Summary
ومنذ فتره طويلة من المعروف ان الروابط الثنائية الكبريتيد لتحقيق الاستقرار في هيكل العديد من البروتينات. والطريقة البسيطة لتحليل المجمعات التي استقرت فيها هذه الروابط هي من خلال عدم الحد من البيانات التحليلية للصفحات. هنا ، يتم توضيح هذه الطريقة عن طريق تحليل ايزوفورم النووية من دوبيز من العظم البشري خط الخلايا العظمية U-2 OS.
Abstract
وتستقر هياكل العديد من البروتينات من خلال الروابط الثنائية التكافؤ. وفي الاعمال الاخيره ، صنفت هذه الرابطة أيضا علي انها تعديل بعد الإجراءات الانتقالية. التالي ، من المهم ان تكون قادره علي دراسة هذا التعديل في الخلايا الحية. طريقه بسيطه لتحليل هذه المجمعات مولتيمريك استقرت السيستين هو من خلال طريقه من خطوتين من عدم الحد من SDS-صفحه التحليل و الفورمالديهايد عبر ربط. هذه الطريقة من خطوتين هو مفيد كخطوه اولي للكشف عن المجمعات مولتيمريك استقرت من خلال الروابط الثنائية بسبب سهوله التقنية وانخفاض تكلفه التشغيل. هنا ، يستخدم العظم البشري خط الخلايا العظمية U-2 OS لتوضيح هذه الطريقة عن طريق تحليل علي وجه التحديد ايزوفورم النووية من دوبيز.
Introduction
ومنذ فتره طويلة من المعروف ان الروابط الثنائية الكبريتيد لتحقيق الاستقرار في هيكل العديد من البروتينات. في العمل الأخير ، وقد صنفت هذه الرابطة أيضا كتعديل عكسها بعد الانتقالية ، بوصفها المستندة إلى السيستين "تبديل الاكسده" السماح لتحوير وظيفة البروتين ، والموقع والتفاعل1،2، 3,4. التالي ، من المهم ان تكون قادره علي دراسة هذا التعديل. طريقه بسيطه لتحليل هذه المجمعات مولتيمريك استقرت السيستين من خلال عدم الحد من SDS-تحليل الصفحة5. تحليل SDS-PAGE هو أسلوب يستخدم في العديد من المختبرات ، حيث يمكن الحصول علي النتائج وتفسيرها بسرعة وسهوله وباقل التكاليف ، وهو مفيد علي التقنيات الأخرى المستخدمة لتحديد الروابط الثنائية الكبريتيد مثل قياس الطيف الكتلي6 ,7 و [ديشرويسم] دائريه8.
خطوه هامه واحده في تحديد ما إذا كان هذا الأسلوب هو تقنيه مناسبه للمساعدة في الدراسة هو فحص دقيق للتسلسل الأساسي للبروتين الفائدة لضمان وجود بقايا السيستين (ق) الحالية. خطوه أخرى مفيده هي البحث عن اي هياكل الكريستال السابقة التي نشرت أو استخدام تطبيق المعلوماتية الحيوية لاستكشاف بنيه الابعاد الثلاثة للبروتين من الفائدة لتصور حيث بقايا السيستين (ق) قد تكون موجودة. إذا كانت بقايا (ق) موجودة علي السطح الخارجي قد يكون أفضل مرشح لتشكيل الربط الكبريتيد بدلا من بقايا السيستين مدفونة في الداخل من الهيكل. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان البروتينات قد تخضع للتغيرات الهيكلية علي التفاعلات الركيزة أو تفاعلات البروتين البروتين السماح لهذه المخلفات لتصبح ثم تتعرض للبيئة ، وكذلك.
يمكن بعد ذلك التحقق من المجمعات مولتيمريك المحددة مع الكيميائية عبر ربط استخدام الفورمالديهايد. الفورمالديهايد هو مثاليه عبر رابط لهذه التقنية التحقق بسبب نفاذيه الخلية العالية وقصيرة عبر ربط تمتد من ~ 2-3 Å ، وضمان الكشف عن التفاعلات بروتين البروتين محدده9،10. هنا ، يتم توضيح هذه الطريقة عن طريق تحليل ايزوفورم النووية من دوبيز من العظم البشري خط الخلايا العظمية U-2 OS11. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لخطوط الخلايا الأخرى والانسجه والكائنات الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. حجب بقايا السيستين الحرة باستخدام ايودواسيتاميد
- تنمو الخلايا U-2 نظام التشغيل في 6 سم2 طبق إلى 50 ٪-60 ٪ كونفلوينسي في الحد الأدنى من المتوسطة الاساسيه مع ارتفاع الجلوكوز التي تحتوي علي 10 ٪ الجنين البقري المصل و 1 ٪ بيروفات الصوديوم في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2.
- جعل المخزون الطازج من iodoacetamide 10 ملم فقط قبل الاستخدام ، ثم تجاهل اي كاشف غير المستخدمة.
- أضافه 0.1 mM التركيز النهائي iodoacetamide مباشره إلى وسائط ثقافة الخلية. صخره بلطف الطبق في درجه حرارة الغرفة لمده 2 دقيقه.
2. حصاد الخلايا
- يستنشق وسائل الاعلام من الخلايا.
- غسل الخلايا مع 5 مل من الفوسفات الباردة-مخزنه المالحة (تلفزيوني) ثلاث مرات. يستنشق الحل النهائي لغسل الملابس التلفزيونية ثم أضافه 1 مل من الباردة.
- كشط الخلايا قباله الجزء السفلي من الطبق باستخدام مكشطه الخلية. باستخدام ماصه 1 مل سحب ما يصل النظام التلفزيوني وتعليق الخلية والاستغناء عن كل السائل في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL.
- تدور الخلايا في 7,500 x g لمده ثلاث دقائق في 4 °c. يستنشق التلفزيوني ، تاركا الخلية بيليه وراءها. يمكن تخزين الخلية بيليه في-80 درجه مئوية حتى معالجه
3. استخراج البروتين
- اعداد 100 μL من المخزن المؤقت تحلل 1x المخفف في ddH2O (انظر جدول المواد). أضافه فلوريد فينيل ميثيل السلفونيل (PMSF) مباشره قبل الاستخدام إلى تركيز نهائي 1 ملم.
- أضافه 50 μL من المخزن المؤقت تحلل 1x مباشره إلى الخلية بيليه والتعليق. احتضان هذا علي الجليد لمده 5 دقائق.
- سوكاتي لمده 8 ليالي باستخدام وضع نبض ثابت في 40 ٪ (انظر جدول المواد ل sonicator ؛ ضبط حسب الضرورة لمختلف الاجهزه الصوتية) ، والحفاظ علي استخراج علي الجليد.
- تدور استخراج في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق في 16,000 x g. و ماده طافي هو كسر البروتين القابل للذوبان. ويمكن اجراء تحليل برادفورد لتحديد تركيز البروتين إذا رغبت في ذلك.
4. اعداد العينات
- خذ 10 μL من استخراج البروتين القابل للذوبان وأضافه 10 μL من 1x Laemmli SDS-عينه العازلة (4 ٪ SDS ، 20 ٪ الجلسرين ، 0.004 ٪ بروموفينول الأزرق ، و 0.125 M تريس-HCl ، pH 6.8). لا تقم باضافه اي الكواشف الحد.
- الاحتفاظ بالعينات علي الجليد إذا كان سيتم اجراء تحليل SDS PAGE في ذلك اليوم ؛ للتخزين علي المدى الطويل ،-20 درجه مئوية هو المناسب. الحق قبل تشغيل هلام ، تسخين العينة لمده 5 دقائق في 85 درجه مئوية.
5. في فيفو الفورمالديهايد الصليب-ربط البروتينات الذاتية في خلايا OS-2
- تنمو الخلايا U-2 OS في 175 سم2 قارورة إلى 70 ٪-80 ٪ كونفلوينسي (انظر القسم 1).
-
قم باجراء التفاعل المتقاطع بين الفورمالديهايد
- في غطاء الدخان ، قسامه محلول الفورمالديهايد 37 ٪ شراؤها من مصادر تجاريه. أضافه المثبت الفورمالديهايد مباشره إلى الوسط إلى تركيز النهائي من 1 ٪ واحتضان في درجه حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف لمده 15 دقيقه.
- لإرواء رد الفعل ، أضافه 1.25 M الجليسين إلى تركيز نهائي من 0.125 م واحتضان في درجه حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف علي الروك لمده 5 دقائق.
- غسل الخلايا مع 5 مل من الباردة تلفزيوني ثلاث مرات. يستنشق الحل النهائي غسل التلفزيونية وأضافه 10 مل من تلفزيوني. كشط الخلايا قباله الجزء السفلي من القارورة باستخدام مكشطه الخلية.
- باستخدام ماصه 10 مل ، ورسم ما يصل تلفزيوني وتعليق الخلية والاستغناء عن كل من السائل في أنبوب الطرد المركزي المخروطية 15 مل. تدور الخلايا في 500 x g لمده 2 دقيقه في 4 °c. يستنشق التلفزيوني ، تاركا الخلية بيليه وراءها.
6. تجزئه النوى
- اعداد 10 مل من العازلة التجانس: 0.25 M السكروز ، 1 مم أدتا ، 10 ملم HEPES ، و 0.5 ٪ بوسنيا في الأس الهيدروجيني 7.4. أضف PMSF مباشره قبل الاستخدام إلى تركيز نهائي 1 ملم و 3 مل من المخزن المؤقت لتعليق النوى (0.1% تريتون X-100 في الاذاعه التلفزيونية).
- أضافه 5 mL العازلة التجانس مباشره إلى بيليه الخلية والتعليق تماما. الطرد المركزي تعليق في 500 x g لمده 2 دقيقه عند 4 °c ثم تجاهل supernatant.
- تعليق بيليه في 5 مل من العازلة التجانس. استخدام ضيق التركيب الخالطون الزجاج تفلون ، dounce المجانسة الخلايا في 10 السكتات الدماغية/500 دوره في الدقيقة.
- الطرد المركزي تعليق في 1,500 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c ، ثم تجاهل supernatant.
ملاحظه: استخدام ماده طافي لعزل الميتوكوندريا من قبل يطرد في 10,000 x g لمده 10 دقيقه. - تعليق بيليه في 1 مل العازلة تعليق نوى واحتضان علي الجليد لمده 10 دقيقه.
- الطرد المركزي في 600 x g لمده 10 دقيقه. تجاهل supernatant.
- تعليق بيليه في 1 مل العازلة تعليق نوى والطرد المركزي مره أخرى. تجاهل الخارقة. سوف بيليه النهائي تكون نواه معزولة.
7. استخراج البروتين
- كرر المقطع 4 ، باستثناء أضافه 25 μL من المخزن المؤقت تحلل 1x مباشره إلى بيليه الخلية ثم تعليق.
8. اعداد العينات
- اعداد عينتين ل SDS-PAGE بأخذ 10 μL كل من استخراج البروتين القابل للذوبان وأضافه 10 μL من 2x المخزن المؤقت لعينات المخزون الاحتياطي الصربي و 1 μL من 2-Mercaptoethanol (BME).
- الحرارة عينه واحده لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية والعينة الثانية لمده 15 دقيقه في 98 درجه مئوية لعكس رابط الصليب الفورمالديهايد.
9-تحليل الصفحات المخزونة
- اعداد 1 لتر من تريس-الجليسين تشغيل العازلة (25 ملم تريس ، 192 mM الجليسين ، 0.1 ٪ (w/v) SDS).
-
اعداد جهاز تشغيل الصفحة SDS.
ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول 16% الجاهزة TGX SDS صفحه. من الملاحظة ، يمكن استخدام اي هلام نسبه مئوية.- في بروتوكول الشركة المصنعة ، افتح الحزمة التي يتم تخزين الهلام فيها وأزاله الكاسيت.
- أزاله المشط الذي هو بطانة الآبار والشريط من الجزء السفلي من الكاسيت.
- ضع الهلام في الجهاز الجاري.
- ملء الغرفة مع 1x تشغيل العازلة حتى يتم غمر الآبار في السائل. باستخدام pipet البلاستيكية ، شطف الآبار مع المخزن المؤقت قيد التشغيل.
- تحميل العينات علي هلام مع 10 μL علامة القياسية الملون.
- تشغيل الهلام في 200 V حتى الجبهة صبغ ما يقرب من 1 سم من الجزء السفلي من هلام.
10. لطخه الغربية
- اعداد 1 لتر من 1x المخزن المؤقت نقل (25 ملم تريس ، 192 mM الجليسين ، 20 ٪ الميثانول) وتخزين في 4 درجه مئوية حتى الاستخدام.
- أزاله الهلام بعناية وفتح الكاسيت. باستخدام شفره الحلاقة ، وقطع بعناية وتجاهل هلام التراص. التقاط هلام باستخدام زاوية واحده ووضعه في علبه مع العازلة نقل ، مما يسمح لها ان الصخور بلطف لمده 5 دقائق.
- في حين ان هلام هو هزاز ، ووضع كتله الجليد (المخزنة في-20 درجه مئوية) في خزان نقل وأضافه العازلة نقل إلى 3/4 كامل.
- الرطب فلوفينليدين فلوريد (PVDF) غشاء بنقع في 100 ٪ الميثانول لمده 30 ثانيه.
- مره واحده قد مرت 5 دقيقه ، والاستعداد لاعداد نقل في علبه مع المخزن المؤقت نقل. يجب ان يكون المخزن المؤقت للنقل كافيا لدمج اللطخه بشكل كامل. اعداد نقل لطخه علي النحو التالي: في أسفل ، والجزء السفلي من حامل الكاسيت (اسود) ؛ ثم إسفنجه سميكه ، ورقه سميكه اضافيه التنقيط ، هلام بولياكريلاميد ، غشاء PVDF ، ورقه سميكه اضافيه التنقيط ، والإسفنج سميكه. ثم أخيرا اعلي حامل الكاسيت (ابيض) في الأعلى.
- قفل الكاسيت ووضع وحده في خزان نقل مع غشاء PVDF نحو الآنود الموجبة وهلام نحو السلبية. اعلي الوحدة مع المخزن المؤقت نقل حتى يتم المغمورة تماما النقل الخاص بك.
- وضع الوحدة علي راس لوحه يحركها. أضافه شريط تحريك إلى الوحدة والبدء في التحريك في 125 لفه في الدقيقة.
- تشغيل في 100 V لمده 60 دقيقه.
- في حين ان نقل قيد التشغيل ، واعداد حل من 5 ٪ مسحوق الحليب المذاب في تريس-مخزنه المالحة ، مع توين-20 ، pH 7.5 (TWEEN).
- تفكيك وحده وأزاله الغشاء ، مشيرا إلى الجانب الذي كان علي اتصال مع هلام ؛ ضمان بقاء هذا الضلع في الدرج للخطوات المتبقية.
- نقع الغشاء لمده 2 دقيقه في تريس-مخزنه المالحة (TBS) تليها عرقله الغشاء عن طريق احتضان في 5 مل من 5 ٪ الحليب-TBST حل لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- استبدلي الحليب بمحلول 4 مل من الحليب الطازج بنسبه 5% واضفي الجسم المضاد الأساسي في التخفيف المناسب (في هذه الحالة ، التخفيف هو 1:2000 للأجسام المضادة دوبيز) والاحتضان خلال الليل مع هزاز لطيف عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
- في اليوم التالي ، أزاله لطخه من الروك 4 درجه مئوية إلى درجه حرارة الغرفة الروك ، ونبذ حل الأجسام المضادة الاساسيه.
- القيام ثلاثه يغسل سريعة مع TBST ، وذلك باستخدام ما يكفي من السائل لغمر تماما وصمه عار ، تليها 3 يغسل ، 5 دقيقه لكل منهما ، هزاز ببطء.
- بعد غسل الماضي ، أضافه 5 مل من الحل 5 ٪ حليب-TBST وصخره وصمه عار لمده 15 دقيقه ثم تجاهل.
- أضافه الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 5% حليب-TBST في التركيز المطلوب. (في هذه الحالة ، 1:5000 التخفيف من الماعز المضادة لأرنب المخفف في 5 مل من محلول الحليب-TBST 5 ٪)
- احتضان في درجه حرارة الغرفة ، هزاز لمده 1 ساعة ، ثم تجاهل الحل.
- تفعل ثلاثه يغسل سريعة مع TBST تليها 3 يغسل ، 5 دقيقه لكل منهما ، هزاز ببطء ، ثم تجاهل غسل النهائي وأضافه 5 مل من TBS.
- اعداد 1:1 مزيج من حلول الكشف عن الكيمياء الكيميائية ECL (1 مل من كل كاشف لحجم النهائي من 2 مل) وأضافه هذا مباشره إلى احتضان لطخه لمده 1 دقيقه.
- أزاله الغشاء باستخدام ملاقط والداب الزاوية مع مسح المختبر ، وأزاله اي حل الزائدة. وضع الغشاء في التفاف يتقلص ووضع الجانب البروتين حتى في كاسيت الاشعه السينية.
- فضح الغشاء إلى فيلم الاشعه السينية. سيختلف وقت التعرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النووية دوبيز يشكل الربط ثنائي كبريتيد الجزيئية تشكيل تكوين ديمر مستقره من خلال التفاعل بين اثنين من بقايا السيستين المتمركزة في الأحماض الامينيه الثالثة لكل بروتين مونوميريك11. ويتجلى ذلك في الشكل 1 الفوباء. ولضمان عدم وجود تفاعل غير محدد بسبب تشوات الهجرة في البيئة غير المخفضة ، فان ادراج المراقبة السليمة أمر أساسي. من الملاحظة ، النووية دوبيز هي واحده من أربعه ايزوباشكال الموجودة في البشر. ثلاثه من الاشكال الاربعه لديها مجال الامينيه الطرفية فريدة من نوعها في حين تقاسم الاساسيه الحفاز المشتركة11,12. كما راينا علي لطخه الغربية ، وتاكيد موحودي من دوبيز في الخلايا البشرية في وقت الحصاد هو مزيج من ما لا يقل عن ثلاثه من الايزوفورم من دوبيز (الميتوكوندريا اشكال الاسويه ، ايزوفورم النووية ، ونسخه مقتطعه notated في M24) ، وكلها يتم التعرف عليها من قبل الأجسام المضادة لدينا بولكلونل. ايزوفورم النووية هو ايزوفورم الوحيد الذي يحتوي علي بقايا السيستين في مجالها الامينيه الفريدة الطرفية. واجبه إلى ال [ايزوفورم] نوويه يكون فقط نسبه مئوية صغيره من ال [مونوميريك] دوله من البروتينات يري علي اللطخه غربيه, هو كان كشفت طويلا ان يبرهن ال [ديميريك ستت] من ان [ايزوفورم].
ايزوفورم الميتوكوندريا يفتقر إلى بقايا السيستين الموجودة في ايزوفورم النووية وكان يستخدم كعنصر تحكم لهذا الربط ثنائي كبريتيد الجزيئية. كما راينا في الشكل 1c, عزل الميتوكوندريا متبوعا بتحليل لطخه الغربية أظهرت ان هذا الايزوفورم تحت ظروف عدم التقليل لا تشكل الربط الكبريتيد وهاجر إلى الوزن الجزيئي المتوقع للبروتين مونواريك.
لتاكيد هذا المجمع يمكن ان تشكل مجمع مولتيمريك ، تم تنفيذ الفورمالديهايد عبر ربط. وأخضعت النوى المعزولة لعلاج الفورمالديهايد بنسبه 1 ٪ تليها تحليل الصفحات المخزونة/الغربية وصمه عار في ظل ظروف الحد. وكما هو موضح في الشكل 2، تم تصور الانحلال الثنائي. وعندما تم عكس مسار الوصلة المتقاطعة باحتضان العينة عند 95 درجه مئوية لمده 15 دقيقه ، تزعزع استقرار المجمع ويمكن تصوره في حالته الاحاديه.
الشكل 1: مظاهره لتكوين السندات الثنائية الكبريتيد الجزيئية في بروتين دوبيز النووي. (ا) تحليل لطخه غربيه من إجمالي مقتطفات الخلايا (التعبير الذاتي) في غياب عامل الحد ، بيتا-mercaptoethanol (BME) ، يدل علي تشكيل معقده مولتيمريك في السكان غير المتزامنة لنظام التشغيل U-2 ، Saos2 ، A549 ، و 18co كما هو مبين من قبل الأسود مربع. (ب) يختفي هذا المركب مع أضافه BME في جميع خطوط الخلايا الاربعه التي تم فحصها ، مما يدل علي وجود صله بالكبريتيد. (ج) التحليل الغربي للطخه من التعبيرات الخاصة ومستخلصات الميتوكوندريا المنقية (ميتو) المستمدة من خلايا OS-2 ، ± BME ، لا يظهر تشكيل معقد مولتيمريك في عينه BME. اللوحات السفلي في لوحات A ، B ، و C تظهر التعرض لفيلم الاشعه السينية ل 10 ثانيه ، والتي تبين الدولة موحودي من الاشكال الثلاثة من دوبيز. وقد تعرضت ألواح العلوية في A و B لمده دقيقه واحده ، في حين تعرضت اللوحة العليا في C لمده 2 دقيقه. وطبقت كميات مكافئه من البروتين علي كل حاره. تم سبر blots مع الأجسام المضادة المحددة متعددة الأضلاع ضد المجال المحفوظة الكربوكسيل-المحطة الطرفية من دوبيز. وقد تم تعديل هذا الرقم من Rotoli وآخرون11الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الفورمالديهايد عبر ربط النووية دوبيز إثبات تشكيل معقده مولتيمريك. تم احتضان الخلايا U-2 OS مع 1 ٪ الفورمالديهايد لمده 15 دقيقه. نويت (ن) كانت معزولة ثم تحليلها بواسطة لطخه الغربية باستخدام الأجسام المضادة بولكلونل محدده ضد المجال المحفوظة الكربوكسيل-المحطة الطرفية من دوبيز (+ الفورمالديهايد). لعكس الفورمالديهايد عبر الروابط ، مقتطفات المستمدة من الاستعدادات النووية كانت مختلطة مع المخزن المؤقت SDS-PAGE ثم يسخن إلى 98 درجه مئوية لمده 15 دقيقه في وجود BME (+ الفورمالديهايد ، 98 درجه مئوية لمده 15 دقيقه). ولا تزال التباينات الملحوظة (اي عصابات الدوريت) التي شوهدت مع التحضيرات غير مفسره ، ولكنها قد ترجع إلى هجره شاذة بسبب المعالجة الفورمالديهايد. وتتعرض اللوحة السفلية لفيلم الاشعه السينية لمده 10 ليالي ، في حين تتعرض اللوحة العليا لفيلم الاشعه السينية لمده 2 دقيقه. وقد تم تعديل هذا الرقم من Rotoli وآخرون11الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والطريقة المبينة هنا تعطي بروتوكولا مستقيما لتحليل المجمعات المعقدة التي استقرت من خلال الروابط الثنائية الكبريتيد. ويمكن بسهوله تكييف هذا البروتوكول مع غيرها من خطوط ثقافة الخلايا والانسجه والكائنات الحية مما يسمح لطائفه واسعه من التطبيقات.
ومن الخطوات الهامه في هذا الاجراء ضمان الا تكون الروابط الثنائية الكبريتيد نتيجة لاجراء الاستخراج. اي بقايا السيستين الحرة يمكن حظرها باستخدام ايودواسيتاميد13. وهذا العامل الالكل ربط تساهميا إلى بقايا السيستين علي الرغم من مجموعه ثيول الخاصة بهم ، وعرقله تشكيل السندات الجديدة الكبريتيد. ومع ذلك ، إذا كان السند الكبريتيد موجودا في وقت العلاج هذا العامل لن يعطل ذلك. يمكن ان يتم الأمثل لل iodoacetamide باستخدام اختلاف التركيز والوقت. ومع ذلك ، علي التعرض لهذا الكاشف سوف يسبب موت الخلايا.
خطوه اضافيه لهذا البروتوكول التي قد تكون مفيده هو الأمثل من الفورمالديهايد عبر ربط. ويمكن استخدام الاختلاف من النسبة المئوية من الفورمالديهايد ، فضلا عن الوقت الذي يربط بين9،14. من المهم ان نلاحظ ان النسبة المئوية من الفورمالديهايد فضلا عن زيادة الوقت ، وكذلك القيام بفرص تشكيل التفاعلات غير محدده. تاكيد المصب من مجمع مولتيمريك ضروري أيضا. تقنيه مفيده لتحديد الوزن الجزيئي والهوية ، إذا كان المجمع هو مغاير ، هو الطيف الكتلي. أيضا ، يمكن ان تكون الطفرة الموجهة في الموقع تقنيه مناسبه لتحديد بقايا السيستين المسؤولة عن الربط الثنائي الكبريتيد.
وأخيرا ، فان هذه الطريقة ذات الخطوتين للتحليل غير المخفض لصفحات SDS والتحقق من الفورمالديهايد عبر الربط مفيده بسبب سهوله التقنية وانخفاض التكلفة. ويمكن ان تكون الخطوة الاولي في الكشف عن مجمعات مولتيمريك استقرت بالروابط الثنائية الكبريتيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ انه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المخطوطة.
Acknowledgments
ونحن نقدر بامتنان الجهود التي بذلتها الدكتورة جنيفر فيشر لتنقيه الأجسام المضادة المتعددة الأضلاع دوبيز و Kerri سيككاجليوني لجميع جهودها للمساعدة في تحرير هذه المخطوطة. وقد دعم هذا البحث جزئيا بمنحه من مؤسسه نيو جيرسي الصحية (منحه #PC 11-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B.
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
- Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
- Groitl, B., Jakob, U.
- Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha. Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).
- Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. Protein disulfide bond determination by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).
- Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).
- Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585 (2010).
- Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
- Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut). Protein Science. , (2018).
- Caradonna, S., Muller-Weeks, S. The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).
- Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T.
