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Bioengineering

D’imagerie intégrine Tension et Force cellulaire à résolution submicronique avec un capteur de Tension intégrative

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

Intégrine tension joue un rôle important dans diverses fonctions cellulaires. Avec un capteur de tension intégrative, tension intégrine est calibrée avec une sensibilité de picoNewton (pN) et image à résolution submicronique.

Abstract

Moléculaire tension transmise par obligations intégrine-ligand est le signal mécanique fondamental dans la voie de l’intégrine qui joue un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires et les comportements. Pour calibrer et image intégrine tension avec force haute sensibilité et une résolution spatiale, nous avons développé un capteur de tension intégrative (STI), un capteur de tension fluorescent basées sur l’ADN. L’EVI est activé pour une fluorescence si maintient une tension moléculaire, convertissant ainsi la force de signal fluorescent au niveau moléculaire. Le seuil de tension pour l’activation de la STI est accordable dans la fourchette de 10 à 60 pN qui couvre bien la plage dynamique de l’intégrine tension dans les cellules. Sur un substrat greffé avec une ITS, la tension de l’intégrine des cellules adhérentes est visualisée par fluorescence et image à résolution submicronique. L’EVI est également compatible avec l’imagerie structurale cellulaire dans les cellules vivantes et les cellules fixes. La STI a été appliquée avec succès à l’étude de la contraction de plaquettes et la migration cellulaire. Cet article détaille la procédure pour la synthèse et l’application de la STI dans l’étude de force cellulaire intégrine-transmis.

Introduction

Cellules s’appuient sur les intégrines adhérer et d’exercer des forces cellulaires à la matrice extracellulaire. Transmission de force et adhérence cellulaire intégrine sont cruciales pour cellule diffusion1,2, migration3,4et survie5,6,7. À long terme, signalisation biomécaniques intégrine influe également sur cellule prolifération8,9,10 et différenciation11,12. Les chercheurs ont mis au point différentes méthodes pour mesurer et cellulaire de l’intégrine-transmis de carte oblige à l’interface de la cellule-matrice. Ces méthodes sont basées sur substrat élastique13, tableau de micropost14, ou atomique force microscopy (AFM)15,16. Méthodes élastiques de substrat et micropost reposent sur la déformation de substrats pour signaler le stress cellulaire et ont des limites en termes de résolution spatiale et forcer la sensibilité. AFM a force de haute sensibilité, mais il ne peut pas détecter la force à plusieurs endroits en même temps, compliquant la carte cellulaire force transmises par les intégrines.

Ces dernières années, plusieurs techniques ont été développées pour étudier la force cellulaire au niveau moléculaire. Un ensemble de capteurs de tension moléculaires basés sur polyéthylène glycol17,18, araignée de soie peptide19et ADN20,21,22,,23 ont été développés pour visualiser et surveiller la tension transmise par les protéines moléculaires. Parmi ces techniques, l’ADN a été adopté comme le matériau de synthèse dans la tension jauge d’attache (TGT), un linker cassables qui module la limite supérieure de l’intégrine tensions dans des cellules vivantes22,24. Plus tard, technique de transfert de résonance ADN et fluorescence ont été combinés pour créer en épingle à cheveux capteurs basés sur l’ADN fluorescente tension tout d’abord par Chen groupe23 et groupe20 de Salaita. Le capteur de tension basées sur l’ADN en épingle à cheveux intégrine tension en temps réel des rapports et a été appliqué avec succès à l’étude d’une série de fonctions cellulaires21. Par la suite, laboratoire de Wang combiné un TGT avec la paire de fluorophore-extincteur à tension intégrine rapport. Ce capteur est appelé une ITS25,26. La STI sont basée sur l’ADN à double brin (dsDNA) et a une plage dynamique plus large (pN 10-60) pour l’étalonnage de l’intégrine tension. Contrairement aux capteurs de basées sur l’ADN de l’épingle à cheveux, la STI ne signalent pas de force cellulaire en temps réel mais enregistre tous les événements de l’intégrine historique comme l’empreinte de force cellulaire ; ce processus d’accumulation de signal améliore la sensibilité cellulaire force d’imagerie, rendant possible à force cellulaire de l’image, même avec un microscope à fluorescence bas de gamme. La synthèse des STI est relativement plus pratique, car elle est créée par l’hybridation des deux ADN simple brin (ssDNA).

L’EVI est un ADN double brin 18-base-jumelé, conjugué à la biotine, un fluorophore, un désactiveur (Black Hole Quencher 2 [BHQ2])27et un acide (RGD) peptide cyclique arginylglycylaspartic28 comme un ligand de peptide intégrine (Figure 1). Le brin inférieur est conjugué avec le fluorophore (Cy3 est utilisé dans ce manuscrit, tandis que d’autres colorants, par exemple, série Cy5 ou Alexa, ont également fait leurs preuves possible dans notre laboratoire) et la balise de biotine, avec laquelle l’EVI est immobilisé sur un substrat par liaison biotine-avidine. Le brin supérieur est conjugué avec le peptide RGD et l’extincteur de trou noir, qui assouvit Cy3 avec environ 98 % trempe efficacité26,27. Avec le protocole présenté dans cet article, la densité du revêtement de l’ITS sur un substrat est d’environ 1 100/µm2. Il s’agit de la densité qui que nous a été calibrés pour 18 bp biotinylé dsDNA enduit sur le substrat Neutravidine fonctionnalisés en suivant le même protocole29de revêtement. Lorsque les cellules adhèrent au substrat recouvert de l’EVI, intégrine lie l’ITS par RGD et transmet la tension à la STI. La STI a une tolérance de tension spécifique (Ttol) qui est définie comme le seuil de tension qui sépare mécaniquement l’ADN double brin de l’ITS au sein de 2 s22. SA rupture par l’intégrine tension mène à la séparation de l’extincteur de la teinture qui émet par la suite par fluorescence. Par conséquent, la tension de l’intégrine invisible est convertie en un signal de fluorescence et la force cellulaire peut être mappée par imagerie de fluorescence.

Pour illustrer l’application de la STI, nous utilisons des poissons keratocyte ici, un modèle de cellule largement utilisée pour cell migration étude30,31,32, cellules CHO-K1, une lignée cellulaire non motile couramment utilisés et fibroblastes 3 t 3 NIH. Coimaging des structures de tension et de la cellule intégrine est également effectué.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’utilisation (IACUC, 8-16-8333-I) de l’Iowa State University et d’institutionnels animalier.

1. synthèse de la sonde de tension intégrative

  1. Personnalisez et commandez ssDNAs (voir la Table des matières).
    Remarque : Les séquences d’ADN simple brin sont comme suit. Le brin supérieur est /5ThioMC6-D/GGG AGG NOC CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. Les brins inférieurs sont comme suit.
    12 pN ITS : GGC GCC CTG CGT TDC CCC /3Bio//5Cy3 /
    pN 23 ITS : GGC GCC CTG CGT CC /iBiodT/ / 5Cy3/CCC
    33 AP ITS : / 5Cy3/GGC GCC CTG CG/iBiodT/CCC du tarif douanier commun
    pN 43 ITS : / 5Cy3/GGC GCC C/iBiodT/G CGT TDC CCC
    54 avis ITS : /5Biosg / / iCy3/GGC CCC CTG CGT CCT GCC
    Ici, /5ThioMC6-D / représente un modificateur de thiol C6 S-S (disulfure) à l’extrémité 5'. /3BHQ_2/ représente un trou noir Quencher 2 à l’extrémité 3'. 3Bio / /, / 5Biosg/et /iBiodT/ sont respectivement biotinylation à l’extrémité 3', l’extrémité 5' et sur la thymine de l’ADN interne. /iCy3/ représente un Cy3 insérée dans l’ossature interne de l’ADN simple brin. Ces codes sont utilisés par le fournisseur commercial spécifique utilisé ici et peuvent être différentes dans d’autres sociétés de l’ADN.
  2. Peptide RGD conjugué à l’ADN simple brin-SH-extincteur.
    Remarque : Les réactifs utilisés sont la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-CCAP), peptide RGD et tris-(2-carboxyethyl) chlorhydrate de phosphine, également connu sous le nom de PTCE-HCl.
    1. Déprotéger le modificateur de thiol sur l’ADN du brin supérieur à l’aide de la solution TCEP.
      NOTE : DNAs thiols modifiés commandées auprès d’une source commerciale sont livrés sous forme oxydée, avec les atomes de soufre, protégées par un pont disulfure qui a besoin d’être réduite avant la conjugaison RGD-ADN. PTCE est un réactif de réduction inodore utilisé pour la déprotection de thiol.
      1. Dissoudre 14,3 mg de PTCE-HCl dans 300 µL d’eau. Ajuster le pH de la solution de PTCE à ~7.2–7.4 avec la solution de NaOH 1 M (environ 150 µL), à l’aide de copies d’examen de pH. Ajouter de l’eau pure pour faire un volume final de 0,5 mL. La concentration finale de PTCE est de 100 mM.
        Remarque : Il est recommandé de faire la solution PTCE frais, chaque fois pour la déprotection de thiol ADN. Éviter le stockage solution PTCE pendant une longue période.
      2. Ajouter 100 µL d’une solution (EDTA) acide éthylènediaminetétraacétique M 0,5 à 400 µL d’eau à la solution TCEP.
      3. Ajouter 10 µL de la solution PTCE + EDTA à 20 µL de thiol-ADN-BHQ2 1 mM dans du PBS. Laisser la solution agir pendant 30 min à température ambiante.
        Remarque : La liaison disulfure de 5' modificateur thiol conjugaison C6 S-S à cet ADN simple brin va être clivée par TCEP, laissant le groupe thiol prêt pour la réaction avec le maléimide dans les prochaines étapes. Le TCEP n’interfère pas avec la réaction de thiol-maléimide suivante ; ainsi, il n’est pas nécessaire passiver PTCE après cette étape.
    2. Conjugué RGD-NH2 avec sulfo-CCAP.
      1. Dissoudre 5 mg de RGD-NH2 dans 100 µL de PBS pour obtenir 11 mM RGD-NH2.
      2. Ajouter 200 µL d’eau pure dans le tube avec 2 mg de sulfo-CCAP (livré par le fournisseur). Briser le solide sulfo-CCAP avec un embout de la pipette et pipeter vigoureusement à la fois pour faciliter la dissolution du comité de coordination dans l’eau. La concentration du sulfo-CCAP sera de 23 mM.
        Remarque : Parce que l’ester de NHS en sulfo-CCAP est soumise à l’hydrolyse et a une durée de vie de quelques minutes, cette étape de dissolution doit être établie au sein de 1 min pour éviter la perte excessive de l’ester de NHS en raison de l’hydrolyse. Utiliser l’eau pure pour dissoudre sulfo-CCAP parce que sa solubilité dans PBS ou autres tampons est pauvre.
      3. Ajouter 40 µL de solution sulfo-CCAP dans le 100 µL de solution de2 RGD-NH et il incuber pendant 20 min.
        Remarque : L’ester de NHS en sulfo-CCAP va réagir avec le groupe amine RGD-NH2, formant une liaison amide qui relie RGD et sulfo-CCAP.
    3. Conjuguer RGD-CCAP avec le SH-ssDNA-extincteur.
      1. Mélanger les solutions préparées aux étapes 1.2.1 et 1.2.2 et incuber le mélange pendant 1 h à température ambiante. Passer la solution à un ensemble de réfrigérateur à 4 ° C et laisser réagir davantage pendant la nuit. Le thiol conjugué sur l’ADN du brin supérieur réagira avec maléimide sur sulfo-CCAP, formant un groupe thioéther qui relie RGD avec le brin supérieur ADN.
    4. Effectuer la précipitation d’éthanol pour purifier RGD-ssDNA-désactivateur de sulfo-SMCC n’ayant pas réagi, RGD et TCEP.
      1. Faites refroidir 10 mL d’éthanol à 100 % dans un tube conique de 15 mL dans un congélateur à-20 ° C pendant au moins 30 min.
      2. Mélangez une solution de NaCl à 3 M, une solution d’ADN et éthanol réfrigérée dans un rapport de volume de 01:10:25. Gardez le liquide mélangé dans un congélateur à-20 ° C pendant 30 min ou jusqu'à ce que l’ADN est précipité.
      3. Centrifuger le liquide à 10 000 x g pendant 30 min. éliminer le surnageant.
      4. PBS s’ajoute le granule d’ADN. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectromètre.
    5. (Facultatif) Effectuer l’électrophorèse d’ADN afin d’obtenir une pureté supérieure de la RGD-ADN simple brin.
      Remarque : Avec le protocole ci-dessus, environ 70 % à 90 % de l’ADN simple brin va se conjuguer avec le RGD. Si le degré de pureté supérieur est souhaitée, l’électrophorèse d’ADN peut également effectuer pour séparer l’ADN conjugué de l’ADN.
      1. Assembler un système d’électrophorèse verticale.
      2. Préparer une solution de 10 % sur gel de polyacrylamide en mélangeant à 50 mL d’eau pure, 20 mL de gel d’acrylamide 40 %, 8 mL de tris-borate-EDTA (TBE) mémoire tampon 10 x et 800 µL de persulfate d’ammonium 10 % (APS).
      3. Ajouter 80 µL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans la solution de gel. Versez la solution dans la chambre de verre de la système d’électrophorèse. Insérer un peigne de puits pour créer un puits de surface du gel. Attendre pendant 10 min jusqu'à ce que le gel est réticulé.
      4. Mélanger la solution d’ADN avec 100 % de glycérol à un rapport de volume de 1:1. Retirer le peigne et chargez la solution d’ADN au gel bien.
      5. Exécutez le gel à une tension 200 V. Observe deux de bandes d’ADN dans laquelle le retard on est l’ADN conjugué.
      6. Couper la bande de gel avec l’ADN conjugué et il dés en petits morceaux.
      7. Recueillir le gel en dés dans deux tubes à centrifuger 1,5 mL avec filtres. Ajouter 500 µL de PBS dans chaque tube.
      8. Mettre le gel imbibé de PBS dans un endroit sombre à température ambiante pendant 1 nuit. ADN diffusera sur les morceaux de gel dans du PBS.
      9. Recueillir la solution d’ADN par centrifugation des tubes à 1 000 x g pendant 2 min.
      10. Effectuer une nouvelle série de précipitation d’éthanol (étape 1.2.4) pour recueillir de l’ADN.
  3. Synthétiser l’ITS en hybridant RGD-ssDNA-extincteur et colorant-ssDNA-biotine.
    1. Mélanger les solutions le brin supérieur et le brin inférieur DNAs un rapport molaire de 1.1:1. Garder le mélange à 4 ° C durant la nuit pour produire l’ITS par hybridation de l’ADN.
      NOTE : Un rapport molaire de 1.1:1 pour l’hybridation de l’ADN est utilisé au lieu de 1:1. Excessive RGD-ssDNA-extincteur sert à s’assurer que tous les colorants-ssDNA-biotine s’hybrident avec RGD-ssDNA-extincteur. RGD-ssDNA-extincteur sans hybridation est lavé au large au cours de revêtement de surface, qui n’affectera pas la qualité de revêtement de surface de STI.
    2. Aliquote et stocker la solution de STI à-20 ° C pendant l’entreposage à long terme.
      Remarque : Le tampon de stockage est PBS et la concentration de stockage sera généralement au-dessus de 10 µM. Pour un usage régulier, la solution peut être conservée à 4 ° C pendant plusieurs semaines sans détérioration de la qualité perceptible.

2. la préparation de toutes les surfaces en immobilisant l’EVI sur boîtes de Petri à fond de verre

Remarque : Les réactifs utilisés sont biotinylated l’albumine sérique bovine (BSA-biotine), protéine avidine et STI. Faites refroidir tous les réactifs et tampon PBS à autour de 0 ° C sur la glace avec un seau à glace.

  1. Charger 200 µL de BSA-biotine 0,1 mg/mL dans du PBS sur la cupule d’une boîte de Petri à fond de verre (29 mm de diamètre, avec un puits de 14 mm). Il incuber 30 min à 4 ° C dans un réfrigérateur. BSA-biotine est physiquement adsorbé sur la surface du verre.
  2. Aspirer la solution de la bien en utilisant une pipette et ajouter 200 µL de PBS vers le puits pour laver la surface. Répétez cette x 3 pour compléter le lavage.
  3. Incuber 200 µL de 50 µg/mL avidine de protéines dans le puits pendant 30 min à 4 ° C. Laver 3 fois avec du PBS. Après cette étape, la protéine avidine se lie à la BSA-biotine et devient immobilisée sur la surface du verre.
  4. Incuber 200 µL de 0,1 µM ITS dans le puits pendant 30 min à 4 ° C. Laver le plat avec 3 x avec du PBS. Laissez les PBS dans le puits jusqu'à ce que le bordé de la cellule. Après cette étape, l’ITS avec l’étiquette de biotine se lie à la protéine avidine et devient immobilisé sur la surface.
    Remarque : Une précaution essentielle pour sa qualité de revêtement et d’homogénéité durant l’immobilisation de la STI est de ne jamais laisser la surface de la boîte de pétri se tarir. Garder tous les réactifs et les PBS à 4 ° C ou autour de 0 ° C sur la glace avec une aide de seau à glace pour réduire le taux d’évaporation de l’eau au cours des étapes de lavage, quand PBS est étiré du puits.

3. cellule électrodéposition sur toutes les surfaces

  1. Keratocytes de culture de poissons.
    NOTE : Ici, Cyprin doré (Carassius auratus) est utilisé à titre d’exemple, mais les autres espèces de poissons peuvent également travailler.
    1. Arracher un morceau d’écailles d’un poisson avec une pince à embout plat. Appuyez doucement sur l’échelle sur la cupule d’une boîte de Petri à fond de verre, avec le côté intérieur de l’échelle communiquant avec le verre. Attendre environ 30 s pour les écailles à adhèrent parfaitement à la surface du plat.
    2. Ajouter 1 mL de Iscove modifié moyen (IMDM) complet moyen de Dulbecco pour recouvrir entièrement l’échelle à poissons. Conservez la boîte de pétri dans une boîte sombre et humide pendant 6 à 48 h à température ambiante.
      NOTE : Milieu complet IMDM contient 79 % IMDM + 20 % sérum fœtal (SVF) + 1 % la pénicilline. Aucune provision supplémentaire d’oxygène ou de CO2 n’est nécessaire. Quelques rouleaux de papier absorbant imbibés d’eau peuvent être laissés dans la boîte de maintenir une humidité élevée dans la zone. Keratocytes poisson va migrer hors de l’échelle à poissons en une couche de cellules après quelques heures. Ceci peut être observé avec un microscope de culture de tissus. Les cellules sont généralement viables à 48 h.
  2. Détacher et plaque les cellules keratocytes sur des surfaces de STI.
    1. Retirez le support de la boîte de pétri dont les écailles ont été cultivés. Lavez le bien 1 x avec cellule de détacher la solution et ajouter une solution radiofréquence pour couvrir les écailles et laisser incuber pendant 3 min.
      NOTE : La recette pour la cellule détachement de solution d’EDTA est comme suit : 100 mL de 10 x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) + 10 mL de 1 M HEPES (pH 7,6) + 10 mL de bicarbonate de sodium 7,5 % + 2,4 mL d’EDTA 500 mM + 1 L de H2O. Le pH est ajusté à 7,4.
    2. Aspirer toutes les cellules détacher la solution et ajouter le milieu complet IMDM. Disperser les keratocytes en pipettant également, doux. Ajuster la densité cellulaire de solution désirée (1 x 104– 1 x 105/ml). Plaque des cellules sur la surface de l’ITS (établi conformément à l’article 2). Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 min avant l’imagerie.
      NOTE : Comptage de cellule peut être fait avec un hémocytomètre après avoir détaché les cellules avec le détachement de solution. La cellule densité d’électrodéposition est relativement faible, afin que les keratocytes ont beaucoup de surface à migrer.
  3. Cellules CHO K1 plaque et cellules 3 t 3 NIH sur toutes les surfaces.
    NOTE : Le support pour les cellules CHO-K1 est F12 du jambon 89 % + 10 % BF + pénicilline 1 %. Le milieu de cellules 3 t 3 NIH est médium de l’aigle modifié de 89 % Dulbecco (DMEM) + 10 % de sérum bovin veau (CBS) + 1 % la pénicilline. Les conditions de culture sont à 37 ° C et 5 % de CO2.
    1. Cellules CHO K1 culture ou NIH 3 t 3 cellules à confluence de 80 à 100 % dans une boîte de pétri (ou flacon de culture).
    2. Chauffer la cellule détachement de solution et milieu de culture à 37 ° C.
    3. Supprimez tout milieu de culture dans la boîte de pétri avec une pipette. Laver les cellules 1 x avec cellule détachement solution. Couvrir les cellules avec le détachement de solution et il incuber à 37 ° C pendant 10 min.
    4. Disperser les cellules de pipetage. Recueillir la solution cellulaire et il centrifuger à 300 g pendant 3 min.
    5. Aspirer le surnageant et ajouter le milieu complet ou un milieu sans sérum.
    6. Ajuster la densité cellulaire de solution désirée (1 x 105 – 1 x 106/ml). Plaque des cellules sur les surfaces de STI (établis conformément à l’article 2). Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 à 2 h avant d’imagerie, ou 30 min avant l’enregistrement vidéo.

4. l’imagerie, l’enregistrement vidéo et la cartographie de tension en temps réel de l’intégrine

  1. Imagerie quasi-réel intégrine tension dans des cellules vivantes
    1. Incuber keratocytes sur toutes les surfaces (établis conformément à l’article 2) pendant 30 min à température ambiante, ou incuber les cellules CHO-K1 ou cellules 3 t 3 NIH pendant 1 h sur toutes les surfaces dans un incubateur à 37 ° C.
    2. Monter la boîte de pétri sur une scène de microscopie de fluorescence. Effectuer l’imagerie cellulaire de force avec un temps de pose de 1 s. Le grossissement est 40 x ou x 100.
    3. Prendre une vidéo de ses images avec un intervalle de trame de 20 s pour keratocytes ou 1 – 2 min pour cellules CHO-K1 ou cellules 3 t 3 NIH.
    4. Utiliser MATLAB ou un autre outil de l’analyse d’image pour soustraire une image précédente de la vidéo de STI depuis une frame actuel pour calculer le signal ITS nouvellement produit dans le dernier intervalle de trame. Le signal de STI nouvellement produit représente la tension intégrine générée dans le dernier intervalle de trame, rapports ainsi la force cellulaire d’une manière quasi-réel.
  2. Coimaging de tension de l’intégrine et structure cellulaire dans les cellules immunocolorées
    1. Après l’étape 3.2.2 ou 3.3.6, exécuter immunostaining pour marquer les protéines structurales de la cible.
      Remarque : Utilisez des colorants différents pour éviter la diaphonie fluorescence entre intégrine tension imagerie et imagerie structurale des cellules. Dans ce manuscrit, Cy5 fluorophore servait pour la phalloïdine et Alexa 488 a été utilisé pour la coloration de la vinculine. La concentration d’anticorps primaires et secondaires est 2,5 µg/mL. La concentration pour la phalloïdine est 1,5 unités/µL.
    2. Exécuter multifluorescent canal d’imagerie afin d’acquérir une carte de tension intégrine et imagerie structurale des cellules.

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Representative Results

Avec le SCI, le plan de tension intégrine des keratocytes de poisson a été capturé. Il montre qu’un keratocyte migre et génère l’intégrine tension à deux pistes de force (Figure 2 a). La résolution de la carte de force a été calibrée pour être 0,4 µm (Figure 2 b). Intégrine haute tension se concentre sur la marge arrière (Figure 3 a). L’ITS montre également différents modes spécifiques de différentes cellules. Une cellule non motile, NIH-3 t 3, constitue un motif de tension intégrine spécifique (Figure 3 b) tout à fait différent de celle de la keratocyte de migration rapide.

Avec immunomarquage, adhérences focales et la tension de l’intégrine de poissons keratocytes étaient coimaged (Figure 4 a). La relation entre la tension de l’intégrine et structure cellulaire dans keratocytes a été étudiée en détail par Wang et al.,25. Intégrine fibres de tension et le stress dans les cellules CHO-K1 ont été également coimaged (Figure 4 b). Ces expériences montrent que la STI permettent la coimaging de la force d’adhérence cellulaire et structures cellulaires simultanément sous les paramètres d’imagerie similaires, ce qui facilite l’étude de l’interaction structure/force de cellule.

Figure 1
Figure 1 : schémas de la sa. L’EVI est un ADN double brin décoré avec un ligand RGD, un désactiveur de fluorescence, une teinture et une balise de biotine. Le colorant (cercle rempli de vert) est piégée par l’extincteur. Sous tension de l’intégrine, l’ADN double brin est rompue et Cy3 est libéré de la trempe et émet de fluorescence qui peut être détectée par microscopie à fluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : carte de tension intégrine d’un keratocyte de poisson et de la résolution submicronique de l’ITS. (A) pendant la migration rapide, un keratocyte génère systématiquement une carte de tension intégrine dans deux voies de la force. (B) la distance entre les deux pistes de force est en général 40 µm. La résolution spatiale de la carte cellulaire force imagée par l’ITS est d’environ 0,4 µm. Le profil linéaire de l’intensité de fluorescence Cy3 de la zone délimitée par une ligne rouge courte dans le panneau inférieur gauche est calculé pour l’étalonnage de la résolution en imagerie cellulaire de force. Le résultat est indiqué dans le panneau de droit et muni d’une courbe de Gauss. La barre d’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : carte de tension intégrine en temps réel d’un poisson keratocyte et NIH-3 t 3. (A) A keratocyte de poisson et sa carte de tension intégrine. (Coin supérieur gauche) Un keratocyte de poisson motiles. (En bas à gauche) Intégrine carte de tension de la keratocyte signalée par le SCI. (En haut à droite) Tension en temps réel de l’intégrine a été obtenue par soustraction de la trame. Il montre que la tension de l’intégrine nouvellement généré est colocalisée avec le bord arrière de la cellule. (En bas à droite) Carte de tension intégrine (vert) et en temps réel de l’intégrine tension (magenta) sont présentés dans un chiffre fusionné. La barre d’échelle = 10 µm. (B) un NIH-3 t 3 fibroblaste et sa carte de tension intégrine. (Coin supérieur gauche) Un fibroblaste de NIH-3 t 3. (En bas à gauche) Carte de tension intégrine des fibroblastes de NIH-3 t 3. Intégrine tension a été générée en un motif de rayure. (En haut à droite) Tension en temps réel de l’intégrine montre que l’intégrine nouvellement généré tension forme principalement à la région périphérique de la cellule. (En bas à droite) Carte de tension intégrine (vert) et en temps réel de l’intégrine tension (magenta) sont présentés dans un chiffre fusionné. La barre d’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Coimaging de structure de tension et de la cellule intégrine. (A) Coimaging de tension de l’intégrine, vinculine et actine-F dans un keratocyte. Le keratocyte a été corrigé et immunomarquage déclarer vinculine et actine-F. (B) Coimaging de tension de l’intégrine, vinculine et F-actine dans une cellule CHO-K1. La barre d’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’EVI est un très accessible et pourtant une technique puissante pour cellulaire forcer en termes de synthèse et application. Avec tout le matériel prêt, le STI peuvent être synthétisé dans 1 jour. Au cours d’expériences, seulement trois étapes de revêtement de surface sont nécessaires avant la culture cellulaire. Récemment, nous avons simplifié davantage la procédure de revêtement à une seule étape en reliant directement l’ITS à l’albumine sérique bovine, qui permet l’adsorption physique directe de l’ITS au verre ou polystyrène33. L’ITS apporte l’intensité de fluorescence du signal cellulaire de force à un niveau comparable d’imagerie structurale cellulaire. La synthèse pratique et la préparation de l’échantillon, des exigences modestes pour la microscopie et une grande sensibilité pour cellulaire force font l’EVI une technique robuste et fiable pour l’étude de la mécanique de la cellule. Dans cet article, nous avons présenté une procédure globale pour sa synthèse et son application.

Conjugaison RGD ligand avec ADN simple brin est la procédure plus critique dans la synthèse de la STI. Comme mentionné dans la section protocole, l’ester de NHS sur sulfo-SMCC n’est pas stable dans l’eau. Plus, il faut pour dissoudre sulfo-CCAP dans l’eau, la quantité plus de sulfo-CCAP perd ester NHS à l’hydrolyse et devient « raté », qui conjugue avec de l’ADN par la réaction de la maléimide-thiol, mais ne parvient pas à conjuguer avec RGD-NH2. En conséquence, une grande partie des molécules d’ADN sera occupée par le sulfo-CCAP mort et ne pouvez pas lier avec RGD, conduisant à un faible rendement de ssDNA-RGD. Pour cette raison, dissolvant le sulfo-CCAP dans de l’eau doit être effectué rapidement, généralement moins de 1 min. Il est également recommandé de vérifier le rendement de l’ADN simple brin-RGD avec électrophorèse. Si le rendement est supérieur à 80 %, purification n’est généralement pas nécessaire. Dans le cas contraire, il est recommandée de purification de l’ADN en gels de polyacrylamide. Le taux de récupération de l’ADN en gel de polyacrylamide est environ 60 % à 80 %.

Pour synthétiser une quantité raisonnable de RGD-ssDNA-BHQ2, le montant de départ de thiol-ssDNA-BHQ2 devrait être au moins 20 nmol (1 mM x 20 µL). Notez que les modifications de l’ADN réduisent considérablement la quantité de l’ADN simple brin commandé auprès de sociétés de l’ADN. Par exemple, si 1 000 nmol d’ADNsb avec toutefois deux modifications est ordonné, le rendement garanti peut être seulement 20 nmol. Si c’est le cas, ordonner au moins 1 000 nmol d’ADN simple brin pour la conjugaison RGD-ADN simple brin. Les chercheurs peuvent également concevoir leurs propres séquences pour ses constructions. Normalement, nous gardons le contenu en GC à l’ITS supérieur à 70 % pour améliorer la stabilité thermique de l’ADN double brin. Analyse de séquences d’ADN peut être effectuée afin de minimiser la probabilité de formation de self-épingle à cheveux, self hybridation, structure secondaire stable, etc.. L’outil d’analyse est disponible en ligne. Dans le manuscrit, le brin supérieur ADN est le même pour les secrétariats professionnels internationaux avec différents Ttol. Nous avons fait varier l’emplacement de la biotine dans le brin inférieur ADN pour atteindre un autre Ttol. Cependant, variant de l’emplacement du RGD sur le brin supérieur peut être également appliqué pour régler la Ttol de l’ITS. Le calcul de Ttol pour une géométrie différente dsDNA est fourni par Wang et Ha22 et al. Mosayebi34, notamment pour l’ADN double brin dans la décompression de35,de mode36 et le mode de cisaillement 37,,38.

Bien que toutes les surfaces d’enregistrer toutes les tensions de l’intégrine qui ont eu lieu dans le passé, en enregistrant une vidéo de la carte de force cellulaire consécutivement, chercheurs peuvent de calculer la tension de l’intégrine produite dans le dernier intervalle de trame en soustrayant l’image précédente partir d’un cadre actuel pour générer la « feuille de quasi-réel force cellulaire ». L’intervalle de trame dans la vidéo de STI varie selon les types de cellules, mais est généralement de 20 s pour cellules migration rapides et 1 – 2 min pour cellules stationnaires. La méthode de soustraction d’image indique la tension de l’intégrine quasi-réel tout en conservant la sensibilité élevée pour l’imagerie intégrine tension due à l’effet de l’accumulation de signal. Photoblanchiment est minime entre deux images consécutives et n’a donc aucune influence observable à la méthode de soustraction d’image.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le fonds de démarrage fourni par l’Iowa State University et par le National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

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References

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Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X.… More

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

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