Summary
长期以来, 人们一直知道二硫化的联系可以稳定许多蛋白质的结构。通过非还原 SDS-PAGE 分析, 是分析通过这些联系稳定的多聚体复合物的一种简单方法。本文通过对人骨骨肉瘤细胞系 U-2 OS 的 dUTPase 核等形态的分析, 说明了该方法的应用。
Abstract
许多蛋白质的结构是通过共价二硫连接稳定的。在最近的工作中, 这种债券也被归类为翻译后的修改。因此, 能够研究活细胞中的这种修饰是很重要的。通过两步法进行非还原 SDS-PAGE 分析和甲醛交联, 是分析这些半胱氨酸稳定多聚体复合物的一种简单方法。这种两步法由于技术简单、运行成本低, 有利于发现通过二硫化连接稳定的多质配合物的第一步。在这里, 通过对 utpase 核等形式的具体分析, 用人骨骨肉瘤细胞系 U-2 os 对该方法进行了说明。
Introduction
长期以来, 人们一直知道二硫化的联系可以稳定许多蛋白质的结构。在最近的工作中, 这种键也被归类为可逆的翻译后修饰, 作为一个基于 cystein 的 "氧化还原开关", 允许调节蛋白质功能, 位置和相互作用1,2, 3,4。因此, 能够研究这种修改是很重要的。通过非还原 SDS-PAGE 分析 5, 是分析这些半胱氨酸稳定多聚类复合物的一种简单方法。SDS-PAGE 分析是许多实验室使用的一种技术, 在这种技术中, 可以快速、轻松、以最低的成本快速获得和解释结果, 并且比用于识别质谱等二硫联系的其他技术更有利. ,7和圆形二色 8.
确定这种方法是否是有助于研究的适当技术的一个重要步骤是彻底检查感兴趣的蛋白质的主要序列, 以确保存在半胱氨酸残留物。另一个有用的步骤是研究任何以前发表的晶体结构或使用生物信息学应用来探索感兴趣的蛋白质的三维结构, 以可视化半胱氨酸残渣可能位于何处。如果残渣存在于外部表面, 它可能是一个更好的候选物, 以形成一个二硫化链接, 而不是半胱氨酸残留物埋在结构内部。然而, 重要的是要注意的是, 蛋白质可能会在底物相互作用或蛋白质-蛋白质相互作用时发生结构性变化, 从而使这些残留物也暴露在环境中。
然后, 可以用化学交联法使用甲醛来验证已鉴定的多聚体配合物。甲醛是这种验证技术的理想交联剂, 因为细胞渗透率高, 交联跨度短, 约 2-3, 确保检测特定的蛋白质-蛋白质相互作用9,10。本文通过对人骨骨肉瘤细胞系 U-2 OS 11 的核异态分析, 说明了该方法的应用.然而, 该协议可适用于其他细胞系、组织和生物。
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Protocol
1. 使用碘乙酰胺阻断游离半胱氨酸残留量
- 在6厘米2盘中生长 u-2 os细胞, 在 5% co2 中, 在含有10% 胎儿牛血清和1% 丙酮酸钠的最低必要培养基中生长 u-2 os 细胞, 达到 50%-60% 融合.
- 在使用前, 制作 10 mM 碘乙酰胺的新鲜库存, 然后丢弃任何未使用的试剂。
- 直接在细胞培养基中加入 0.1 mM 的最终浓度碘乙酰胺。在室温下轻轻摇晃两分钟。
2. 收集细胞
- 从细胞中吸收培养基。
- 用5毫升的冷磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗细胞三次。吸收最终的 PBS 洗涤溶液, 然后添加1毫升的冷 PBS。
- 用刮板刮碗把电池从盘子底部刮下来。使用1毫升移液器绘制 PBS 和细胞悬浮液, 并将所有液体放入 1.5 mL 微离心管中。
- 在4°c 下, 以 7, 500 x克旋转细胞3分钟。吸收 PBS, 留下细胞颗粒。细胞颗粒可在-80°c 下储存, 直至加工
3. 蛋白质的提取
- 准备在 ddH2o 中稀释的1x 裂解缓冲液 100Μl (见材料表)。在使用前立即将苯甲基磺酰氟 (PMSF) 添加到 1 mM 的最终浓度中。
- 将1x 裂解缓冲液直接添加 50Μl, 直接加入细胞颗粒并悬浮。在冰上加用5分钟。
- 在40% 时使用恒定脉冲模式为8秒的索比 (见声纳材料表; 根据需要为不同的声纳调整), 将提取物保持在冰上。
- 在4°c 下旋转提取物 5分钟, 16, 000 x g。上清液是可溶性蛋白质的组分。如果需要, 可以进行布拉德福德分析来确定蛋白质浓度。
4. 样品制备
- 取10Μl 的可溶性蛋白提取物, 加入 1x Laemli sds 样品缓冲液 10μl (4% SDS、20% 甘油、0.004% 溴酚蓝和 0.125 m Tris-HCl, pH 6.8)。不要添加任何还原试剂。
- 如果当天将进行 SDS PAGE 分析, 则将样品放在冰上;对于长期储存,-20°c 是适当的。在运行凝胶之前, 请在85°c 下加热样品5分钟。
5. U-2 OS 细胞内源蛋白的体内甲醛交联
- 将 U-2 OS 细胞生长在175厘米2瓶中, 使其达到 70%-80% 的融合 (见第1节)。
-
进行甲醛交联反应
- 在通风罩中, 从商业来源购买的37% 的甲醛溶液。将甲醛固定剂直接添加到培养基中, 最终浓度为 1%, 并在室温下温和搅拌15分钟。
- 为了淬火反应, 在 0.125 M 的最终浓度中加入 1.25 M 甘氨酸, 并在室温下在摇杆上轻轻搅拌5分钟。
- 用5毫升的冷 PBS 清洗细胞三次。吸收最终的 PBS 洗涤解决方案, 并添加10毫升的 PBS。用刮板将烧瓶底部的细胞刮掉。
- 使用10毫升移液器, 绘制 PBS 和细胞悬浮液, 并将所有液体分配到一个15毫升锥形离心管。在4°C 下, 以 500 x g旋转细胞2分钟。吸收 PBS, 留下细胞颗粒。
6. 核的分馏
- 制备 10 mL 均质缓冲液: 0.25 M 蔗糖、1 mM EDTA、10 mM HEPES 和 0.5% BSA, pH 7.4。在使用前立即将 PMSF 添加到 1 mM 最终浓度和 3 Ml 的核子悬浮液 (PBS 中为 0.1% Triton X-100) 中。
- 将5毫升均质化缓冲液直接添加到细胞颗粒中, 并完全悬浮。在4°C 条件下, 以 500 x g离心悬浮液 2分钟, 然后丢弃上清液。
- 将颗粒悬浮在均质缓冲液的5毫升中。使用紧身玻璃-聚四氟乙烯均质机, 以 10 strokleks/500 rpm 的速度搅拌均质细胞。
- 在4°C 下, 以 1, 500 x克离心悬浮液 10分钟, 然后丢弃上清液。
请注意:使用上清液在 10, 000 x g的离心下分离线粒体10分钟。 - 悬浮在1毫升细胞核悬浮液中的颗粒, 在冰上孵育10分钟。
- 以 600 x g 离心 10分钟 , 丢弃上清液。
- 再次将颗粒悬浮在 1 mL 核子悬浮液和离心机中。放弃上清液。最后的颗粒将是孤立的细胞核。
7. 蛋白质的提取
- 重复第4节, 除了将1x 裂解缓冲液的25Μl 直接添加到细胞颗粒中, 然后悬浮。
8. 样品制备
- 通过每个可溶性蛋白质提取物 10Μl, 为 SDS-PAGE 准备两个样品, 并加入 2x Laemmli sds 样品缓冲液10Μl 和 2-硫醇 (BME) 1Μl。
- 在37°c 下加热一个样品 5分钟, 在98°c 下加热第二个样品 15分钟, 以反转甲醛交联。
9. SDS-PAGE 分析
- 准备 1x 1x 的 Tris-glycine 运行缓冲液 (25 mM Tris, 192 mm 甘氨酸, 0.1% (w/v) SDS)。
-
设置 SDS-PAGE 运行设备。
注:此协议使用16% 的预制 TGX sds 页。值得注意的是, 任何百分比的凝胶都可以使用。- 根据制造商协议, 打开存储在其中的包装, 然后取出盒式磁带。
- 从盒式磁带底部取下井内衬的梳子和胶带。
- 将凝胶放入运行装置中。
- 用1x 的运行缓冲液填充室内, 直到井被浸入液体中。使用塑料管道, 用运行的缓冲器冲洗出井。
- 将样品与10μl 预染色标准标记一起装上凝胶。
- 运行凝胶在 200 V, 直到染料前部是大约1厘米从底部的凝胶。
10. 西部布洛
- 准备1升的1x 转移缓冲液 (25 mM Tris, 192 mM 甘氨酸, 20% 甲醇), 并在4°c 下储存, 直到使用。
- 小心取下凝胶, 打开盒式磁带。使用剃须刀, 小心地切割并丢弃堆叠凝胶。拿起凝胶使用一个角落, 并将其放入托盘与转移缓冲器, 让它轻轻摇晃5分钟。
- 当凝胶摇晃时, 将一个冰块 (储存在-20°c) 放入转移槽中, 并将转移缓冲液添加到 "满"。
- 将聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜浸泡在100% 甲醇中30秒。
- 一旦5分钟过去了, 准备在带有传输缓冲区的托盘中设置传输。传输缓冲区应足以完全淹没印迹。设置印迹转移如下: 底部, 盒式磁带支架底部 (黑色);然后是厚海绵、超厚吸墨纸、聚丙烯酰胺凝胶、PVDF 膜、超厚吸墨纸、厚海绵;然后最后在上面的盒式磁带持有人 (白色) 的顶部。
- 将盒式磁带锁定, 并将设备放入转移槽中, 将 PVDF 膜朝向正极阳极, 将凝胶朝向负极。顶部关闭的单位与转移缓冲区, 直到您的转移完全淹没。
- 将设备放在搅拌板的顶部。在设备上加入搅拌杆, 并在125转/分开始搅拌。
- 以 100 V 的速度运行60分钟。
- 在转移过程中, 用 Tween-20, ph 7.5 (TBST), 准备5% 的奶粉溶液。
- 拆卸该装置并取出膜, 注意到哪一侧与凝胶接触;确保这一侧在剩余步骤中保持在纸盒中。
- 将膜浸泡 2分钟, 在三管盐水 (TBS) 中浸泡 2分钟, 然后在室温下孵育5毫升 tbst 溶液中, 在5毫升中堵塞膜, 时间为30分钟。
- 将牛奶替换为新鲜的4毫升5% 牛奶-tbst 溶液, 并在适当稀释时添加初级抗体 (在这种情况下, 我们的 Utpase 抗体稀释为 1:2000), 并在4°c 下温和摇晃孵育一夜。
- 第二天, 将印迹从4°c 摇杆移到室温摇杆上, 丢弃主要抗体溶液。
- 用 TBST 快速清洗三次, 用足够的液体完全淹没印迹, 然后用3次清洗, 每次 5分钟, 慢慢摇晃。
- 最后清洗后, 加入5% 牛奶 tbst 溶液中的5毫升, 摇摇印迹 15分钟, 然后丢弃。
- 加入在5% 牛奶 tbst 中稀释的二级抗体, 达到所需的浓度。(在这种情况下, 1:5000 稀释山羊抗兔稀释在5毫升 tbst 溶液5毫升)
- 在室温下孵化, 摇晃 1小时, 然后丢弃溶液。
- 用 TBST 快速洗三次, 然后再洗 3次, 每次洗 5分钟, 慢慢摇晃, 然后丢弃最后的清洗, 加入5毫升的 TBS。
- 准备 ECL 化学发光检测溶液的1:1 混合物 (每个试剂为1毫升, 最终体积为2毫升), 并将其直接添加到印迹孵育1分钟。
- 使用推拿器取下膜, 用实验室擦拭轻拍眼角, 去除多余的溶液。将膜放入收缩包装中, 并将蛋白质侧放在 x 射线盒式磁带中。
- 将膜暴露在 x 射线胶片上。接触时间会有所不同。
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Representative Results
核 Utpase 通过位于每个单体蛋白11的第三氨基酸上的两个半胱氨酸残基的相互作用, 形成分子间二硫醚链状, 形成稳定的二聚体结构.图 1a, b对此进行了演示。为了确保这种二价联系不是由于不减少环境中的移徙异常而产生的非特异性相互作用, 必须纳入适当的控制。值得注意的是, 核 dUTPase 是人类中存在的四种异形之一。四种异形中有三种具有独特的氨基端子域, 同时共享一个共同的催化核心11,12。正如在西方印迹上所看到的, 在收获时, 人体细胞中的 dUTPase 的单体确认是 dUTPase 的至少三种异形 (线粒体等形、核异形和 M24 标记的截断版本) 的组合, 所有这些都是被我们的多克隆抗体所识别。核异形是唯一在其独特的氨基末端域中含有半胱氨酸残留物的异形。由于核异形只是西方印迹蛋白单体状态的一小部分, 因此暴露时间更长, 以证明该异形的二聚态状态。
线粒体异形缺乏核异形中存在的半胱氨酸残留物, 并被用作控制这种分子间二元链的方法。如图 1C所示, 线粒体的分离, 然后进行西方印迹分析, 表明这种异形在非还原条件下不会形成二硫连接, 并迁移到单分子蛋白的预测分子量。
为了证实这一复合物可以形成一个多聚体复合物, 进行了甲醛交联。分离核经过1% 的甲醛处理, 然后在还原条件下进行变性 Sds-pagee·西部印迹分析。如图 2所示, 对二聚化进行了可视化。当在95°c 孵育样品15分钟时, 通过在95°c 孵育样品来逆转, 该复合物不稳定, 可以在其单体状态下显示出来。
图 1: 核 dUTPase 蛋白中分子间二硫键形成的演示.(A) 在没有还原剂β-硫醇 (bme) 的情况下, 对总细胞提取物 (tce) 进行西方印迹分析, 显示在 U-2 Os、Saos2、A549 和18co 的异步种群中形成多因素复合物, 如黑色所示箱。(B) 随着所检查的所有四个细胞系中添加 bme, 这一复合体消失, 表明存在二硫化链。(C) 对来自 U-2 os 细胞的 tce 和纯化线粒体提取物 (mito) 的西方印迹分析, ±bme 在-bme 样品中没有多聚体复合物的形成。A、B 和 C 面板中的下面板显示暴露于 x 射线胶片 10秒, 显示了 dUTPase 的三种异形的单体状态。A 和 B 中的上板暴露 1分钟, 而 C 中的上板暴露 2分钟, 每条车道上的蛋白质含量相等。用多克隆特异性抗体对 dUTPase 的保守羧基末端域进行了研究。这个数字已从罗托利等人修改,请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 核 Utpase 的甲醛交联显示了多聚体复合物的形成.用1% 甲醛孵育 U-2 os 细胞 15分钟, 用西方印迹法对 dUTPase (+ 甲醛) 的保守羧基末端段进行了特定的多克隆抗体分析。为了扭转甲醛的交联, 将核制剂中提取的提取物与 SDS-PAGE 缓冲液混合, 然后在 BME 存在的情况下加热15分钟至 98°c (+ 甲醛, 98°c, 15分钟)。观察到的异质性 (即与制备过程中的 nDut 双龙带) 仍有待解释, 但可能是由于甲醛处理引起的异常迁移。下面板暴露在 x 射线胶片上 10秒, 而上部面板暴露在 x 射线胶片上2分钟。这个数字已从罗托利等人修改,请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
本文概述的方法为通过二硫连接稳定的多聚体配合物的分析提供了一种直接的协议。该协议可以很容易地适应其他细胞培养系、组织和生物, 允许广泛的应用。
这一过程中的一个重要步骤是确保二硫连接不是提取过程的结果。任何游离半胱氨酸残留物都可以使用碘乙酰胺13阻止。这种烷基化剂通过其硫醇基团与半胱氨酸残基共价结合, 阻止新二硫醚键的形成。然而, 如果二硫键在治疗时存在, 这种剂不会破坏它。使用浓度和时间的变化可以对碘乙酰胺进行优化。然而, 过度接触这种试剂会导致细胞死亡。
该协议的另一个步骤可能是对甲醛交联的优化。甲醛的百分比的变化可以使用, 以及交联的时间 9,14。需要注意的是, 随着甲醛的百分比以及时间的增加, 形成非特定相互作用的机会也在增加。多面体的下游确认也是必要的。质谱是质谱联用技术, 它是确定分子量和同一性的一种有用的技术, 如果复合物是异质性的。此外, 现场定向诱变可以是一个合适的技术来确定半胱氨酸残留对二硫链的负责。
最后, 这种不减少 SDS-PAGE 分析和甲醛交联验证的两步方法由于其技术简便、成本低, 是有益的。它可以是发现通过二硫连接稳定的多聚体复合物的第一步。
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Disclosures
作者声明, 他们与这份手稿的内容没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢詹妮弗·费舍尔博士为纯化 dUTPase 多克隆抗体和 Kerri Ciccaglione 所做的努力, 为帮助编辑这份手稿所做的一切努力。这项研究得到了新泽西卫生基金会赠款的部分支持 (赠款 #PC 11-18)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
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