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Developmental Biology

संस्कृति में स्तनधारी कोशिकाओं में डाइसल्फाइड लिंकेज द्वारा स्थिर मल्टीमेरिक परिसरों का पता लगाने के लिए गैर-कम करने वाले एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण और रासायनिक Crosslinking का संयोजन

Published: May 2, 2019 doi: 10.3791/59483
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biology, Rowan University, School of Osteopathic Medicine and Graduate School of Biomedical Sciences

Summary

कई प्रोटीन की संरचना को स्थिर करने के लिए डाइसल्फाइड लिंकेज लंबे समय से ज्ञात हैं । एक साधारण विधि का विश्लेषण करने के लिए multimeric इन संबंधों द्वारा स्थिर परिसरों गैर के माध्यम से है-कम एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण । यहां, इस विधि मानव हड्डी अस्थिसार्कोमा सेल लाइन U-2 OS से dUTPase के परमाणु isoform का विश्लेषण करके सचित्र है ।

Abstract

सहसंयोजी डाइसल्फाइड लिंकेजों के माध्यम से अनेक प्रोटीनों की संरचनाओं को स्थिर कर रहे हैं । हाल के काम में, इस बांड भी एक पोस्ट के रूप में वर्गीकृत किया गया है translational संशोधन । इस प्रकार, जीवित कोशिकाओं में इस संशोधन का अध्ययन करने के लिए सक्षम होना करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक सरल विधि इन cysteine स्थिर multimeric परिसरों का विश्लेषण करने के लिए एक दो गैर के कदम विधि-SDS-पृष्ठ विश्लेषण और formaldehyde पार से जोड़ने के माध्यम से है । यह द्वि-चरणीय विधि बहुमेरिक परिसरों को अपने तकनीकी सुगमता और कम प्रचालन लागत के कारण डाइसल्फाइड लिंकेज द्वारा स्थिर करने के लिए प्रथम चरण के रूप में लाभप्रद है । यहाँ, मानव अस्थि ऑस्टियो सार्कोमा सेल लाइन U-2 OS विशेष रूप से dUTPase के परमाणु isoform का विश्लेषण करके इस विधि का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Introduction

कई प्रोटीन की संरचना को स्थिर करने के लिए डाइसल्फाइड लिंकेज लंबे समय से ज्ञात हैं । हाल के काम में, इस बांड भी एक प्रतिवर्ती पोस्ट के रूप में वर्गीकृत किया गया है ट्रांसलेशनल संशोधन, एक cysteine आधारित "redox स्विच के रूप में अभिनय" प्रोटीन समारोह, स्थान और संपर्क1,2के मॉडुलन के लिए अनुमति देता है, 3,4. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि इस संशोधन का अध्ययन करने में सक्षम होना चाहिए । एक सरल विधि इन cysteine स्थिर multimeric परिसरों का विश्लेषण करने के लिए गैर के माध्यम से है-कम करने SDS-पृष्ठ5विश्लेषण । Sds-पृष्ठ विश्लेषण एक तकनीक है कई प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया, जहां परिणाम प्राप्त किया जा सकता है और जल्दी से व्याख्या की, आसानी से, और कम लागत के साथ, और अंय ऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री 6 के रूप में डाइसल्फ़ाइड संपर्कों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया तकनीकों पर लाभप्रद है ,7 और परिपत्र dichroism8।

यह निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण कदम अगर इस विधि एक उपयुक्त तकनीक के लिए एक अध्ययन में सहायता के लिए अच्छी तरह से ब्याज की प्रोटीन के प्राथमिक अनुक्रम की जांच करने के लिए बीमा वहां सिस्टीन अवशेष (एस मौजूद हैं) है । एक और उपयोगी कदम के लिए किसी भी पिछले क्रिस्टल प्रकाशित संरचनाओं अनुसंधान या एक bioसूचनाविज्ञान आवेदन का उपयोग करने के लिए ब्याज की प्रोटीन की तीन आयामी संरचना का पता लगाने के लिए कल्पना जहां सिस्टीन अवशेष (s) स्थित हो सकता है । यदि अवशेषों को बाहर की सतह पर उपस्थित किया जाता है तो यह एक बेहतर उंमीदवार हो सकता है, जो संरचना के अंदर एक सिस्टीन अवशेष दफन के बजाय एक डाइसल्फाइड लिंकेज बनाने के लिए है । हालांकि, यह ध्यान रखें कि प्रोटीन सब्सट्रेट बातचीत या प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत इन अवशेषों तो पर्यावरण के लिए भी उजागर हो जाने की अनुमति पर संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरना हो सकता है महत्वपूर्ण है ।

पहचान multimeric परिसरों तो रासायनिक पार formaldehyde का उपयोग कर जोड़ने के साथ सत्यापित किया जा सकता है । Formaldehyde इस सत्यापन के लिए एक आदर्श पार linker है उच्च कोशिका पारगम्यता और कम ~ 2-3 Å के पार जोड़ने अवधि के कारण, विशिष्ट प्रोटीन की पहचान सुनिश्चित करने के लिए-प्रोटीन बातचीत9,10. यहां, इस विधि मानव हड्डी अस्थिसार्कोमा सेल लाइन U-2 ओएस11से dUTPase के परमाणु isoform विश्लेषण से सचित्र है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल अंय कोशिका लाइनों, ऊतकों और जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

1. मुक्त Cysteine अवशेषों को अवरुद्ध आयोडोऐसीटामाइड का उपयोग

  1. U-2 ओएस कोशिकाओं में एक 6 सेमी2 डिश 50%-60% उच्च ग्लूकोज 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% सोडियम पाइरूवेट के साथ ंयूनतम आवश्यक माध्यम में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह2में प्रवाह ।
  2. बस का उपयोग करने से पहले 10 मिमी iodoacetamide का एक ताजा स्टॉक बनाओ, तो किसी भी अप्रयुक्त अभिकर्मक त्यागने.
  3. सेल संस्कृति मीडिया के लिए सीधे ०.१ मिमी अंतिम एकाग्रता iodoacetamide जोड़ें. धीरे से 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पकवान रॉक ।

2. कोशिकाओं की कटाई

  1. कोशिकाओं से मीडिया को महाप्राण ।
  2. 5 मिलीलीटर कोल्ड फॉस्फेट-बफ़र्ड नमकीन (पीबीएस) से कोशिकाओं को तीन बार धोएं । महाप्राण अंतिम पीबीएस धो समाधान तो 1 मिलीलीटर की ठंड PBS जोड़ें ।
  3. एक सेल स्क्रैपर का उपयोग कर पकवान के नीचे से कोशिकाओं परिमार्जन । 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके पीबीएस और सेल निलंबन को ड्रा और एक १.५ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में सभी तरल बांटना ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के लिए ७,५०० x g पर कोशिकाओं स्पिन । पीबीएस महाप्राण, सेल गोली के पीछे जा रहा है । सेल गोली पर संग्रहीत किया जा सकता है-८० ° c प्रसंस्करण तक

3. प्रोटीन का निष्कर्षण

  1. एक 1x lysis बफर के १०० μL तैयार ddH2ओ में पतला ( सामग्री की मेजदेखें) । एक 1 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए उपयोग करने से पहले तुरंत phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) जोड़ें.
  2. सीधे सेल गोली और निलंबित करने के लिए 1x lysis बफर के ५० μL जोड़ें । 5 मिनट के लिए बर्फ पर इस सेते ।
  3. 8 ४०% पर निरंतर पल्स मोड का उपयोग कर एस के लिए sonicate (sonicator के लिए सामग्री की तालिका देखें; समायोजित के रूप में अलग sonicators के लिए आवश्यक), बर्फ पर निकालने रखते हुए.
  4. १६,००० x gपर 5 मिनट के लिए 4 ° c पर निकालें स्पिन Supernatant घुलनशील प्रोटीन अंश है । यदि वांछित प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए ब्रैडफोर्ड विश्लेषण किया जा सकता है ।

4. नमूना तैयारी

  1. घुलनशील प्रोटीन निकालने के 10 μl ले और एक 1x laemmli एसडीएस-नमूना बफर के 10 μl जोड़ें (4% एसडीएस, 20% ग्लिसरॉल, ०.००४% ब्रोमोफीनॉल नीला, और ०.१२५ मीटर Tris-HCl, पीएच ६.८) । किसी भी कम अभिकर्मक नहीं जोड़ें ।
  2. बर्फ पर नमूने रखें यदि एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण उस दिन किया जाएगा; दीर्घकालिक भंडारण के लिए,-20 डिग्री सेल्सियस उपयुक्त है । सही जेल चलाने से पहले, ८५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूना गर्मी ।

5वीवो फॉर्मलेडिहाइड में यू-2 ओएस कोशिकाओं में अंतर्जात प्रोटीन को क्रॉस-लिंकिंग

  1. विकास U-2 एक १७५ सेमी में ओएस कोशिकाओं2 फ्लास्क 70% करने के लिए-80% संगम (1 अनुभाग देखें) ।
  2. फॉर्मलेडिहाइड क्रॉलिंकिंग अभिक्रिया निष्पादित करें
    1. एक धूआं हुड में, aliquot एक ३७% formaldehyde समाधान वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा है । 1% की अंतिम एकाग्रता के लिए मध्यम करने के लिए formaldehyde फिक्टिव सीधे जोड़ें और 15 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर इंक्यूबेट ।
    2. प्रतिक्रिया बुझाने के लिए, ०.१२५ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए १.२५ मी glycine जोड़ें और 5 मिनट के लिए एक घुमाव पर कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर सेबेट ।
  3. कोशिकाओं को 5 मिलीलीटर कोल्ड पीब्स के साथ तीन बार धोएं । अंतिम पीबीएस धोने समाधान महाप्राण और PBS के 10 मिलीलीटर जोड़ें । एक सेल स्क्रैपर का उपयोग कर फ्लास्क के नीचे से कोशिकाओं परिमार्जन ।
  4. एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करना, PBS और सेल निलंबन आकर्षित और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में तरल के सभी बांटना । 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं स्पिन । पीबीएस महाप्राण, सेल गोली के पीछे जा रहा है ।

6. नाभिक के प्रभाजन

  1. तैयार 10 homogenization बफर के एमएल: ०.२५ एम sucrose, 1 मिमी EDTA, 10 मिमी HEPES, और ०.५% BSA पीएच ७.४ पर । एक 1 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए उपयोग करने से पहले तुरंत PMSF जोड़ें और नाभिक निलंबन बफर के 3mL (०.१% ट्राइटन एक्स-१०० में PBS).
  2. सेल गोली करने के लिए सीधे 5 मिलीलीटर homogenization बफर जोड़ें और पूरी तरह से निलंबित । अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ५०० x g पर निलंबन तो supernatant त्यागने ।
  3. Homogenization बफर के 5 मिलीलीटर में गोली निलंबित । 10 स्ट्रोक/500 आरपीएम पर एक टाइट-फिटिंग ग्लास-टेफ्लॉन होमोसाइज़र, डीऔंस होमोलाइज़ सेल्स का इस्तेमाल करें ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १,५०० एक्स जी पर निलंबन अपकेंद्रित्र, तो supernatant त्यागने ।
    नोट: माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के लिए supernatant का उपयोग १०,००० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रण द्वारा ।
  5. 1 मिलीलीटर नाभिक निलंबन बफर और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेबेट में गोली निलंबित ।
  6. 10 मिनट के लिए ६०० x g पर अपकेंद्रित्र । supernatant त्यागें ।
  7. 1 मिलीलीटर नाभिक निलंबन बफर और अपकेंद्रित्र में गोली फिर से निलंबित । सुपरनेटंट त्यांचं काय? अंतिम गोली अलग नाभिक होगा ।

7. प्रोटीन का निष्कर्षण

  1. दोहराएं धारा 4, 1x lysis बफर के 25 μL जोड़ने सीधे सेल गोली तो सस्पैंड को छोड़कर ।

8. नमूना तैयारी

  1. घुलनशील प्रोटीन निकालने के 10 μL प्रत्येक लेने के द्वारा SDS-पृष्ठ के लिए दो नमूने तैयार करने और 2x Laemmli एसडीएस-नमूना बफर और 2 के 1 μL-Mercaptoethanol (BME) जोड़ें ।
  2. ३७ ° c पर 5 मिनट के लिए एक नमूना और ९८ ° c पर 15 मिनट के लिए दूसरा नमूना formaldehyde पार लिंक रिवर्स करने के लिए हीट ।

9. एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण

  1. 1x Tris के 1 एल तैयार-ग्लाइसिन रनिंग बफर (25 मिमी Tris, १९२ मिमी ग्लाइसिन, ०.१% (w/
  2. SDS-पृष्ठ चल रहे उपकरण सेट करें ।
    नोट:     यह प्रोटोकॉल एक 16% प्रीकास्ट tgx sds-पृष्ठ का उपयोग करता है । नोट की, किसी भी प्रतिशत जेल इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, इस पैकेज को खोलने के जेल में संग्रहित है और कैसेट को हटा दें ।
    2. कंडे को हटाकर कैसेट के नीचे से कुएं और टेप को अस्तर रहे हैं ।
    3. चल रहे उपकरण में जेल रखें ।
    4. 1x रनिंग बफर के साथ चैंबर भरें जब तक कुओं तरल में डूबे हुए हैं । एक प्लास्टिक pipet का प्रयोग, बाहर चल बफर के साथ कुओं कुल्ला ।
  3. 10 μL prestained मानक मार्कर के साथ जेल पर नमूनों लोड ।
  4. २०० वी पर जेल भागो जब तक डाई सामने जेल के नीचे से लगभग 1 सेमी है ।

10. वेस्टर्न ब्लाट

  1. 1x हस्तांतरण बफर के 1 एल तैयार (25 मिमी Tris, १९२ मिमी ग्लाइसिन, 20% मेथनॉल) और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर का उपयोग करें जब तक.
  2. सावधानी से जेल निकालें और कैसेट खोलें । एक उस्तरा का उपयोग कर, ध्यान से कटौती और stacking जेल त्यागने । एक कोने का उपयोग कर जेल उठाओ और यह हस्तांतरण बफर के साथ एक ट्रे में जगह है, यह 5 मिनट के लिए धीरे रॉक करने की इजाजत दी ।
  3. जबकि जेल का घोड़ा है, एक बर्फ ब्लॉक प्लेस (में संग्रहीत-20 में डिग्री सेल्सियस) हस्तांतरण टैंक में और 3/4 पूर्ण करने के लिए स्थानांतरण बफर जोड़ें ।
  4. पॉलीविननीडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली को 30 एस के लिए १०० प्रतिशत मेथेनॉल में भिगोकर गीला कर लिया जाता है ।
  5. एक बार 5 मिनट बीत चुके हैं, स्थानांतरण बफर के साथ एक ट्रे में स्थानांतरण स्थापित करने के लिए तैयार । हस्तांतरण बफ़र के लिए पूरी तरह से दाग डूब पर्याप्त होना चाहिए । सेट अप के रूप में ब्लॉट स्थानांतरण निंनानुसार: नीचे, कैसेट धारक के नीचे (काला); फिर एक मोटा स्पंज, अतिरिक्त मोटा सोख्ता कागज, polyacrylamide जेल, एक pvdf झिल्ली, अतिरिक्त मोटी सोख्ता कागज, और एक मोटी स्पंज; तो अंत में कैसेट धारक के ऊपर (सफेद) शीर्ष पर ।
  6. कैसेट ताला और सकारात्मक एनोड और नकारात्मक की ओर जेल की ओर PVDF झिल्ली के साथ स्थानांतरण टैंक में इकाई जगह है । स्थानांतरण बफर के साथ इकाई बंद ऊपर जब तक अपने स्थानांतरण पूरी तरह से जलमग्न है ।
  7. एक हलचल थाली के शीर्ष पर इकाई प्लेस । इकाई के लिए एक हलचल बार जोड़ें और १२५ rpm पर सरगर्मी शुरू करते हैं ।
  8. ६० मिनट के लिए १०० V पर चलाएँ ।
  9. हस्तांतरण चल रहा है, जबकि, Tween-20, पीएच ७.५ (TBST) के साथ Tris-buffered खारा में भंग 5% पाउडर दूध का एक समाधान तैयार ।
  10. इकाई विघटित और झिल्ली को हटा दें, टिप्पण जो पक्ष जेल के साथ संपर्क में था; सुनिश्चित करें कि यह पक्ष ट्रे में बचे हुए चरणों के लिए रहता है ।
  11. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 5% दूध-TBST समाधान के 5 मिलीलीटर में इनक्यूबेकिंग द्वारा झिल्ली को अवरुद्ध करके इसके बाद, Tris-buffered खारा (टीबीएस) में झिल्ली को 2 मिनट के लिए भिगो दें ।
  12. 5% दूध की एक ताजा 4 मिलीलीटर के साथ दूध की जगह-TBST समाधान और उचित कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (इस मामले में, हमारे कमजोर पड़ने dUTPase एंटीबॉडी के लिए 1:2000 है) और 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल कमाल के साथ रात से अधिक सेते ।
  13. अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान discarding, एक कमरे के तापमान घुमाव के लिए 4 ° c घुमाव से दाग हटा दें ।
  14. TBST के साथ तीन जल्दी washes करते हैं, के लिए पर्याप्त तरल का उपयोग पूरी तरह से दाग डूब, 3 washes, 5 मिनट प्रत्येक, धीरे से कमाल के बाद ।
  15. पिछले धोने के बाद, 5% दूध के 5 मिलीलीटर-TBST समाधान जोड़ें और 15 मिनट के लिए दाग रॉक तो त्यागने ।
  16. वांछित एकाग्रता में माध्यमिक एंटीबॉडी 5% दूध में पतला-TBST जोड़ें । (इस मामले में, 1:5000 बकरी विरोधी के कमजोर पड़ने 5% दूध के 5 मिलीलीटर-TBST समाधान में पतला खरगोश)
  17. कमरे के तापमान पर सेते, 1 ज के लिए कमाल है, तो समाधान त्यागें ।
  18. 3 washes, 5 मिनट प्रत्येक के बाद TBST के साथ तीन त्वरित washes मत करो, धीरे से कमाल है, तो अंतिम धोने त्यागने और TBS के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  19. एक 1:1 के मिश्रण तैयार एक ईसीएल chemiluminescent खोज समाधान (2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए प्रत्येक अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर) और यह सीधे जोड़ने के दाग के लिए 1 मिनट के लिए इनक्यूबैटिंग ।
  20. चिमटी का उपयोग कर झिल्ली निकालें और एक प्रयोगशाला पोंछ के साथ कोने थपका, किसी भी अतिरिक्त समाधान को हटाने । हटना लपेटो में झिल्ली प्लेस और एक एक्स-रे कैसेट में प्रोटीन पक्ष जगह है ।
  21. एक्स-रे फिल्म के लिए झिल्ली का पर्दाफाश । एक्सपोज़र का समय भिंन होगा ।

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Representative Results

परमाणु ड्यूप्टेस एक अंतराआण्विक डाइसल्फाइड सहलग्नता बनाता है जो प्रत्येक मोनोमेरिक प्रोटीन के तीसरे अमीनो अम्ल पर अवस्थित दो सिस्टीन अवशेषों की अन्योन्यक्रिया के माध्यम से एकस्थिर डिमर विन्यास निर्मित कर रहा है । यह चित्र 1a, Bमें दर्शाया गया है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि गैर-कम वातावरण में प्रवसन असामान्यताओं के कारण यह एक अविशिष्ट संपर्क नहीं था, उचित नियंत्रण का समावेश आवश्यक था । नोट की, परमाणु dUTPase चार मनुष्यों में मौजूद isoforms में से एक है । चार isoforms के तीन एक अद्वितीय अमीनो टर्मिनल डोमेन है, जबकि एक आम उत्प्रेरक11,12साझा । के रूप में पश्चिमी दाग पर देखा, फसल कटाई के समय मानव कोशिकाओं में dutpase के एकलक पुष्टि dutpase के isoforms के कम से तीन का एक संयोजन है (माइटोकॉन्ड्रिया isoforms, परमाणु isoforms, और एक छोटे से M24 पर notated संस्करण), जो सभी हमारे पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी से पहचाने जाते हैं । परमाणु isoform ही isoform है कि अपने अद्वितीय अमीनो टर्मिनल डोमेन में एक सिस्टीन अवशेष शामिल है । नाभिकीय समरूपी होने के कारण, पश्चिमी धब्बे पर दिखाई देने वाले प्रोटीनों की मोनोमेरिक अवस्था का केवल एक छोटा सा प्रतिशत होता है, यह उस समरूपी की द्विभाजीय अवस्था को प्रदर्शित करने के लिए अब उजागर हो गया था ।

माइटोकॉन्ड्रियल आइसोफॉर्म में परमाणु आइसोफार्म में मौजूद सिस्टीन अवशेषों का अभाव होता है और इस अंतराआण्विक डाइसल्फाइड लिंकेज के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाता था । जैसा कि चित्र 1cमें देखा गया है, माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के बाद एक वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण से पता चलता है कि गैर-कमी शर्तों के तहत इस isoform एक डाइसल्फ़ाइड लिंकेज फार्म का नहीं था और एकलक प्रोटीन के लिए भविष्यवाणी की आणविक वजन के लिए चले गए ।

इस परिसर की पुष्टि करने के लिए एक multimeric जटिल फार्म कर सकते हैं, formaldehyde पार से जोड़ने प्रदर्शन किया गया था । विलगित नाभिक 1% formaldehyde उपचार के अधीन किया गया के अधीन हो गया, कम शर्तों के तहत denaturing एसडीएस पृष्ठ/ जैसा कि चित्र 2में दर्शाया गया है, द्विलीकरण की कल्पना की गई थी । जब क्रॉस-लिंक को 15 मिनट के लिए ९५ ° c पर नमूने को इंक्यूबैटिंग द्वारा उलट दिया गया था, तो जटिल को अस्थिर किया गया था और इसकी मोनोमेरिक अवस्था में कल्पना की जा सकती थी ।

Figure 1
चित्र 1: नाभिकीय ड्यूप्टेस प्रोटीन में अंतराआण्विक डाइसल्फाइड आबंध निर्माण का निरूपण । (क) कमी एजेंट, बीटा-mercaptoethanol (bme) की अनुपस्थिति में कुल सेल निष्कर्षों (tce) के एक पश्चिमी धब्बे विश्लेषण, U-2 OS, Saos2, A549, और 18co की अतुल्यकालिक आबादी में एक multimeric जटिल गठन दर्शाता है के रूप में काले द्वारा संकेत दिया बॉक्स. (ख) यह परिसर जांच की गई सभी चार कोशिका लाइनों में बीएमई के योग के साथ गायब हो जाता है जिसमें एक डाइसल्फाइड लिंकेज की उपस्थिति का उल्लेख होता है । (ग) यू-2 ओएस कोशिकाओं, ± bme से प्राप्त टीसीई और शुद्घ माइटोकॉन्ड्रियल अर्क (mito) का एक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण-bme नमूने में कोई मल्टिमेरिक जटिल गठन नहीं दिखाता है । पैनलों में कम पैनलों ए, बी, और सी 10 के लिए एक्स-रे फिल्म के लिए जोखिम प्रदर्शन, dutpase के तीन isoforms के एकलक राज्य दिखा । एक और बी में ऊपरी पैनल 1 मिनट के लिए उजागर किया गया था, जबकि सी में ऊपरी पैनल 2 मिनट के लिए उजागर किया गया था । प्रत्येक लेन पर प्रोटीन की समतुल्य मात्रा लागू की गई थी । ड्यूप्टेस के संरक्षित कार्बोक्सिल टर्मिनल डोमेन के विरुद्ध पोलीक्लोनल विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ ब्लॉट की जांच की गई । यह आंकड़ा रोटोली एट अल से संशोधित किया गया है ।11कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: Formaldehyde परमाणु dUTPase के पार से जोड़ने के प्रदर्शन multimeric जटिल गठन । यू-2 ओएस कोशिकाओं 15 मिनट के लिए 1% formaldehyde के साथ इंक्यूबेटिड थे । नाभिक (N) अलग थे तो वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा विश्लेषण किया गया के लिए एक विशिष्ट पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर के संरक्षित carboxyl-टर्मिनल डोमेन dutpase (+ formaldehyde) के खिलाफ । Formaldehyde पार से लिंक रिवर्स करने के लिए, परमाणु तैयारी से व्युत्पंन निष्कर्षों SDS के साथ मिश्रित थे पृष्ठ बफर तो ९८ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम BME की उपस्थिति में 15 मिनट के लिए (+ formaldehyde, ९८ ° c 15 मिनट के लिए) । विप्रेक्षित विषमता (जैसे-दोहरी बैंड) की तैयारी के साथ देखा गया है, लेकिन यह formaldehyde उपचार के कारण असंगत प्रवास के कारण हो सकता है । लोअर पैनल 10 एस के लिए एक्स-रे फिल्म के संपर्क में है, जबकि ऊपरी पैनल एक्स-रे फिल्म के लिए 2 मिनट के लिए संपर्क में है । यह आंकड़ा रोटोली एट अल से संशोधित किया गया है ।11कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहाँ उल्लिखित विधि, बहुमूलीय परिसरों के विश्लेषण के लिए एक सीधा-अग्रवर्ती प्रोटोकॉल प्रदान करती है जो डाइसल्फाइड संपर्कों के माध्यम से स्थिर होती है । इस प्रोटोकॉल को आसानी से अंय कोशिका संस्कृति लाइनों, ऊतकों और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि डिसल्फाइड लिंकेज निष्कर्षण प्रक्रिया का परिणाम नहीं हैं । किसी भी मुक्त सिस्टीन अवशेषों iodoacetamide13का उपयोग कर अवरुद्ध किया जा सकता है । इस ऐल्किलन एजेंट covalently सिस्टीन के अवशेषों को बांध हालांकि उनके thiol समूह, नए डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन अवरुद्ध होगा । हालांकि, अगर डायसल्फाइड बांड इलाज के समय मौजूद है तो यह एजेंट उसे बाधित नहीं करेगा । Iodoacetamide का अनुकूलन एकाग्रता और समय की भिन्नता का उपयोग किया जा सकता है. हालांकि, इस अभिकर्मक के लिए जोखिम पर सेल मौत का कारण होगा ।

इस प्रोटोकॉल के लिए एक अतिरिक्त कदम है कि उपयोगी हो सकता है formaldehyde पार से जोड़ने का अनुकूलन है । Formaldehyde के प्रतिशत के अंतर के रूप में अच्छी तरह से पार से जोड़ने के समय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है9,14। यह ध्यान रखें कि formaldehyde के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय बढ़ जाती है के प्रतिशत के रूप में महत्वपूर्ण है, तो गैर विशिष्ट बातचीत बनाने की संभावना है । Multimeric परिसर की डाउनस्ट्रीम पुष्टि भी आवश्यक है । आणविक वजन और पहचान निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी तकनीक, यदि जटिल एक heteromultimeric है, मास स्पेक्ट्रोमेट्री है. इसके अलावा, साइट निर्देशित mutagenesis एक उपयुक्त तकनीक के लिए सिस्टीन के अवशेषों के लिए जिंमेदार निर्धारित कर सकते है डाइसल्फ़ाइड लिंकेज ।

अंत में, गैर-कम एसडीएस-पेज विश्लेषण और formaldehyde क्रॉस-लिंकिंग सत्यापन के इस दो कदम विधि अपनी तकनीकी आसानी और कम लागत के कारण फायदेमंद है । यह मल्टीमेरिक संयोजनों को अपसुल्फाइड लिंकेज द्वारा स्थिर करने में पहला कदम हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे इस पांडुलिपि की सामग्री के साथ ब्याज का कोई संघर्ष है ।

Acknowledgments

हम कृतज्ञता के प्रयासों की सराहना करते हैं Dr. जेनिफर फिशर द्वारा dUTPase पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की शुद्धि के लिए और उसके सभी प्रयासों को इस पांडुलिपि को संपादित करने के लिए Kerri Ciccaglione के लिए प्रस्तुत । इस शोध आंशिक रूप से ंयू जर्सी स्वास्थ्य फाउंडेशन (अनुदान #PC 11-18) से एक अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% precast TGX gels ThermoFisher Xp00160
175 cm2 Flask Cell star 658175
18CO ATCC CRL-1459
6 cm2 dish VWR 10861-588
A549 ATCC CCL-185
Amersham ECL detection kit GE 16817200
Blot transfer apparatus Biorad 153BR76789
BME Sigma Aldrich M3148
Bradford protein reagent Biorad 5000006
Bromophenol Blue
BSA Cell signaling 99985
Cell lysis buffer Cell signaling 9803
Centrifuge Eppendor 5415D
DMEM Gibco 11330-032
Drill
EDTA Sigma Aldrich M101
Electrophoresis apparatus Invitrogen A25977
Extra thick western blotting paper ThermoFisher 88610
Fetal bovine serum Gibco 1932693
Formaldehyde ThermoFisher 28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol Sigma Aldrich 65516
Glycine RPI 636050
Heat block Denville 10285-D
Hepes Sigma Aldrich H0527
Hydrochloric acid VWR 2018010431
Iodoacetamide ThermoFisher 90034
Kimwipe Kimtech 34155
Methanol Pharmco 339000000
Non-fat dry milk Cell signaling 99995
PBS Sigma Aldrich P3813
PMSF Sigma Aldrich 329-98-6
Posi-click tube Denville C2170
Power supply Biorad 200120
Prestained marker ThermoFisher 26619
PVDF membrane Biorad 162-0177
Rocker Reliable Scientific 55
Saos2 ATCC HTB-85
SDS Biorad 161-0302
Secondary antibody Cell signaling 70748
Small cell scraper Tygon S-50HL class VI
Sodium chloride RPI S23020
Sodium pyruvate Gibco
Sonicator Branson 450
Sponge pad for blotting Invitrogen E19051
Stir plate Corning PC353
Sucrose Sigma Aldrich S-1888
Tris Base RPI T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 Sigma Aldrich SRE0031
Tris-Glycine running buffer VWR J61006
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
U-2 OS ATCC HTB-96
X-ray film ThermoFisher 34090

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान मुद्दा १४७ गैर कम एसडीएस-पृष्ठ रासायनिक crosslinking formaldehyde डाइसल्फाइड लिंकेज आयोडोएसिटामाइड multimeric परिसरों स्तनधारी कोशिका संस्कृति
संस्कृति में स्तनधारी कोशिकाओं में डाइसल्फाइड लिंकेज द्वारा स्थिर मल्टीमेरिक परिसरों का पता लगाने के लिए गैर-कम करने वाले एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण और रासायनिक Crosslinking का संयोजन
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Rotoli, S. M., Caradonna, S. J.… More

Rotoli, S. M., Caradonna, S. J. Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture. J. Vis. Exp. (147), e59483, doi:10.3791/59483 (2019).

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