Summary
ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。これらのリンケージによって安定化された多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元 SDS − PAGE 分析を介して行う。ここで、この方法は、ヒト骨骨肉腫細胞株 dUTPase OS からの原発性の核アイソフォームを解析することにより図示される。
Abstract
多くのタンパク質の構造は共有性ジスルフィド結合によって安定化されます。最近の仕事では、この債券も翻訳後修飾として分類されています。このように、生細胞におけるこの修飾を研究することができることが重要である。これらのシステイン安定化多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元 SDS − PAGE 分析およびホルムアルデヒド架橋の2ステップ法を介して行う。この二段階法は、その技術的容易さと低運転コストのためにジスルフィド結合によって安定化された多量体錯体を明らかにする最初のステップとして有利である。ここで、ヒト骨骨肉腫細胞株 U-2 OS は、dUTPase の核アイソフォームを特異的に分析することによりこの方法を説明するために用いられる。
Introduction
ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。最近の仕事では、この結合はまた、可逆的な翻訳後修飾として分類されており、タンパク質機能、位置および相互作用1、2の変調を可能にするシステインベースの「レドックススイッチ」として機能し、 3、4。したがって、この変更を研究することができることが重要です。これらのシステイン安定化多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元性 SDS − PAGE 分析5を介して行う。SDS − PAGE 分析は、多くの実験室で用いられる技術であり、その結果は、迅速かつ容易に、かつ最小限のコストで解釈することができ、質量分析などのジスルフィド結合を同定するために使用される他の技術よりも有利である。 、7及び円形二色性8.
この方法が研究に役立つ適切な技術であるかどうかを決定するための1つの重要なステップは、関心のあるタンパク質の一次配列を徹底的に調べて、システイン残基 (複数可) が存在することを保証することである。もう一つの有用なステップは、公開またはバイオインフォマティクスアプリケーションを使用して、システイン残基 (複数可) が位置することができる場所を視覚化するために、目的のタンパク質の三次元構造を探索するために、以前の結晶構造を研究することです。残渣 (複数可) が外面上に存在する場合は、構造体の内側に埋設されたシステイン残基ではなくジスルフィド結合を形成する方が良い候補であり得る。しかしながら、タンパク質は、基質相互作用またはタンパク質-蛋白質相互作用によって、これらの残留物が環境にも暴露されるようになると構造的な変化を起こす可能性があることに注意することが重要です。
同定された多量体複合体は、ホルムアルデヒドを使用して化学架橋で検証することができます。ホルムアルデヒドは、2-3 Åの高い細胞透過性および短い架橋スパンによるこの検証技術のための理想的なクロスリンカーであり、特定のタンパク質-蛋白質相互作用の検出を確実にする9,10。ここで、この方法は、ヒト骨骨肉腫細胞株 dUTPase OS11からの原発性の核アイソフォームを解析することにより図示される。しかし、このプロトコルは、他の細胞株、組織および生物に適合させることができる。
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Protocol
1. ヨードアセトアミドを使用して遊離システイン残基を遮断
- 6 cm2ディッシュの u-2 OS セルを 50% ~ 60% のコンフルエントで、10% のウシ胎児血清と 1% のピルビン酸ナトリウムを 5% co2 で37° c で含有する高グルコースを用いて成長させます。
- 使用する直前に 10 mM ヨードアセトアミドの新鮮なストックを作り、未使用の試薬を廃棄します。
- 0.1 mM 最終濃度ヨードアセトアミドを細胞培養培地に直接添加する。ゆっくりと室温で2分間皿をロックします。
2. 細胞の採取
- セルからメディアを吸引します。
- 5 mL の冷燐酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞を3回洗浄する。最後の PBS 洗浄溶液を吸引し、冷 PBS の1Ml を追加します。
- セルスクレーパーを使用して、皿の底から細胞をこすります。1つの mL のピペットを使用して PBS および細胞の懸濁液を引き、1.5 mL マイクロ遠心管にすべての液体を分配する。
- 4° c で3分間 7500 x gで細胞を回転させる。PBS を吸引し、細胞ペレットを後に残します。細胞のペレットは処理まで-80 ° c で貯えることができる
3. タンパク質の抽出
- DdH2O (材料の表を参照) で希釈した1x 溶解バッファーの100μ l を準備します。使用直前に phenylmethylsulfonyl フッ化物 (PMSF) を 1 mM 最終濃度に添加する。
- 1x 溶解バッファーの50μ l をセルペレットに直接追加し、サスペンドします。氷上で5分間インキュベートします。
- 超音波処理は、定数パルスモードを 40% で使用して8秒間 (sonicator の材料の表を参照; 異なる sonicators に必要に応じて調整します)、抽出を氷上に保ちます。
- 抽出物を4° c で5分間 16000 x gで回転させる。上清は可溶性タンパク質画分である。ブラッドフォード分析は、必要に応じてタンパク質濃度を決定するために行うことができます。
4. サンプル調製
- 10μ l の可溶性タンパク質抽出物をとり、1x Laemmli SDS-サンプルバッファー (4% SDS、20% グリセロール、0.004% ブロモフェノールブルー、および 0.125 M トリス-HCl、pH 6.8) の10μ l を加えます。還元試薬を添加しないでください。
- SDS ページ分析をその日に実行する場合は、ice のサンプルを保持します。長期保存の場合は、-20 ° c が適しています。ゲルを実行する前に、サンプルを85° c で5分間加熱します。
5. 生体内ホルムアルデヒドは、U-2 OS 細胞における内因性タンパク質の架橋
- 175 cm2フラスコ内の u-2 OS セルを 70% ~ 80% コンフルエントに成長させます (セクション1を参照)。
-
ホルムアルデヒド架橋反応を行う
- 発煙のフードでは、アリコートは商業源から購入した 37% のホルムアルデヒドの解決を提供する。ホルムアルデヒド固定液を培地に直接 1% の最終濃度に添加し、穏やかな攪拌で15分間室温でインキュベートします。
- 反応をクエンチするために、0.125 M の最終濃度に 1.25 M グリシンを追加し、5分間ロッカーの穏やかな攪拌で室温でインキュベートします。
- 5 mL のコールド PBS で細胞を3回洗浄する。最終的な PBS 洗浄溶液を吸引し、PBS の10ml を追加します。セルスクレーパーを使用して、フラスコの底部から細胞を削ります。
- 10の mL のピペットを使用して、PBS および細胞の懸濁液を引き、15の mL の円錐形の遠心管に液体のすべてを分配する。4° c で2分間 500 x gで細胞を回す。PBS を吸引し、細胞ペレットを後に残します。
6. 原子核の分別
- 10 mL の均質化バッファーを準備します: 0.25 M ショ糖、1 mM EDTA、10 mM HEPES、pH 7.4 で 0.5% BSA。使用直前に PMSF を加えて、1 mM の最終濃度にし、核懸濁液バッファーの 3mL (0.1% のトリトン X-100 PBS 中) にします。
- 5 mL の均質化バッファーを細胞ペレットに直接追加し、完全にサスペンドします。懸濁液を4° c で2分間 500 x gで遠心し、上清を捨てる。
- ペレットを 5 mL の均質化バッファーに懸濁させる。堅いガラステフロンのホモジナイザーを使用して、dounce は10の打撃/500 の rpm で細胞を均質にする。
- 懸濁液を4° c で10分間 1500 x gで遠心し、その上清を廃棄する。
注:10分間 1万 x gで centrifuging することによってミトコンドリアの単離のため上清を使用してください。 - ペレットを 1 mL の核懸濁液のバッファーに懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。
- 10分間 600 x gで遠心上清を捨てる。
- ペレットを 1 mL の核懸濁液バッファーに懸濁し、再度遠心分離する。上清を破棄します。最終的なペレットは、孤立した核となります。
7. タンパク質の抽出
- セクション4を繰り返し、その後懸濁させる1x 溶解緩衝液の25μ l を細胞ペレットに直接加えることを除いて。
8. サンプル調製
- 可溶性タンパク質抽出物を10μ l ずつ採取し、10μ l の 2x Laemmli SDS-サンプルバッファーと1μ l の 2-メルカプトエタノール (BME) を加えることによって、SDS-PAGE のサンプルを2つ用意します。
- 1つのサンプルを37° c で5分間加熱し、98° c で15分間2回目のサンプルを使用して、ホルムアルデヒド相互リンクを逆転させる。
9. SDS-ページ分析
- 1 L の1x トリス-グリシンランニングバッファ (25 mM トリス、192 mM グリシン、0.1%(w/v) SDS) を準備します。
-
SDS-ページ実行装置をセットアップします。
注:このプロトコルは 16% プレキャスト TGX SDS ページを使用します。注として、任意の割合のゲルを使用することができます。- メーカーのプロトコルごとに、ゲルが格納されているパッケージを開き、カセットを取り外します。
- ウェルを裏打ちしている櫛とカセットの底面からテープを取り外します。
- 実行中の装置にジェルを入れます。
- ウェルが液体に浸漬されるまで、1x 実行バッファをチャンバに充填します。プラスチック製の pipet を使用して、実行中のバッファでウェルをすすぎます。
- ゲルのサンプルを10μ l のスタンダードバリュー標準マーカーと共にロードしてください。
- 染料の前面がゲルの底部から約1cm になるまで 200 V でゲルを走らせる。
10. ウェスタンブロット
- 1 L の1x 転写バッファー (25 mM トリス、192 mM グリシン、20% メタノール) を用意し、使用まで4° c で保管してください。
- 慎重にゲルを取り出し、カセットを開けます。かみそりを使用して、積み重ねのゲルを注意深く切り、捨てる。1つのコーナーを使用してゲルをピックアップし、転送バッファとトレイにそれを配置し、5分間穏やかにロックすることができます。
- ゲルが揺れている間、(-20 ° c に保存されている) 氷ブロックを移送タンクに入れ、3/4 に完全に移動バッファを追加します。
- 100% メタノールに30秒間浸してフッ化物ビニリデン (PVDF) 膜を湿らせる。
- 5分が経過したら、転送バッファ付きトレイに転送を設定するための準備をします。移送バッファは、ブロットを完全に水没させるのに十分なものでなければなりません。ブロット転写を次のように設定します: 下部、カセットホルダーの底面 (黒)。その後、厚いスポンジ、余分な厚吸い取り紙、ポリアクリルアミドゲル、PVDF 膜、余分な厚吸い取り紙、厚いスポンジ。最後にカセットホルダーの上部 (白) を上にします。
- カセットをロックし、この装置を転写槽に入れ、PVDF メンブレンを正の陽極に向かって、ゲルを負の方向に向けます。転送バッファーが完全に水没するまで、転送バッファを使用してユニットの上面をオフにします。
- 攪拌プレートの上にユニットを置きます。単位に撹拌棒を加え、125の rpm で撹拌を始めなさい。
- 60 min で 100 V で実行してください。
- 転写が実行されている間、トゥイーン-20、pH 7.5 (TBST) で、トリス緩衝生理食塩水に溶解した 5% の粉ミルクの溶液を準備します。
- ユニットを解体し、どの側がゲルと接触していたかを指摘して、膜を除去します。残りの手順については、この側面がトレイに留まるようにしてください。
- トリス緩衝生理食塩水 (TBS) に2分間浸漬した後、5 mL の乳 TBST 溶液を5ml で室温にて30分間インキュベートすることによって膜を遮断する。
- 牛乳を 5% ミルク TBST 溶液の新鮮な 4 mL に交換し、適切な希釈で一次抗体を加え (この場合、私たちの希釈は dUTPase 抗体に対して 1: 2000)、4° c で穏やかにロッキングして一晩インキュベートします。
- 翌日、4° c ロッカーから室温ロッカーにブロットを除去し、一次抗体溶液を廃棄する。
- ブロットを完全に水没させるのに十分な液体を使用し、3回の洗浄、それぞれ5分間の TBST でゆっくりとロッキングします。
- 最後の洗浄に続いて、5% のミルク TBST 溶液の 5 mL を加え、その後、その後、廃棄する15分間ブロットをロックします。
- 所望の濃度で 5% 乳 TBST で希釈した二次抗体を添加する。(この場合、1: 5000 ヤギ抗ウサギの希釈 5% ミルク-TBST 溶液)
- 室温でインキュベートし、1時間揺動した後、溶液を廃棄します。
- TBST で3回のクイックウォッシュを行い、続いて3つの洗浄、5分ずつ、ゆっくりとロッキングし、最後の洗浄を破棄して、5 mL の TBS を加えます。
- ECL 化学発光検出液 (2 mL の最終容量に対して各試薬 1 mL) の1:1 混合物を調製し、これを1分間のブロットに直接添加します。
- ピンセットで膜を取り出し、研究室拭きで角を軽くし、余分な溶液を取り除きます。膜をシュリンクラップで置き、タンパク質側を x 線カセットに入れます。
- 膜を x 線フィルムにさらす。露光の時間は異なります。
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Representative Results
核 dUTPase は、各モノマータンパク質11の第3のアミノ酸に位置付けられた2つのシステイン残基の相互作用を通じて安定な二量体構成を形成する分子間ジスルフィド結合体を形成する。これは図 1a、Bに示されています。このジスルフィド結合が非還元環境における遊走異常による非特異的相互作用ではなかったことを確認するために、t は適切な制御を含めることが不可欠であった。注目すべきは、核 dUTPase はヒトに存在する4つのアイソフォームのうちの1つである。4つのアイソフォームのうち3つは、共通の触媒コア11,12を共有しながら固有のアミノ末端ドメインを有する。ウエスタンブロットに見られるように、収穫時のヒト細胞における dUTPase の単量体確認は、dUTPase の少なくとも3種のアイソフォーム (ミトコンドリアのアイソフォーム、核のアイソフォーム、および表記の切り捨てられたバージョン) の組み合わせであり、すべては、ポリクローナル抗体によって認識されます。核アイソフォームは、そのユニークなアミノ末端ドメインにシステイン残基を含む唯一のアイソフォームである。核アイソフォームはウェスタンブロットに見られるタンパク質の単量体状態のほんの一部でしかないため、そのアイソフォームのダイマー状態を実証するために長い間さらされていました。
ミトコンドリアのアイソフォームは、核アイソフォームに存在するシステイン残基を欠いており、この分子間ジスルフィドリンケージのコントロールとして使用された。図 1cに見られるように、その後にウェスタンブロット分析を行ったミトコンドリアの分離は、非還元条件下でこのアイソフォームがジスルフィド結合を形成せず、単量体タンパク質の予測分子量に移行したことを示した。
この複合体を確認するために、多量体複合体を形成することができ、ホルムアルデヒド架橋が行われた。孤立した核を 1% のホルムアルデヒド処理に供し、次いで、還元条件下で SDS − PAGE/ウェスタンブロット分析を変性した。図 2に示すように、ダイマー化が可視化されました。サンプルを15分間95° c でインキュベートすることによって架橋が逆転したとき、複合体は不安定化し、そのモノマー状態で可視化することができた。
図 1: 核 dUTPase タンパク質における分子間ジスルフィド結合形成の実証(A) 還元剤、β-メルカプトエタノール (BME) が存在しない場合の総細胞抽出物 (TCE) のウェスタンブロット分析は、黒によって示されるように、u-2 OS、Saos2、A549、および18CO の非同期集団における多量体の複雑な形成を示します。ボックス。(B) この複合体は、検査されたすべての4つの細胞株に BME を添加して消失し、ジスルフィド連鎖の存在を示す。(C) BME OS 細胞由来の TCE および精製されたミトコンドリア抽出物 (水戸) のウェスタンブロット分析は、-BME サンプルに多量体の複雑な形成を示さない。パネル A、B、および C の下のパネルは、10 s の X 線フィルムへの露出を示し、dUTPase の3つのアイソフォームの単量体状態を示します。A と B の上部パネルを1分間露出させ、C の上部パネルを2分間露出させた。等価量のタンパク質を各レーンに塗布した。ブロットは、dUTPase の保存されたカルボキシル基末端ドメインに対するポリクローナル特異的抗体でプローブしました。この図は、Rotoli et al.11から変更されており、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: ホルムアルデヒド dUTPase 核の架橋は多量体の複雑な形成を示す。U-2 の OS 細胞を 1% ホルムアルデヒドと共に15分間インキュベートし、その後、dUTPase (+ ホルムアルデヒド) の保存されたカルボキシル基ドメインに対して特異的なポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットで分析した。ホルムアルデヒド架橋を逆転させるために、核製剤から得られた抽出物を SDS − PAGE 緩衝液と混合し、次いで BME (+ ホルムアルデヒド、98° c の15分間) の存在下で15分間98° c に加熱した。調製物とともに見られる観察された不均一性 (すなわち nDut のダブレットバンド) については、そのまま説明するが、ホルムアルデヒド処理による異常な移行によるものであってもよい。下のパネルは X 線フィルムに10秒間露出され、上部パネルは X 線フィルムに2分間露出されます。この図は、Rotoli et al.11から変更されており、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで概説される方法は、ジスルフィド結合を介して安定化された多量体錯体の分析のためのストレートフォワードプロトコルを与える。このプロトコルは、他の細胞培養ライン、組織および生物に容易に適応することができ、広範囲の用途を可能にする。
この手順の重要なステップは、ジスルフィド結合が抽出手順の結果ではないことを確認することです。遊離システイン残基は、ヨードアセトアミド13を使用してブロックすることができます。このアルキル化剤は、それらのチオール基を介して結合されたシステイン残留物に連結し、新しいジスルフィド結合の形成を阻害する。しかし、ジスルフィド結合が治療時に存在する場合、この薬剤はそれを破壊しない。ヨードアセトアミドの最適化は、濃度と時間のバリエーションを使用して行うことができます。しかし、この試薬に曝露すると細胞死を引き起こすことになる。
役に立つかもしれないこのプロトコルへの追加ステップは、ホルムアルデヒド架橋の最適化です。ホルムアルデヒドの割合の変動は、架橋9,14の時間と同様に使用することができます。ホルムアルデヒドの割合と時間が増加するにつれて、非特異的な相互作用を形成する可能性もあることに注意することが重要です。多量体複合体の下流の確認も必要です。分子量および同一性を決定するのに有用な技術は、複合体が heteromultimeric である場合、質量分析法である。また、部位特異的変異誘発は、ジスルフィド結合を担うシステイン残基を決定するのに好適な技術であり得る。
最後に、非減らされた SDS ページの分析およびホルムアルデヒドの架橋の確認のこの2ステップ方法は技術的な容易さおよび低価格のために有益である。ジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を明らかにする第1段階とすることができる。
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Disclosures
著者らは、この原稿の内容と利益相反がないと宣言している。
Acknowledgments
私たちは、dUTPase ポリクローナル抗体の精製について、ジェニファー・フィッシャー博士が出した努力と、この原稿を編集するためのすべての努力をケリー Ciccaglione に感謝します。この研究は、部分的にニュージャージー健康財団 (グラント #PC 11-18) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
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