Summary
Integrin 긴장 다양 한 세포 기능에 중요 한 역할을 담당합니다. 통합 긴장 센서 integrin 긴장은 picoNewton (pN) 감도 보정와 서브 마이크론 해상도 몇 군데.
Abstract
Integrin 리간드 결합에 의해 전송 분자 긴장은 많은 세포 기능 및 동작에 중요 한 역할을 재생 integrin 통로에 근본적인 기계 신호입니다. 보정 고 integrin 긴장 높은 힘 감도와 해상도 이미지, 우리는 통합 긴장 센서 (ITS), 형광 긴장 DNA 기반 센서 개발. ITS 힘 분자 수준에서 형광 신호에 따라서 변환 형광 분자 긴장을 유지 하는 경우에 활성화 됩니다. ITS 활성화에 대 한 긴장 임계값은 10-60 pN 잘 셀에서 integrin 긴장의 동적 범위를 커버 하는 범위에서 조정할 수 있습니다. ITS와 융합 하는 기판에 부착 세포의 integrin 긴장 형광에 의해 시각 이며 서브 마이크론 해상도 몇 군데. ITS는 또한 라이브 셀에 고정된 셀 셀 구조 이미징에 호환 됩니다. ITS는 혈소판 수축 및 세포의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. 이 문서는 합성 및 ITS integrin 전송 셀룰러 힘의 연구에의 응용에 대 한 절차를 자세히 설명합니다.
Introduction
셀은 integrins 준수 및 셀룰러 힘 세포 외 기질을 발휘에 의존 합니다. Integrin 중재 하는 세포 접착 및 힘 전송 셀1,2, 마이그레이션3,4및 생존5,,67확산에 대 한 중요 한 있습니다. 긴 기간에 또한 셀 확산8,,910 와 차별화11,12영향 integrin biomechanical 신호. 연구원은 측정 하는 다양 한 방법을 개발 했다 하며 지도 integrin 전송 휴대 세포-매트릭스 인터페이스에서. 이러한 메서드는 탄성 층13, 배열 micropost14또는 원자 힘 현미경 (AFM)15,16. 탄성 층 및 micropost 방법 세포 스트레스를 보고와 공간적 해상도 측면에서 제한이 감도 강제 하는 기판의 변형에 의존 합니다. AFM은 높은 힘 감도, 하지만 그것은 동시에 여러 장소에서 힘을 감지할 수 없습니다, 그리고 integrins 전송한 셀룰러 힘을 지도 하 고 어려운.
최근 몇 년 동안, 여러 기술 분자 수준에서 세포 힘 연구 개발 되었다. 폴 리 에틸렌 글리콜17,18, 거미 실크 펩 티 드19및 DNA20,21,,2223 에 따라 분자 긴장 센서의 컬렉션을 개발 되었다 시각화 하 고 분자 단백질에 의해 전송 하는 긴장을 모니터링 합니다. 이러한 기법 중 DNA 합성 물자는 긴장에 밧줄 (TGT), 변조 라이브 셀22,24integrin 긴장의 상한 rupturable 링커 측정으로 처음 채택 되었다. 나중에, DNA와 형광 공명 전송 기술을 결합 했다 만드는 머리 핀 형광 긴장 DNA 기반 센서 먼저 첸의 그룹23 , Salaita의 그룹20여. 헤어핀 긴장 DNA 기반 센서 integrin 긴장 실시간으로 보고 하 고 세포 기능21의 일련의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. 그 후, 왕 실험실 보고서 integrin 긴장 fluorophore 끄는 쌍 한 TGT 결합. 이 센서 는25,26이름은입니다. ITS 이중 가닥 DNA (dsDNA)에 기반 하 고 integrin 긴장 교정에 대 한 광범위 한 동적 범위 (10-60 pN) 있다. 헤어핀 DNA 기반 센서, 달리 ITS 실시간 세포 힘을 보고 하지 않습니다 하지만 셀룰러 힘;의 발자국으로 모든 역사적인 integrin 이벤트 기록 이 신호 축적 과정 영상, 그것을 만드는 가능한 이미지 셀룰러 힘도 저가형 형광 현미경으로 세포 힘에 대 한 감도 향상 시킵니다. ITS의 합성은 두 개의 단일 가닥 DNAs (ssDNA)을 교배 시키기 의해 만들어집니다 더 상대적으로 편리 합니다.
ITS는 18 베이스 결합 dsDNA integrin 펩타이드 리간드 (그림 1)으로 biotin, fluorophore는, 끄는 (블랙 홀을 끄는 2 [BHQ2])27와는 순환 arginylglycylaspartic 산 (RGD) 펩 티 드28 활용 이다. 낮은 물가 fluorophore와 활용 (Cy3 Cy5 또는 알 렉 사 시리즈 다른 염료 동안이 원고에 사용 됩니다, 또한 입증 된 우리의 실험실에서 가능한)는 ITS biotin avidin 본드로 기판에 움직일는 biotin 태그. 위쪽 가닥 RGD 펩타이드와 약 98% 냉각 효율26,27와 Cy3 냉각 블랙홀 끄는 활용 이다. 이 문서에 소개 된 프로토콜, 기판에 ITS의 코팅 밀도 1100 / µ m2주위에 이다. 이것은 우리가 이전 18 혈압 biotinylated dsDNA 같은 프로토콜29코팅에 따라 neutrAvidin 기능성된 기판에 코팅에 대 한 보정 밀도 이다. 셀 ITS 코팅 기판에 준수 때 integrin RGD 통해 ITS 한다 장력 ITS 전송. ITS는 기계적으로 분리 2 s22내 ITS의 dsDNA 긴장 임계값으로 정의 된 특정 긴장 공차 (T톨). Integrin 긴장으로 그것의 파열 리드는 끄는의 분리 이후 형광을 방출 하는 염료에서. 결과적으로, 보이지 않는 integrin 긴장 형광 신호에 변환 되 고 셀룰러 힘 형광 이미징으로 매핑할 수 있습니다.
ITS의 응용 프로그램 입증, 우리 물고기 keratocyte 여기, 셀 마이그레이션 연구30,,3132널리 셀 모델, 조-K1 셀, 일반적으로 사용 되는 nonmotile 셀 라인, 및 NIH 3T3 섬유를 사용 합니다. Integrin 긴장과 셀 구조의 coimaging는 또한 실시 하 고 있다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC, 8-16-8333-나) 아이오와 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 통합 긴장 센서의 합성
- 사용자 지정 하 고 ssDNAs ( 테이블의 자료를 참조)을 주문.
참고: ssDNA 시퀀스는 다음과 같습니다. 위 물가 /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. 낮은 물가 다음과 같습니다.
12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio//5Cy3 /
23 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT//5Cy3/CCC
33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
여기에서, /5ThioMC6-D / 5' 끝에 thiol 한정자 C6 S S (이황화)를 나타냅니다. /3BHQ_2/ 블랙 홀을 끄는 2 3' 끝을 나타냅니다. / 3Bio /, 5Biosg /, 및 /iBiodT/는 각각 biotinylation 끝에 3', 5' 끝, 그리고 내부 DNA의 thymine. /iCy3/ 삽입 ssDNA의 내부 백본 Cy3을 나타냅니다. 이러한 코드는 여기에 사용 된 특정 상업적인 공급자에 의해 사용 되 고 다른 DNA 회사에서 다를 수 있습니다. - SH ssDNA 끄는에 RGD 펩타이드 켤레
참고: 사용 하는 시 약은 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), sulfosuccinimidyl-(N maleimidomethyl) cyclohexane-1-카복실산 (sulfo SMCC), RGD 펩타이드, 및 트리 스-4 (2-carboxyethyl) phosphine 염 산 염로 알려진 또한 TCEP HCl.- TCEP 솔루션을 사용 하 여 위쪽 가닥 DNA에 thiol 한정자 deprotect
참고: 상용 소스 로부터 주문 Thiol 수정 DNAs RGD DNA 활용 전에 줄일 필요 이황화 결합에 의해 보호 유황 원자와 산화 형태로 제공 됩니다. TCEP은 thiol deprotection 사용 하는 무 취 감소 시 약 이다.- 물 300 µ L에서 14.3 mg TCEP HCl의 분해. PH 테스트 종이 사용 하 여 ~7.2–7.4 1m NaOH 솔루션 (약 150 µ L), TCEP 솔루션의 pH를 조정 합니다. 순수한 물 0.5 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다. 최종 TCEP 농도 100 m m 이다입니다.
참고:이 좋습니다 있도록 TCEP 솔루션 신선한 DNA thiol deprotection에 대 한 모든 시간. 오랜 동안 TCEP 솔루션을 구입 하지 마십시오. - TCEP 솔루션에 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션의 100 µ L 및 물 400 µ L를 추가 합니다.
- PBS에서 1 m m thiol-DNA-BHQ2의 20 µ L를 TCEP + EDTA 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 동안 반응 솔루션을 보자.
참고: 5' thiol 한정자 C6 S S 활용이이 ssDNA에서의 이황화 결합은 TCEP, 다음 단계에서 thiol 그룹 maleimide와 반응에 대 한 준비를 떠나 여 죽 습 될 것입니다. TCEP는 다음 thiol maleimide 반응; 방해 하지 않는 따라서,이 단계 후 TCEP passivate 필요는 없습니다.
- 물 300 µ L에서 14.3 mg TCEP HCl의 분해. PH 테스트 종이 사용 하 여 ~7.2–7.4 1m NaOH 솔루션 (약 150 µ L), TCEP 솔루션의 pH를 조정 합니다. 순수한 물 0.5 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다. 최종 TCEP 농도 100 m m 이다입니다.
- 어원이 RGD-NH2 sulfo SMCC.
- RGD-NH2 11 m m RGD-NH2를 PBS의 100 µ L에 5 mg을 디졸브.
- 2mg sulfo SMCC (업체가 premeasured)와 튜브를 순수한 물 200 µ L를 추가 합니다. 피 펫 팁 sulfo SMCC 고체를 분쇄 하 고 적극적으로 물에서 SMCC 해산 촉진을 동시에 플라스틱. Sulfo SMCC 농도 23 m m 일 것 이다.
참고: 지금까지 sulfo SMCC에 NHS 에스테 르가 수 분해는 몇 분의 일생은 때문에는이 용 해 단계 NHS 에스테 르 가수분해 때문의 과도 한 손실을 방지 하기 위해 1 분 이내 완료 되어야 한다. 순수한 물을 사용 하 여 PBS 또는 다른 버퍼에 있는 그것의 가용성은 가난 때문에 sulfo SMCC 해산. - 100 µ L RGD-NH2 솔루션 sulfo SMCC 솔루션의 40 µ L을 추가 하 고 20 분 동안 품 어.
참고: sulfo SMCC에 NHS 에스테 르는 반응 RGD-NH2, 아민 그룹 아 미드 유대 형성 RGD와 sulfo SMCC 연결 되.
- SH-ssDNA-끄는와 RGD SMCC 켤레.
- 1.2.1 및 1.2.2 단계에서 준비 하는 솔루션을 혼합 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 혼합물을 품 어. 4 ° C에서 냉장고 설정으로 솔루션을 이동 하 고 하룻밤 더 반응 하자. 위쪽 가닥 DNA에 활용 된 thiol sulfo SMCC, RGD 위쪽 가닥 DNA와 연결 하는 thioether 그룹을 형성에 maleimide와 반응 합니다.
- 에탄올 강수량 unreacted sulfo SMCC, RGD, 및 TCEP RGD ssDNA 끄는 정화를 수행 합니다.
- 적어도 30 분 동안-20 ° C 냉동 실에 15 mL 원뿔 튜브에 100% 에탄올 10 mL을 진정.
- 3 M NaCl 솔루션, DNA 솔루션 및 볼륨 비율 1시 10분: 25의 냉된 에탄올 혼합. 혼합된 액체는-20 ° C 냉동 고 30 분 또는 때까지 DNA를 침전 하십시오.
- 30 분에 대 한 10000 x g 에 액체 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.
- DNA 펠 릿에 PBS를 추가 합니다. DNA 농도 분석기를 사용 하 여 측정 합니다.
- (선택 사항) DNA 전기 이동 법 높은 RGD ssDNA 순도 얻기 위해 수행 합니다.
참고: 위의 프로토콜, 약 70%-90%는 ssDNA의 RGD로 활용 될 것입니다. 높은 순도 바란다면 DNA 전기 이동 법은 결합형된 DNA에서 활용 된 DNA를 분리 하도 수행할 수 있습니다.- 수직 전기 시스템을 조립.
- 순수한 물, 40% 아크릴 아 미드 젤, 트리 스-borate-EDTA (TBE) 버퍼 x 10의 8 mL 및 10% 염화 persulfate (AP)의 800 µ L의 20 mL 50 mL를 혼합 하 여 10 %polyacrylamide 젤 솔루션을 준비 합니다.
- 젤 솔루션 tetramethylethylenediamine (TEMED)의 80 µ L를 추가 합니다. 전기 시스템의 유리 챔버에 솔루션을 붓는 다. 젤 위에 잘 만들려고 단일 잘 빗을 삽입 합니다. 젤은 가교 화까지 10 분 기다립니다.
- DNA 솔루션 볼륨의 비율은 1: 1에서 100% 글리세롤과 혼합. 빗을 제거 하 고 잘 젤을 DNA 솔루션을 로드 합니다.
- 200 V. 관찰 두 DNA 밴드는 한 지체는 활용 된 DNA의 전압에서 젤을 실행 합니다.
- 활용 된 DNA와 젤 밴드를 잘라 하 고 작은 조각으로 그것을 주사위.
- 필터와 2 개의 1.5 mL 원심 분리기 관에 있는 절단된 젤을 수집 합니다. 각 튜브를 PBS의 500 µ L를 추가 합니다.
- 1 일 PBS 배어 젤 실내 온도에 어두운 장소에 넣어. DNA는 PBS에 젤 조각에서 무마 합니다.
- DNA 솔루션 centrifuging 1000 x g 2 분에 관 하 여 수집 합니다.
- DNA 수집을 에탄올 강수량 (1.2.4 단계)의 또 다른 라운드를 수행 합니다.
- TCEP 솔루션을 사용 하 여 위쪽 가닥 DNA에 thiol 한정자 deprotect
- RGD ssDNA 끄 및 염료 ssDNA biotin을 교배 시키기 의해 ITS를 음성 합성.
- 위 물가 및 1.1:1의 어 금 니 비율에서 낮은 물가 DNAs의 솔루션을 믹스. ITS DNA 교 잡에 의해 생산 하룻밤 4 ° C에서 혼합물을 유지.
참고: DNA 교 잡에 대 한 1.1:1의 어 금 니 비율 1:1 대신 사용 됩니다. 과도 한 RGD ssDNA 끄는 모든 염료 ssDNA biotin RGD ssDNA 끄는와 교배 하는 것을 확인 하는 데 사용 됩니다. RGD-ssDNA-끄는 교 잡 없이 표면 코팅, 그것의 표면 코팅 품질에는 영향을 주지 것입니다 동안 씻어 될 것입니다. - 약 수 고가 긴 기간 저장을 위해-20 ° C에서 ITS 솔루션.
참고: 저장소 버퍼 PBS 이며 저장 농도 일반적으로 10 μ M 이상 이어야 합니다. 일반 사용에 대 한 자사의 솔루션 현저한 품질 저하 없이 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 수 있습니다.
- 위 물가 및 1.1:1의 어 금 니 비율에서 낮은 물가 DNAs의 솔루션을 믹스. ITS DNA 교 잡에 의해 생산 하룻밤 4 ° C에서 혼합물을 유지.
2. 유리 바닥 접시에 ITS immobilizing 그것의 표면 준비
참고: 사용 하는 시 약은 biotinylated 소 혈 청 알 부 민 (BSA-비오 틴), avidin 단백질, 및 그것의. 모든 시 약 및 약 0 ℃ 얼음 물통 얼음에 PBS 버퍼를 진정.
- 0.1 mg/mL의 BSA biotin PBS에 유리 바닥 페 트리 접시 (직경 14 m 잘 29 m m)의 우물에 200 µ L을 로드 합니다. 냉장고에서 4 ° C에서 30 분 동안 그것을 품 어. BSA-비오 틴은 물리적으로 유리 표면에 흡착 됩니다.
- 잘 씻어 표면에 다시 PBS의 200 µ L를 추가 및 잘 사용 하는 피 펫에서 솔루션에 밖으로 빨 아. 이 3 배 세척을 완료 반복 합니다.
- 4 ° c.에 30 분 동안 잘에서 50 µ g/mL avidin 단백질의 200 µ L을 품 어 그것을 씻어 PBS 가진 3 배. 이 단계 후 avidin 단백질 BSA biotin에 한다 유리 표면에 움직일 수 된다.
- 0.1 µ M에 4 ° c.에 30 분 동안 잘 ITS의 200 µ L을 품 어 PBS 가진 3 배와 접시 세척. 셀 도금까지 우물에 PBS를 둡니다. 이 단계 후 biotin 태그는 avidin 단백질에 한다 표면에 움직일 수 된다.
참고: 코팅 품질과 그것의 동원 정지 기간 동안 동질성에 대 한 중요 한 경고 페 트리 접시 표면 건조를 주지 않을 것입니다. 4 ° C 또는 세척 단계 동안 물 증발 속도 줄이기 위해 얼음 양동이 도움이 됩니다 얼음에 약 0 ° C에서 모든 시 약 및 PBS를 유지 때 PBS 그려집니다 밖으로 우물에서.
3. 세포의 표면에 도금
- 문화 물고기 keratocytes입니다.
참고: 여기, 금붕어 (떡 auratus) 예를 들어, 사용 됩니다 하지만 다른 어 종 또한 작동 수 있습니다.- 플랫 팁 트위터와 물고기에서 물고기 규모의 작품을 뽑 다. 부드럽게 유리 문의 규모의 안쪽으로 유리 바닥 페 트리 접시의 우물에는 규모를 누릅니다. ~ 30까지 기다리는 잘 접시의 유리 표면에 물고기 규모에 대 한 s.
- Iscove의의 1 mL 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM) 완전 한 매체 물고기 규모를 완벽 하 게 커버를 추가 합니다. 실내 온도에 6-48 h에 대 한 어둡고 습 한 상자에 페 트리 접시를 유지.
참고: IMDM 완전 한 매체 79 %IMDM + 20% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) + 1% 페니실린을 포함 되어 있습니다. 산소 또는 CO2 의 추가 공급이 필요 합니다. 몇 휴지 롤 물으로 젖 었 상자에 높은 습도 유지 하기 위해 상자에 남아 있을 수 있습니다. 물고기 keratocytes 몇 시간 후 셀의 시트 물고기 규모에서 마이그레이션됩니다. 이 조직 배양 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 세포는 일반적으로 48 h에 가능한.
- 분리 하 고 그것의 표면에 keratocytes 셀 접시.
- 물고기 규모 배양은 배양 접시에서 매체를 제거 합니다. 잘 1 x 셀 솔루션, 분리 세척 하 고 물고기 규모를 커버 하 고 3 분 동안 품 어 파견 솔루션 추가.
참고: EDTA 솔루션을 분리 하는 셀에 대 한 제조 법은 다음과 같습니다: 10 x 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) + 1 M HEPES (pH 7.6)의 10 mL 100 mL + 7.5% 나트륨 중 탄산염의 + 500 mM EDTA + 1 L H2o.의 2.4 mL 10 mL PH는 7.4에 조정 됩니다. - IMDM 완전 한 매체 추가 및 솔루션을 분리 하는 모든 셀에 밖으로 빨 아. 부드러운 pipetting으로 keratocytes를 분산. 원하는 수준 (1 x 104-1 x 105/mL) 셀 솔루션 밀도 조정 합니다. (섹션 2에 따라 준비) 그것의 표면에 세포 격판덮개 세포 이미징 하기 전에 30 분 동안 실 온에서 품 어.
참고: 셀 계산 할 수 있습니다 한 hemocytometer와 솔루션을 분리 된 세포를 분리 한 후. 밀도 도금 하는 세포는 상대적으로 낮은 keratocytes 마이그레이션할 표면적의 많음이 있다.
- 물고기 규모 배양은 배양 접시에서 매체를 제거 합니다. 잘 1 x 셀 솔루션, 분리 세척 하 고 물고기 규모를 커버 하 고 3 분 동안 품 어 파견 솔루션 추가.
- 판 조 K1 세포와 NIH 3T3 세포의 표면에.
참고: 조-K1 셀에 대 한 매체는 89% 햄의 F12 10 %FBS + 1% 페니실린. NIH 3T3 세포에 대 한 매체 89 %Dulbecco 수정된이 글의 중간 (DMEM) + 10% 송아지 소 혈 청 (CBS) + 1% 페니실린 이다. 문화 상태는 37 ° C, 5% CO2.- 문화 조 K1 셀 또는 NIH 3T3 세포 배양 접시 (또는 문화 플라스 크)에 80%-100% 합류.
- 솔루션 및 37 ° c 배양 분리 셀 따뜻한
- 피 펫과 페 트리 접시에 모든 문화 매체를 제거 합니다. 1 세포를 씻어 솔루션을 분리 하는 세포와 x. 솔루션을 분리 된 세포를 커버 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- Pipetting으로 세포를 분산. 셀 솔루션을 수집 하 고 3 분에 대 한 300 x g 에서 원심.
- 완전 한 매체 또는 혈 청 무료 매체 추가 및는 상쾌한 밖으로 빨 아.
- 원하는 수준 (1 x 105 -1 x 106/mL) 셀 솔루션 밀도 조정 합니다. (섹션 2에 따라 준비) 그것의 표면에 세포 격판덮개 비디오 녹화 하기 전에 이미지, 또는 30 분 전에 1-2 h 37 ° C에서 세포를 품 어.
4. 영상, 비디오 녹화 및 실시간 integrin 긴장 매핑
-
라이브 셀에서 integrin 긴장의 quasi-real-time 이미징
- 실 온에서 30 분 (섹션 2에 따라 준비) 그것의 표면에 keratocytes를 품 어 또는 조 K1 셀 또는 37 ° c.에 인큐베이터에 그것의 표면에 1 시간에 대 한 NIH 3T3 세포를 품 어
- 형광 현미경 스테이지에 페 트리 접시를 탑재 합니다. 세포 힘 영상 1의 노출 시간을 수행 s. 배율을 100 x 40 x입니다.
- 20 프레임 간격의 이미지의 비디오 가져가 라 keratocytes, 또는 1-2 분 조 K1 셀 또는 NIH 3T3 세포에 대 한 s.
- MATLAB 이나 다른 이미지 분석 도구를 사용 하 여 새로 최신 프레임 간격에서 생산 하는 ITS 신호를 계산 하는 현재 프레임에서 그 비디오의 이전 프레임을 빼려면. 새로 생산된 ITS 신호 quasi-real-time 방식에서 셀룰러 힘을 보고 그로 인하여 최신 프레임 간격에서 생성 integrin 긴장을 나타냅니다.
-
Integrin 긴장 및 immunostained 세포에서 세포의 구조 coimaging
- 3.2.2 단계 또는 단계 3.3.6 후 대상 구조 단백질을 표시 하는 immunostaining를 수행 합니다.
참고: integrin 긴장 이미징 및 셀 구조 이미징 사이 형광 크로스 토크를 방지 하려면 다른 염료를 사용 합니다. 이 원고에서 Cy5 fluorophore phalloidin를 위해 사용 되었다 고 알 렉 사 488 vinculin 얼룩이 지기를 위해 사용 되었다. 1 차 및 이차 항 체의 농도 2.5 µ g/mL 이다. Phalloidin에 대 한 농도 1.5 단위 / µ L. - Multifluorescent 채널 이미징 integrin 긴장 지도 셀 구조 영상 취득을 수행 합니다.
- 3.2.2 단계 또는 단계 3.3.6 후 대상 구조 단백질을 표시 하는 immunostaining를 수행 합니다.
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Representative Results
ITS와 물고기 keratocytes integrin 긴장 지도 체포 됐다. 그것은 표시는 keratocyte 마이그레이션합니다 integrin 긴장 두 힘 트랙 (그림 2A)에서 생성 됩니다. 힘 지도의 해상도 0.4 µ m (그림 2B) 되도록 보정 했다. 높은 integrin 긴장 뒤쪽 여백 (그림 3A)에 집중 한다. ITS는 또한 다른 세포의 다른 특정 패턴을 보여 줍니다. Nonmotile 셀, NIH-3T3 빠른 마이그레이션 keratocyte의 아주 다른 특정 integrin 긴장 패턴 (그림 3B)을 형성.
Immunostaining와 초점 유착 및 keratocytes 했다 물고기의 integrin 긴장 coimaged (그림 4A). Integrin 긴장 및 keratocytes에 셀 구조 사이의 관계는 왕 외.25자세히 연구 했다. 조-K1 셀에서 Integrin 긴장과 스트레스 섬유는 또한 coimaged (그림 4B). 이러한 실험 ITS 세포 접착 힘 및 셀 구조 셀 구조/힘 상호 작용의 연구를 촉진 함으로써 유사한 영상 설정에서 동시에 coimaging 수 나타냅니다.
그림 1:의 설계도 그. ITS dsDNA RGD ligand, 형광을 끄는는 염료와 biotin 태그 장식 이다. 염료 (녹색 가득한 원)는 끄는 의해 침묵 이다. Integrin 긴장에서 여 dsDNA 파열 하 고 Cy3 냉각에서 해제 되 고 형광 현미경 검사 법에 의해 검출 될 수 있는 형광을 방출 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 물고기 keratocyte와 ITS의 서브 마이크론 해상도의 Integrin 긴장 지도. (A) 빠른 마이그레이션 중 keratocyte는 일관 되 게 생성 integrin 긴장 지도 두 힘 트랙에. (B) 둘 사이의 거리 힘 트랙은 일반적으로 40 µ m. 세포 힘 지도 ITS에 의해 몇 군데의 공간 해상도 0.4 µ m 주변 이다. 하단 왼쪽된 패널에 짧은 빨간 선으로 표시 된 영역의 Cy3 형광 강도의 선형 프로필 셀룰러 힘 영상에서 해상도의 교정에 대 한 계산 됩니다. 결과 하단 오른쪽 패널에 표시 하 고 가우스 곡선으로. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 물고기 keratocyte 및 NIH-3T3 실시간 integrin 긴장 지도. (A) A 물고기 keratocyte 그리고 그것의 integrin 긴장 지도. (왼쪽 위) 메구미 물고기 keratocyte입니다. (왼쪽 아래) Integrin ITS에 의해 보고 된 keratocyte의 지도 긴장. (오른쪽 위) 실시간 integrin 긴장 프레임 빼기에 의해 얻은. 그것은 새로 생성 된 integrin 긴장 셀 후면 가장자리와 colocalized는 보여준다. (오른쪽 아래) Integrin 긴장 지도 (녹색) 및 실시간 integrin 긴장 (마젠타) 하나의 병합 된 그림에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. (B)는 NIH-3T3 섬유와 그 integrin 긴장 지도. (왼쪽 위) NIH-3T3 섬유입니다. (왼쪽 아래) Integrin NIH-3T3 섬유의 지도 긴장. Integrin 긴장 스트라이프 패턴에 생성 되었습니다. (오른쪽 위) 실시간 integrin 긴장 새로 생성 된 integrin 긴장 셀 주변 지역에 주로 형성을 보여준다. (오른쪽 아래) Integrin 긴장 지도 (녹색) 및 실시간 integrin 긴장 (마젠타) 하나의 병합 된 그림에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: integrin 긴장과 셀 구조의 Coimaging. (A) Coimaging integrin 긴장, vinculin, 및 F-말라는 keratocyte에서. keratocyte 고정 및 vinculin 및 F 걸 보고 immunostained. Integrin 긴장, vinculin, 및 F-말라 조 K1 셀에서 (B) Coimaging. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
ITS는 휴대에 대 한 강력한 기술 강제로 합성 및 응용 프로그램 매핑 아직 매우 액세스할 수 있습니다. 모든 재료 준비, 1 일 이내 ITS는 합성 수 있습니다. 실험, 동안 표면 코팅의 3 단계 셀 도금 전에 필요 합니다. 최근, 우리는 더 ITS 소 혈 청 알 부 민, 유리 또는 폴리스 티 렌 표면33ITS의 직접적인 물리적 흡착 수에 직접 연결 하 여 한 단계로 코팅 절차를 단순화. ITS는 셀룰러 구조 이미징의 유사한 수준에 세포 힘 신호의 형광 강도 제공합니다. 편리한 합성 및 샘플 준비, 현미경 검사 법, 대 한 겸손 한 요구 사항 및 셀룰러 힘에 대 한 높은 감도 ITS 셀 역학의 연구에 대 한 강력 하 고 신뢰할 수 있는 기술을 확인합니다. 이 문서에서 우리는 그것의 합성 및 응용에 대 한 포괄적인 절차를 제시.
RGD 어근 ligand ssDNA와 그것의 합성에서 가장 중요 한 절차 이다. 프로토콜 섹션에서 설명 했 듯이, sulfo SMCC에 NHS 에스테 르 물에 안정 아니에요. 더 이상 sulfo SMCC 물에 분해 하는 데 걸리는, 더 많은 양의 sulfo SMCC NHS 에스테 르가 수 분해에 패 "불발 탄", maleimide thiol 반응을 통해 dna 변화 하지만 RGD-NH2켤레에 실패 되. 그 결과, DNA 분자의 큰 부분은 죽은 sulfo SMCC에 의해 점유 될 것 이다 고 RGD, RGD ssDNA의 낮은 수익률을 선도와 연결할 수 없습니다. 이러한 이유로 sulfo SMCC 물에 용 해 완료 되어야 한다, 일반적으로 1 분 이내. 그것은 또한 전기 이동 법을 가진 ssDNA RGD의 수익률을 확인 하는 것이 좋습니다. 80% 이상의 수익률 이면 정화 일반적으로 필요 하지 않습니다. 그렇지 않으면, DNA 정화 polyacrylamide 젤에 의해 것이 좋습니다. Polyacrylamide 젤에 의해 DNA의 복구 율은 약 60%-80%.
RGD ssDNA BHQ2의 합리적인 금액을 합성, thiol ssDNA BHQ2 의 시작 금액 20 nmol (1 m m x 20 µ L) 이어야 한다. 참고 DNA 수정 DNA 회사에서 주문 하는 ssDNA의 수량을 크게 줄일 수 있습니다. 예를 들어 두 개의 수정 ssDNA의 1000 nmol 주문 보장된 수익률만 20 nmol 있을 수 있습니다. 이 경우 적어도 1000 nmol RGD ssDNA 활용에 대 한 ssDNA의 주문. 연구원은 또한 그것의 구조에 대 한 그들의 자신의 시퀀스를 디자인할 수 있습니다. 일반적으로, 우리는 dsDNA 열 안정성 향상을 위해 70% 보다 높은 ITS에서 GC 콘텐츠를 유지. 자기 머리 핀, 자기 교 잡, 안정적인 2 차 구조 형성의 가능성을 최소화 하기 위해 DNA 순서 분석을 수행할 수 있습니다. 분석 도구를 사용할 수 온라인입니다. 원고, 위쪽 가닥 DNA와 다른 T톨ITSs 마찬가지입니다. 우리는 낮은 물가 다른 T톨을 달성 하기 위해 DNA에 biotin 위치를 다. 그러나, 위쪽 가닥에 RGD의 위치를 다양 한 적용할 수 있습니다 또한 ITS의 T톨 조정. 다른 dsDNA 형상에 대 한 T톨 의 계산 왕 및 Ha22 와 Mosayebi 외34, 특히 지퍼 모드35,36 에 전단 모드 dsDNA에 대 한에 의해 제공 됩니다. 37,38.
비록 그것의 표면 세포 힘 지도의 비디오를 연속적으로 기록 하 여 과거에는, 자리를 차지 하는 모든 integrin 긴장 기록, 연구원 이전 프레임을 빼서 최신 프레임 간격에서 생산 integrin 긴장을 계산할 수 있습니다. 'quasi-real-time 셀룰러 힘 지도'를 생성 하기 위해 현재 프레임. ITS 비디오에서 프레임 간격 셀 형식에 따라 다릅니다 하지만 일반적으로 20 빠른 마이그레이션 셀과 고정 된 셀에 대 한 1-2 분에 대 한 s. 프레임 빼기 방법 보고 integrin 긴장 영상 신호 축적 효과 대 한 높은 감도 유지 하면서 quasi-real-time integrin 긴장 합니다. Photobleaching 최소 두 개의 연속 이미지 사이 이며, 따라서, 영향이 없다 관찰 프레임 빼기 방법.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 아이오와 주립 대학 그리고에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 (R35GM128747) 제공 시작 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
References
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