Summary
Die Verbindung von Disulfiden ist seit langem bekannt, um die Struktur vieler Proteine zu stabilisieren. Eine einfache Methode, um multimerische Komplexe zu analysieren, die durch diese Verknüpfungen stabilisiert werden, ist die Nicht-Remation der SDS-PAGE-Analyse. Hier wird diese Methode durch die Analyse der nuklearen Isoform von DUTPase aus der menschlichen Knochen osteosarcoma Zelllinie U-2 OS veranschaulicht.
Abstract
Die Strukturen vieler Proteine werden durch kovalente disulfide Verbindungen stabilisiert. In den jüngsten Arbeiten wurde diese Anleihe auch als nachträgliche Modifikation eingestuft. Daher ist es wichtig, diese Veränderung in lebenden Zellen studieren zu können. Eine einfache Methode, um diese cysteinstabilisierten Multimerenkomplexe zu analysieren, ist eine zweistufige Methode, die SDS-PAGE-Analyse und Formaldehyd-Vernetzung nicht zu reduzieren. Diese zweistufige Methode ist als erster Schritt zur Aufdeckung von multimerischen Komplexen vorteilhaft, die durch disulfide Verbindungen aufgrund ihrer technischen Leichtigkeit und niedrigen Betriebskosten stabilisiert werden. Hier wird die menschliche Knochenosteosarkomat-Zelllinie U-2 OS verwendet, um diese Methode zu illustrieren, indem sie die nukleare Isoform von DUTPase gezielt analysiert.
Introduction
Die Verbindung von Disulfiden ist seit langem bekannt, um die Struktur vieler Proteine zu stabilisieren. In jüngster Zeit wurde diese Bindung auch als eine resible post-translationale Modifikation klassifiziert und fungiert als ein auf Zylinder basierender "Redox-Schalter," der die Modulation von Proteinfunktion, Lage und Interaktion 1, 2 ermöglicht. 3,4. Daher ist es wichtig, diese Modifikation studieren zu können. Eine einfache Methode, um diese cysteinstabilisierten multimerischen Komplexe zu analysieren, ist die Nicht-Rindung der SDS-PAGE-Analyse5. SDS-PAGE-Analyse ist eine Technik, die in vielen Labors verwendet wird, wo die Ergebnisse schnell, einfach und mit minimalen Kosten gewonnen und interpretiert werden können, und ist vorteilhaft gegenüber anderen Techniken, die verwendet werden, um disulfide Verbindungen wie Massenspektrometrie 6 zu identifizieren. ,7 und kreisförmig dichroistisch8.
Ein wichtiger Schritt bei der Bestimmung, ob diese Methode eine geeignete Technik ist, um in einer Studie zu helfen, ist es, die primäre Abfolge des Proteins von Interesse, um sicherzustellen, dass es Cystein-Rückstände (s) vorhanden sind gründlich zu untersuchen. Ein weiterer hilfreicher Schritt ist es, alle bisherigen Kristallstrukturen zu erforschen oder eine Bioinformatik-Anwendung zu verwenden, um die dreidimensionale Struktur des Proteins von Interesse zu erforschen, um zu visualisieren, wo sich die Cystein-Rückstände befinden können. Wenn die Rückstände auf der Außenfläche vorhanden sind, kann es ein besserer Kandidat sein, eine disulfide Verbindung zu bilden, anstatt einen Cystein-Rückstand, der auf der Innenseite der Struktur vergraben ist. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Proteine strukturelle Veränderungen bei Substratinteraktionen oder Protein-Protein-Wechselwirkungen durchlaufen können, so dass diese Rückstände dann auch der Umwelt ausgesetzt werden.
Identifizierte multimerische Komplexe können dann mit Hilfe chemischer Vernetzung mit Formaldehyd überprüft werden. Formaldehyd ist aufgrund der hohen Zelldurchlässigkeit und der kurzen Vernetzungsspanne von ~ 2-3, ein idealer Cross-Linker für diese Verifikationstechnik, der die Erkennung spezifischerProteinproteininteraktionen 9,10 gewährleistet. Hier wird diese Methode durch die Analyse der nuklearen Isoform von DUTPase aus der menschlichen Knochen osteosarcoma Zelllinie U-2 OS 11 veranschaulicht. Dieses Protokoll kann jedoch auch für andere Zelllinien, Gewebe und Organismen angepasst werden.
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Protocol
1. Blocking Free Cysteine Residues mit Iodoacetamid
- Wachsen Sie U-2-OS-Zellen in einer 6 cm 2 Schüssel bis zu 50% – 60% Durchblutung in minimalem essentiellen Medium mit hoher Glukose, die 10% fetales Rinderserum und 1% Natriumpyruvat bei 37 ° C in 5% CO2enthält.
- Machen Sie einen frischen Vorrat von 10 mM Iodoacetamid kurz vor der Verwendung, dann verwerfen Sie jedes ungenutzte Reagenz.
- Fügen Sie 0,1 mM Endkonzentration Iodoacetamid direkt in die Zellkulturmedien ein. Die Schüssel bei Raumtemperatur für 2 min sanft rocken.
2. Die Ernte der Zellen
- Aspiration die Medien aus den Zellen.
- Die Zellen dreimal mit 5 ml kalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS) waschen. Aspirieren Sie die endgültige PBS-Waschlösung, dann 1 ml kalte PBS hinzufügen.
- Mit einem Zellkratzer die Zellen vom Boden der Schale abkratzen. Mit einer 1 ML-Pipette die PBS und die Zellaufhängung aufziehen und die gesamte Flüssigkeit in ein 1,5 ML Mikrozentrifugenrohr geben.
- Die Zellen bei 7.500 x g für drei min bei 4 ° C ausspinnen. Aspirieren Sie die PBS, lassen Sie das Zellpellet zurück. Das Zellpellet kann bis zur Verarbeitung bei-80 ° C gelagert werden
3. Proteinentnahme
- Bereiten Sie 100 μL eines 1x-Lysepuffers vor, der in ddH2 O (siehe Tabelle der Materialien) verdünnt ist. Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (PMSF) unmittelbar vor der Verwendung zu einer 1 mM-Endkonzentration hinzufügen.
- 50 μL des 1x-Lysepuffers direkt in das Zellpellet geben und aussetzen. Inkubieren Sie dies auf Eis für 5 min.
- Sonicate für 8 s mit dem konstanten Pulsmodus bei 40% (siehe Materialtabelle für Soundatoren; passen Sie sich an, wie es für verschiedene Koniker notwendig ist), wobei der Extrakt auf Eis gehalten wird.
- Den Extrakt bei 4 ° C für 5 min bei 16.000 x g ausdrehen. Das Supernatant ist die lösliche Proteinfraktion. Bradford-Analysen können durchgeführt werden, um die Proteinkonzentration zu bestimmen, wenn gewünscht.
4. Probenvorbereitung
- Nehmen Sie 10 μL des löslichen Proteinextrakts und fügen Sie 10 μL eines 1x Laemmli SDS-Probenpuffers hinzu (4% SDS, 20% Glycerin, 0,004% Bromophenolblau und 0,125 M Tris-HCl, pH 6.8). Fügen Sie keine Reagenzien hinzu.
- Halten Sie Proben auf Eis, wenn SDS PAGE-Analyse an diesem Tag durchgeführt wird; Für die langfristige Lagerung sind-20 ° C geeignet. Kurz vor dem Lauf des Gels die Probe 5 Minuten bei 85 ° C erhitzen.
5. In Vivo Formaldehyd Cross-linking of Endogenous Proteins in U-2 OS Cells
- Wachsen Sie U-2-OS-Zellen in einer 175 cm 2 Flasche auf 70% – 80% Konluenz (siehe Abschnitt 1).
-
Führen Sie die Formaldehyd-Vernetzungsreaktion durch
- In einer Rauchhaube, aliquot eine 37% Formaldehyd-Lösung aus kommerziellen Quellen gekauft. Das Formaldehyd-Fixmittel direkt in das Medium geben und bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung für 15 min inkubieren.
- Um die Reaktion zu löschen, fügen Sie 1,25 M Glycin zu einer Endkonzentration von 0,125 M und inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung auf einem Rocker für 5 min.
- Die Zellen dreimal mit 5 ml kalter PBS waschen. Aspirieren Sie die endgültige PBS-Waschlösung und fügen Sie 10 ml PBS hinzu. Krabbeln Sie die Zellen mit einem Zellkratzer vom Boden der Flasche.
- Mit einer 10 mL-Pipette die PBS und die Zellaufhängung aufzeichnen und die gesamte Flüssigkeit in ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr geben. Die Zellen bei 500 x g für 2 min bei 4 ° C ausspinnen. Aspirieren Sie die PBS, lassen Sie das Zellpellet zurück.
6. Fraktionierung von Nuclei
- Bereiten Sie 10 ml Homogenisierungspuffer vor: 0,25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES und 0,5% BSA bei pH 7.4. Fügen Sie PMSF unmittelbar vor der Verwendung zu einer 1 mM-Endkonzentration und 3 ml Kernfederpuffer hinzu (0,1% Triton X-100 in PBS).
- Fügen Sie den 5 mL-Homogenisierungspuffer direkt in das Zellpellet ein und setzen Sie ihn komplett aus. Die Aufhängung bei 500 x g für 2 min bei 4 ° C zentrifugen und dann das Supernatant abwerfen.
- Das Pellet in 5 ml Homogenisierungspuffer aussetzen. Verwenden Sie einen eng anliegenden Glas-Teflon-Homogenisierer, dounce homogenisieren Zellen bei 10 Strokes/500 U/min.
- Die Aufhängung bei 1.500 x g für 10 min bei 4 ° C zentrieren, dann das Supernatant abwerfen.
NOTE: Verwenden Sie den Supernatant für die Isolierung von Mitochondrien, indem Sie 10 min zentrifugieren. - Das Pellet in 1 mL Kerne aufhängend puffern und 10 min auf Eis inkubieren.
- Zentrifuge bei 600 x g für 10 min. Discard den Supernatant.
- Das Pellet in 1 mL Nuklei Aufhängepuffer und Zentrifuge wieder aufhängen. Den Supernatant abwerfen. Das letzte Pellet wird isolierte Kerne sein.
7. Extraktion von Protein
- Wiederholen Sie den Abschnitt 4, es sei denn, man fügt 25 μL des 1x-Lysepuffers direkt in das Zellpellet hinzu und wird dann ausgesetzt.
8. Probenvorbereitung
- Bereiten Sie zwei Proben für SDS-PAGE vor, indem Sie jeweils 10 μL des löslichen Proteinextrakts einnehmen und 10 μL 2x Laemmli SDS-Probenpuffer und 1 μL 2-Mercaptoethanol (BME) hinzufügen.
- Eine Probe für 5 min bei 37 ° C und die zweite Probe für 15 min bei 98 ° C erhitzen, um die Formaldehyd-Querverbindung umzukehren.
9. SDS-PAGE-Analyse
- Bereiten Sie 1 L von 1x Tris-Glycin-Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% (w/v) SDS) vor.
-
Richten Sie den SDS-PAGE-Blaufgerät ein.
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine 16% vorgegebene TGX SDS-Seite. Beachten Sie jedoch, dass jedes prozentuale Gel verwendet werden kann.- Öffnen Sie nach dem Herstellerprotokoll das Paket, in dem das Gel gespeichert ist, und entfernen Sie die Kassette.
- Entfernen Sie den Kamm, der die Brunnen und das Klebeband von der Unterseite der Kassette auskleidet.
- Das Gel in den laufenden Apparat legen.
- Füllen Sie die Kammer mit dem 1x laufenden Puffer, bis die Brunnen in Flüssigkeit getaucht sind. Mit einem Plastikpiptier die Brunnen mit dem laufenden Puffer ausspülen.
- Laden Sie die Proben auf dem Gel zusammen mit 10 μL vorgefärbtem Standardmarker.
- Das Gel bei 200 V laufen lassen, bis die Farbstofffront ca. 1 cm vom Boden des Gels entfernt ist.
10. Western Blot
- 1 L 1x-Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol) vorbereiten und bis zum Gebrauch bei 4 ° C lagern.
- Das Gel vorsichtig entfernen und die Kassette öffnen. Mit einem Rasierer das Stapelgel vorsichtig schneiden und abwerfen. Nehmen Sie das Gel mit einer Ecke hoch und legen Sie es in ein Tablett mit Transferpuffer, so dass es für 5 Minuten sanft rocken kann.
- Während das Gel rockt, legen Sie einen Eisblock (in-20 ° C) in den Transferbehälter und fügen Sie den Transferpuffer auf 3/4 voll.
- Das Polyvinylidene Fluorid (PVDF)-Membran mit 100% Methanol für 30 s verdauen.
- Sobald die 5 Minuten vergangen sind, bereiten Sie sich darauf vor, den Transfer in einem Tablett mit Transferpuffer einzurichten. Der Transferpuffer sollte ausreichen, um den Schandfleck komplett zu untertauchen. Stellen Sie den Blot Transfer wie folgt ein: Unten, unten der Kassettenhalter (schwarz); Dann ein dicker Schwamm, extra dickes Flackpapier, das Polyacrylamid-Gel, eine PVDF-Membran, extra dickes Blottierpapier und ein dicker Schwamm; Dann schließlich die Spitze des Kassettenhalters (weiß) oben.
- Die Kassette verschließen und mit der PVDF-Membran in den Übergabetank in Richtung der positiven Anode und das Gel in Richtung Negativ legen. Füllen Sie das Gerät mit dem Transferpuffer aus, bis Ihr Transfer vollständig untergetaucht ist.
- Das Gerät auf eine ühren legen. Fügen Sie dem Gerät eine Rührstange hinzu und beginnen Sie mit 125 U/min.
- Laufen Sie bei 100 V für 60 min.
- Während der Transfer läuft, bereiten Sie eine Lösung von 5% Milchpulver in Tris-gepufferte Saline aufgelöst, mit Tween-20, pH 7,5 (TBST).
- Das Gerät zerlegen und die Membran entfernen, wobei festgestellt wird, welche Seite mit dem Gel in Kontakt stand; Stellen Sie sicher, dass diese Seite in der Schale für die restlichen Stufen bleibt.
- Die Membran 2 min in Tris-gepufferte Saline (TBS) einweichen, danach die Membran blockieren, indem in 5 mL 5 ml mit 5% Milch-TBST-Lösung 30 min bei Raumtemperatur inkubiert wird.
- Ersetzen Sie die Milch durch eine frische 4 ml Milch-TBST-Lösung und fügen Sie den primären Antikörper bei der richtigen Verdünnung hinzu (in diesem Fall ist unsere Verdünnung 1:2000 für den DUTPase-Antikörper) und inkubieren Sie über Nacht mit sanftem Schaukeln bei 4 ° C.
- Am nächsten Tag den Schandfleck aus dem 4 ° C-Rocker zu einem Raumtemperatur-Rocker entfernen und die primäre Antikörperlösung verwerfen.
- Machen Sie drei Schnellwäschungen mit TBST, mit genügend Flüssigkeit, um den Schlitz vollständig zu untertauchen, gefolgt von 3 Wäschen, jeweils 5 min, schaukeln langsam.
- Nach der letzten Wäsche 5 ml der 5%-Milk-TBST-Lösung hinzufügen und den Schlitz für 15 Minuten ausstechen und dann abwerfen.
- Bei der gewünschten Konzentration sekundärer Antikörper in 5% Milch-TBST verdünnt. (In diesem Fall 1:5000 Verwässerung von Ziege gegen Kaninchen in 5 mL von 5% Milch-TBST-Lösung verdünnt)
- Inkubieren Sie bei Raumtemperatur, rocken für 1 Stunde, dann werfen Sie die Lösung.
- Drei Schnellwäschungen mit TBST, gefolgt von 3 Waschungen, jeweils 5 min, langsam rocken, dann die letzte Wäsche ablegen und 5 ml TBS hinzufügen.
- Bereiten Sie eine 1:1 Mischung aus einer ECL-chemilumineszierenden Detektorungslösung (1 mL jedes Reagenzes für ein Endvolumen von 2 mL) vor und fügen Sie diese direkt in den Blot inkubieren für 1 min.
- Entfernen Sie die Membran mit Pinzette und dab die Ecke mit einem Laborwischtuch, wodurch jede überschüssige Lösung entfernt wird. Die Membran in Schrumpffolie legen und die Eiweißseite in eine Röntgenkassette legen.
- Die Membran dem Röntgenfilm aussetzen. Die Zeit der Exposition wird variieren.
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Representative Results
Die KerndUTPase bildet eine intermolekulare disulfide Verbindung, die durch das Zusammenspiel von zwei Cystein-Rückständen, die an der dritten Aminosäure jedes monomeren Proteins 11 positioniert sind, eine stabile Düste-Konfiguration bildet. Das zeigt sich in Abbildung 1A, B. Um sicherzustellen, dass es sich bei dieser disulfiden Verbindung nicht um eine unspezifische Wechselwirkung handelte, die auf Migrationsanomalien in der nicht reduzierten Umgebung zurückzuführen war, war die Aufnahme einer ordnungsgemäßen Kontrolle unerlässlich. Bemerkenswert ist, dass nukleare DUTPase eine von vier Isoformen ist, die beim Menschen vorhanden sind. Drei der vier Isoformen haben eine einzigartige Amino-Terminal-Domäne, während sie einengemeinsamen katalytischen Kern 11,12teilen. Wie auf dem westlichen Schloß zu sehen ist, ist die monomere Bestätigung von DUTPase in menschlichen Zellen zum Zeitpunkt der Ernte eine Kombination von mindestens drei der Isoformen der DUTPase (die Mitochondrien-Isoform, die nukleare Isoform, und eine abgeschnittene Version, die bei M24 notiert ist), die alle Sie sind von unserem polyklonalen Antikörper erkannt. Die nukleare Isoform ist die einzige Isoform, die in ihrer einzigartigen Amino-Terminal-Domäne einen Cystein-Rückstand enthält. Da die nukleare Isoform nur einen kleinen Prozentsatz des monomerischen Zustandes der Proteine auf dem westlichen Schlot darstellt, wurde es länger ausgesetzt, um den dimerischen Zustand dieser Isoform zu demonstrieren.
Der mitochondrialen Isoform fehlen die in der nuklearen Isoform vorhandenen Cystein-Rückstände und wurden als Kontrolle für diese intermolekulmolekulfide Verbindung verwendet. Wie in Abbildung 1C zusehen ist, zeigte die Isolierung der Mitochondrien, gefolgt von einer westlichen Blasenanalyse, dass diese Isoform unter nicht reduzierenden Bedingungen keine disulfide Verbindung bildete und auf das vorhergesagte Molekülgewicht für das monomische Protein abwanderte.
Um diesen Komplex zu bestätigen, kann ein multimerischer Komplex entstehen, es wurde eine Formaldehyd-Vernetzung durchgeführt. Isolierte Kerne wurden einer 1%-Formaldehyd-Behandlung unterzogen, gefolgt von der Denaturierung der SDS-PAGE/Westen-Blot-Analyse unter reduzierenden Bedingungen. Wie in Abbildung2 gezeigt, wurde die Dimerierung visualisiert. Als der Querglied durch Inkubation der Probe bei 95 ° C für 15 Minuten rückgängig gemacht wurde, wurde der Komplex destabilisiert und konnte in seinem monomeren Zustand visualisiert werden.
Abbildung 1: Demonstration der intermolekularen Disulfid-Bindungsbildung im nuklearen DUTPase-Protein. (A) Eine westliche Blasenanalyse von Gesamtzellenextrakten (TCE) in Abwesenheit des Reduktionsmittels Beta-Mercaptoethanol (BME) zeigt eine multimäre komplexe Formation in asynchronen Populationen von U-2 OS, Saos2, A549 und 18CO, wie sie von den Schwarzen angegeben wird. Box. (B) Dieser Komplex verschwindet mit dem Zusatz von BME in allen vier untersuchten Zelllinien, was auf das Vorhandensein einer disulfiden Verbindung hinweist. (C) Eine westliche Blasenanalyse von TCE und gereinigten Mitochondrien-Extrakten (Mito), die aus U-2-OS-Zellen, ± BME, abgeleitet werden, zeigt keine multimärare komplexe Formation in der BME-Probe. Die unteren Tafeln in den Panels A, B und C zeigen Röntgenfilm für 10 s, die den monomeren Zustand der drei Isoformen DUTPase zeigen. Die oberen Platten in A und B wurden 1 min freigelegt, während die obere Platte in C für 2 min freigelegt wurde. Auf jede Fahrspur wurden gleichwertige Mengen Eiweiß aufgetragen. Die Blots wurden mit einem polyklonalen spezifischen Antikörper gegen die konservierte Carboxyl-Terminal-Domäne von dUTPase probiert. Diese Figur wurde von Rotoli et al. 11Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Formaldehyd-Vernetzung von KerndUTPase zeigt eine multimerische komplexe Formation. U-2-OS-Zellen wurden 15 Minuten lang mit 1% Formaldehyd inkubiert. Nuclei (N) wurden durch einen westlichen Blot isoliert und mit einem speziellen polyklonalen Antikörper gegen die konservierte Carboxyl-Terminal-Domäne DUTPase (+ Formaldehyd) analysiert. Um die Formaldehyd-Querverbindungen umzukehren, wurden Extrakte aus den Kernpräparaten mit dem SDS-PAGE-Puffer gemischt und dann in Anwesenheit von BME für 15 Minuten auf 98 ° C erhitzt (+ Formaldehyd, 98 ° C für 15 min). Die beobachtete Heterogenität (d.h. Doppelbänder von nDut), die bei den Präparaten zu sehen sind, bleibt zu erklären, kann aber auf eine anomale Migration aufgrund der Formaldehyd-Behandlung zurückzuführen sein. Die untere Platte ist für 10 s Röntgenfilm ausgesetzt, während die obere Platte für 2 min Röntgenfilm ausgesetzt ist. Diese Figur wurde von Rotoli et al. 11Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die hier skizzierte Methode gibt ein Straight-Forward-Protokoll für die Analyse von multimären Komplexen, die durch disulfide Verbindungen stabilisiert werden. Dieses Protokoll lässt sich leicht an andere Zellkulturlinien, Gewebe und Organismen anpassen, die eine breite Palette von Anwendungen ermöglichen.
Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist es, sicherzustellen, dass die Disulfid-Verbindungen keine Folge des Absaugverfahrens sind. Alle freien Cystein-Rückstände können mit Iodoacetamid13blockiert werden. Dieses Alkylationsmittel bindet durch seine Thiol-Gruppe kovalent an Cystein-Rückstände und blockiert so die Bildung neuer Disulfid-Bindungen. Wenn die disulfide Bindung zum Zeitpunkt der Behandlung vorhanden ist, wird dieser Agent sie jedoch nicht stören. Die Optimierung des Iodoacetamid kann mit einer Variation von Konzentration und Zeit erfolgen. Allerdings wird die Überung dieses Reagenzes den Zelltod verursachen.
Ein weiterer Schritt zu diesem Protokoll, der hilfreich sein kann, ist die Optimierung der Formaldehyd-Vernetzung. Eine Variation des Ansatzes von Formaldehyd kann ebenso verwendet werden wie die Zeit der Vernetzung von9,14. Es ist wichtig zu beachten, dass mit zunehmendem Anteil des Formaldehydprozentals und der Zeit auch die Chancen auf die Bildung unspezifischer Wechselwirkungen bestehen. Auch eine nachgeschaltete Bestätigung des multimerischen Komplexes ist notwendig. Eine nützliche Technik, um das molekulare Gewicht und die Identität zu bestimmen, wenn der Komplex ein heteromultimerisches ist, ist die Massenspektrometrie. Auch kann die standortgesteuerte Mutagenese eine geeignete Technik sein, um die Cystein-Rückstände zu bestimmen, die für die Disulfid-Verbindung verantwortlich sind.
Schließlich ist diese zweistufige Methode der nicht reduzierten SDS-PAGE-Analyse und Formaldehyd-Vernetzung aufgrund ihrer technischen Leichtigkeit und niedrigen Kosten von Vorteil. Es kann ein erster Schritt sein, um multimerische Komplexe aufzudecken, die durch disulfide Verbindungen stabilisiert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Manuskripts haben.
Acknowledgments
Wir freuen uns über die Bemühungen von Dr. Jennifer Fischer für die Reinigung des dUTPase polyklonalen Antikörpers und Kerri Ciccaglione für all ihre Bemühungen, dieses Manuskript zu bearbeiten. Diese Forschung wurde teilweise durch ein Stipendium der New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
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