Normaal, houden we de GC-inhoud in de ITS hoger is dan 70% te verbeteren van de thermische stabiliteit van dsDNA. DNA sequentieanalyse kan worden uitgevoerd om te minimaliseren van de kans op vorming van zelf-haarspeld, zelf hybridisatie, stabiele secundaire structuur, enz. De analysefunctie is online beschikbaar. In het manuscript is de bovenste streng DNA hetzelfde voor ITSs met verschillende Ttol. We variëren de Biotine-locatie in het lagere strand DNA om een verschillende Ttol. Variërend van de locatie van de RGD op het bovenste onderdeel kan echter worden ook toegepast om af te stemmen op de T-tol van ITS. De berekening van Ttol voor een verschillende dsDNA geometrie wordt verzorgd door Wang en Ha22 en Mosayebi et al.34, vooral voor de dsDNA in de unzipping modus35,36 en de afschuiving modus 37,,38.

Hoewel de oppervlakken alle spanningen van integrine die hebben plaatsgevonden in het verleden registreren, door het opnemen van een video van de cellulaire kracht kaart opeenvolgend, kunnen onderzoekers de integrine spanning geproduceerd in het laatste frame interval door af te trekken van het vorige frame berekenen van een huidige frame voor het genereren van de 'toond cellulaire kracht kaart'. Het frame-interval in de ITS-video is afhankelijk van de celtypes, maar is meestal 20 s voor snel migreren cellen en 1-2 min voor stationaire cellen. De frame aftrekken methode meldt de toond integrine spanning met behoud van de hoge gevoeligheid voor beeldvorming van integrine spanning als gevolg van het signaal accumulatie effect. Photobleaching is minimaal tussen twee opeenvolgende beelden en heeft daarom geen waarneembare invloed aan het frame aftrekken methode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door het opstarten Fonds verstrekt door Iowa State University en door het National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  3. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
  4. Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
  5. Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
  6. Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
  7. Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
  8. Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
  9. Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
  10. Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
  11. Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
  12. Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
  13. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  14. Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
  15. Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  16. Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
  17. Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
  18. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
  19. Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  20. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
  21. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  22. Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
  23. Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
  24. Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
  25. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  26. Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
  27. Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
  28. Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
  29. Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  30. Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
  31. Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
  32. Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
  33. Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
  34. Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
  35. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
  36. Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
  37. de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
  38. Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).

Tags

Retractie kwestie 146 cel mechanica mechanobiology integrine integrine spanning cellulaire kracht toewijzing integrine spanning sensor
Imaging integrine spanning en cellulaire kracht bij Submicron resolutie met de Sensor van een integratieve spanning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X.… More

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter