Summary
Este protocolo describe los procedimientos de optimización en un modelo de xenoinjerto tumoral doble etiquetado con fluorescencia doble basado en virus utilizando peces cebra larvales como huéspedes. Este modelo heterogéneo de xenoinjerto imita la composición tisular del microambiente del cáncer de páncreas in vivo y sirve como una herramienta más precisa para evaluar las respuestas de los medicamentos en modelos personalizados de xenoinjerto derivado del paciente de pez cebra.
Abstract
El xenoinjerto tumoral derivado del paciente (PDX) y el xenoinjerto tumoral derivado de células (CDX) son técnicas importantes para la evaluación preclínica, la orientación de medicamentos y las investigaciones básicas sobre el cáncer. Las generaciones de modelos PDX en ratones huésped tradicionales consumen mucho tiempo y solo funcionan para una pequeña proporción de muestras. Recientemente, el pez cebra PDX (zPDX) ha surgido como un sistema anfitrión único, con las características de pequeña escala y alta eficiencia. Aquí, describimos una metodología optimizada para generar un modelo de xenoinjerto tumoral con etiqueta de fluorescencia dual para la evaluación comparativa de quimioterapia en modelos zPDX. Las células tumorales y los fibroblastos se enriquecieron a partir de tejido de cáncer de páncreas recién cosechado o congelado en diferentes condiciones de cultivo. Ambos grupos celulares fueron etiquetados por lentivirus que expresan proteínas fluorescentes verdes o rojas, así como un gen antiapoptosis BCL2L1. Las células transtrinfectadas fueron premezcladas y co-inyectadas en el pez cebra larval de 2 dpf que luego fueron criados en medio E3 modificado a 32 oC. Los modelos de xenoinjerto fueron tratados por medicamentos de quimioterapia y/o inhibidores de BCL2L1, y las viabilidades de las células tumorales y fibroblastos se investigaron simultáneamente. En resumen, este protocolo permite a los investigadores generar rápidamente una gran cantidad de modelos zPDX con un microambiente tumoral heterogéneo y proporciona una ventana de observación más larga y una cuantificación más precisa en la evaluación de la eficiencia de los candidatos a fármacos.
Introduction
La oncología de precisión tiene como objetivo encontrar las estrategias terapéuticas más beneficiosas para el paciente individual1. Actualmente, se proponen numerosos modelos preclínicos como el cultivo primario in vitro, el cultivo organoide in vitro2y los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) en ratones antes o después del cultivo organoiderlo para el diagnóstico y para examinar/evaluar el potencial opciones terapéuticas3. El modelo PDX generado por la inyección de células cancerosas primarias humanas en ratones inmunes, es una de las herramientas más prometedoras para la detección personalizada de fármacos en oncología clínica3,4. A diferencia de la línea celular cultivada in vitro, los modelos PDX generalmente preservan la integridad y la heterogeneidad del entorno tumoral in vivo, imitando mejor la diversidad y las características idiosincrásicas de los diferentes pacientes tumorales, y por lo tanto, pueden predecir la resultado médico potencial de los pacientes4. Sin embargo, la generación de modelos PDX en ratones requiere muestras de pacientes de alta calidad y meses de tiempo para reunir suficientes células y modelos para experimentos multigrupo, y las composiciones celulares/genéticas del xenoinjerto pueden derivar de las del original biopsiadel paciente. La tasa de éxito para el establecimiento del modelo PDX de ratones también es baja, lo que dificulta su implementación amplia en la práctica clínica. Para los pacientes que llevan cánceres rápidamente progresados como el cáncer de páncreas, es posible que no puedan obtener información valiosa de los experimentos PDX a tiempo.
En los últimos años, se ha informado que el pez cebra es un huésped potencial no sólo para los modelos CDX (xenoinjerto tumoral derivado de células), sino también para los modelos PDX5,6,7,8,9, 10. Como animal modelo vertebrado, el pez cebra alberga suficientes similitudes con los mamíferos tantoen genética como en fisiología, con dos ventajas significativas: transparencia y tamaño 11 pequeño. El pez cebra también es altamente fecundidad, y cientos de larvas endogámicas se pueden obtener en pocos días de un solo par de adultos12. Varios estudios han empleado peces cebra para generar modelos transgénicos y xenoinjertos de enfermedades oncológicas13,14. En comparación con los xenoinjertos de ratones, los xenoinjertos de pez cebra permiten el seguimiento con una sola resolución celular. Una cierta cantidad de tejidos humanos es capaz de generar cientos de modelos PDX de pez cebra (zDRX), mientras que sólo puede ser suficiente para generar un par de ratones modelos PDX15,16. Además, las larvas de pez cebra a 2-5 dpf ya desarrollan sistemas circulatorios completos y órganos metabólicos como el hígado y el riñón, pero no el sistema inmune17,mientras que el saco de yema restante es un medio 3D natural, ideal para la detección de drogas, pruebas de resistencia y observaciones de migración tumoral6,18,19,20,21.
Con un último intento de utilizar zPDX como una plataforma de cribado/prueba para uso clínico, aquí, describimos una propuesta optimizada para el modelo zPDX de cáncer pancreático, que permite la evaluación de fármacos candidatos in vivo en poco tiempo utilizando menos células a costos más bajos. En comparación con las referencias anteriores sobre zPDX6,9,10, introdujimos varias optimizaciones para hacer el sistema más factible y confiable para el diagnóstico clínico personalizado: 1) pre-ordenar diferentes células grupos en los tejidos tumorales primarios y células primarias estabilizadoras durante una semana antes de más experimentos; 2) etiquetar las células humanas y mejorar la viabilidad celular en xenoinjerto a través de la modificación genética basada en lentivirus; 3) optimizar la condición de cultivo de peces cebra tanto en suplementos de nutrición (glucosa y glutamina) como en la temperatura; 4) cuantificar las respuestas de los fármacos de diferentes tipos de células de manera comparativa. También realizamos cambios en la solución de inyección añadiendo varios materiales suplementarios. En conjunto, estas mejoras ofrecen la posibilidad de generar rápidamente un xenoinjerto más paciente en los huéspedes de peces cebra que se puede utilizar como una herramienta confiable para evaluar la respuesta de los fármacos candidatos.
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Protocol
Todos los procedimientos animales fueron aprobados y siguieron las directrices del Comité de ética animal de la Universidad de Fudan y todos los especímenes de cáncer de páncreas se obtuvieron del Centro Oncológico de la Universidad Fudan de Shanghái. La aprobación ética se obtuvo del Comité de ética de la FUSCC, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente.
1. Preparación del equipo para la microinyección
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Preparación de la placa de inyección.
- Preparar una solución de 50 ml de agarosa al 1% disuelta en solución E3 (0,6 g/L de sal de acuario en agua destilada doble + 0,01 mg/L de azul de metileno). Hervir la solución hasta que la agarosa se disuelva.
- Vierta 50 ml de la solución de agarosa en una placa Petri de 10 cm y luego coloque el molde de fijación del embrión de pez cebra en la superficie. Retire el molde cuando la solución de agarosa se solidifique.
- Añadir 20 ml de solución E3 a la placa de inyección y mantenerla a 4 oC para un almacenamiento a largo plazo.
-
Preparación de las agujas de inyección.
- Tire de un capilar de vidrio de 10 cm con una dimensión interna de 0,9 mm en dos agujas en un tirador de agujas.
- Utilice fórceps para cortar el extremo de la aguja para crear una abertura bajo el microscopio.
2. Preparación de embriones para trasplante
- Coloque de 1 a 2 pares de peces cebra adultos en un tanque de apareamiento a las 7-9 pm y recoja los huevos fertilizados alrededor de las 8 de la mañana siguiente.
- Transfiera los huevos fertilizados del tanque de apareamiento a un plato de Petri que contenga 40 ml de solución fresca de E3 e incubar a 28,5 oC.
- Después de 8 h de incubación en e3 solución, añadir 0.03% 1-fenil-2-tiourea (PTU) en la solución E3 para inhibir la pigmentación. Incubar los embriones en solución E3 con 0,03% de PTU a 28,5 oC hasta 48 cv. Este paso se puede omitir si se utiliza peces cebra mutantes Casper criados.
3. Aislamiento y cultivo de células humanas primarias a partir de un espécimen de cáncer de páncreas quirúrgico fresco o tejido congelado
- Obtener muestras de tejido de cáncer de páncreas humano del tamaño alrededor de 1 cm3 durante una cirugía abdominal, y transferir inmediatamente el tejido a medios de crecimiento (DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS), 10 M Y-27632, 100 g/ml primocina, 10 g/ml putrescina dihidrocloruro, 10 mM de nicotinamida y 1% de penicilina estreptomicina).
- Transfiera la muestra de cáncer de páncreas a una placa de Petri y retire el tejido necrótico circundante, el tejido adiposo y el tejido conectivo.
- Enjuague el tejido canceroso 5-6 veces con tampón de fosfato (PBS) y corte el tejido en 1 mm3 piezas usando bisturíes.
- Transfiera los tejidos triturados a 5 ml de HBSS en un tubo de 50 ml y añada colagenasa tipo IV, hialuronidasa y DNase I a concentraciones finales de 200 unidades/ml, 100 mg/L y 20 mg/L, respectivamente. Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.
- Incubar la mezcla a 37 oC en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 15-20 min. Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo un par de veces cada 5 min.
- Añadir 7 ml de DMEM al tubo y centrifugar a 110 x g durante 5 min a 4 oC cuando se complete la digestión.
- Decantar el sobrenadante y volver a suspender la mezcla tumoral en DMEM.
- Placar la mezcla en una placa Petri de 6 cm en 3 ml de medios de crecimiento completo (DMEM con 10% FBS, insulina de 20 g/ml, 10 g/ml bFGF, 10 ng/mL EGF, 10 M Y-27632, 100 g/ml primocina, 10 g/mL putrescine dihidrocloruro, 10 mM de nicotina, 10 mM de nicotina, 10 mM de nicotina , 1% penicilina estreptomicina). Separe las celdas en dos grupos.
- En el grupo I, agregue 100x inhibidor de los fibroblastos del cáncer de páncreas en el medio después de 48 h para eliminar los fibroblastos crecidos, dejando las células cancerosas como los principales tipos de células;. En el grupo II, los fibroblastos superarán las células cancerosas dentro de una semana.
- Cultivo ambos grupos celulares durante 1-2 semanas dependiendo de las densidades/puridades celulares y cambiar los medios cada tres días. Los tipos de celda esperados en ambos grupos I & II pueden ocupar más del 98% en proporción en un experimento typic exitoso.
4. Etiquetado de las células con lentivirus expressando antiapoptosis génica BCL2L1 (BCL-XL) y diferentes proteínas fluorescentes por separado
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Producción de Lentivirus
- Placa 3 x 106 HEK 293T células con medio DMEM completo (DMEM suministrado con 10% FBS) en platos de 10 cm y cultivo durante la noche a 37 oC en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Sustituya el medio por 6 ml de medios libres de suero antes de la transfección.
- Preparar la solución A: 8 g de vectores lentivirales que contienen BCL2L1(pCDH-EF1-mKate2-E2A-BCL2L1-WPRE o pCDH-EF1-eGFP-E2A-BCL2L1-WPRE), 2,4 g de pVS, 4 g de pMDL (Gag/Pol), 1,6 g de pREV y DMEM libre de suero en un volumen total de 500 ol. la mezcla varias veces, y colocarla a temperatura ambiente durante 5 min.
- Preparar la solución B: 40 l de PEI (polietileimina) en DMEM libre de suero de 460 ml. Colóquelo a temperatura ambiente durante 5 min.
- Agregue lentamente la solución B en la solución A y deje el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Agregue la mezcla final en el plato de cultivo celular HEK 293T preparado en el paso 4.1.1 e incubar a 37 oC en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Después de 12 h, agregue 5 mL adicionales del medio DMEM completo. Después de 48 h, cosechar el medio que contiene el lentivirus.
- Filtrar el sobrenadante usando un filtro estéril de 0,45 m, añadir el sobrenadante en una columna de concentración, centrifugar a 6.000 x g durante 25-30 min a 4 oC. Las alícuotas de lentivirus de 100 ml por tubo se fabrican y almacenan a -80 oC.
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Infección de las células primarias
- Sembrar las células (grupo I y II) para ser infectadas en una placa de 12 pocillos con 30-40% de densidad y cultivar las células durante la noche a 37 oC en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.
- Sustituya el medio por un medio de 500 ml de medio libre de suero que contenga 8 g/ml de polibrino durante 4 h. A continuación, añada 100 l adicionales del lentivirus en el medio (eGFP-E2A-BCL2L1 para el Grupo I o mKate2-E2A-BCL2L1 para el Grupo II). Después de 12 h, reemplace el medio por 1 ml de medio completo.
- Compruebe los marcadores de fluorescencia después de 48 h.
- Cosecha las células infectadas y mézclalas enproporción 1:1 con una concentración final de 10 6/ml.
- Centrifugar las células a 110 x g durante 5 min y volver a suspender la mezcla celular en 50 ml de solución inyectable (1640 medios con 10% FBS, 0,05% de sal sódica de ácido hialurónico, 0,05% metilcelulosa).
5. Inyección de la suspensión de células mixtas en el pez cebra
- Añadir 10x solución de tricaína en agua E3 para anestesiar las larvas de pez cebra y transferir las larvas (del paso 2.3) a la placa de inyección llena por E3 modificado (E3 con 1 g/L de glucosa y 5 mmol/L L-glutamina).
- Llene 25 ml de suspensión de células mixtas en una aguja de micro capilares e inserte la aguja en el manipulador de microinyección.
- Ajuste la presión y el tiempo de inyección. Inyectar 50-80 células (8 nL) en el saco de yema de 48 hpf de pez cebra.
6. Cultivo del pez cebra xenoinjerado (modelo zPDX)
- Transfiera las larvas de pez cebra postxenoinjeradas a 40 ml de solución de mezcla (solución E3 con 1 g/L de glucosa y 5 mmol/L l glutamina) a 32 oC.
7. Administración de medicamentos sobre el pez cebra xenoinizado y la evaluación de las viabilidades de las células tumorales/fibroblastos
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Determinar la concentración óptima de gemcitabina/navitoclax.
- Coloque 10 embriones de pez cebra de tipo salvaje a 48 hpf en cada pocal de un plato de 12 pocillos.
- Añadir diferentes concentraciones de gemcitabina o navitoclax en cada pocal e incubar a 32oC durante dos días.
- Después de 2 días, calcular la dosis máxima de tolerancia (MTD) de gemcitabina y navitoclax en la que las larvas de pez cebra no muestran malformación significativa y comportamiento anormal, y las concentraciones de trabajo se establecen por debajo del MTD.
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Tratamiento de modelos zPDX con gemcitabina/navitoclax.
- Coloque 10 larvas xenoinjeradas en cada pocal de una placa de 12 pocillos.
- Divida las larvas en cuatro grupos, trate el grupo de control en E3 que contenga 0,1% DMSO y trate a los otros grupos con gemcitabina de 5 g/ml y/o navitoclax de 50 m, e incubar a 32 oC durante dos días.
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Evaluación de las viabilidades celulares y composición celular en modelos zPDX.
- Anestesitizar las larvas xenoinjeradas post-tratamiento y colocarlas en 3% metilcelulosa.
- Imagen de las larvas desde la vista lateral utilizando un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal.
- Cuantifique la intensidad de las señales de fluorescencia rojas y verdes utilizando el software ImageJ y GraphPad.
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Representative Results
En la Figura 1se representa un esquema del procedimiento. En resumen, las células del tejido del cáncer primario se sembraron en el medio completo después de la digestión con o sin la adición de inhibidores del fibroblasto del cáncer de páncreas. Las células cancerosas y los fibroblastos se enriquecieron como dos poblaciones distintas que los fibroblastos dominaron sin inhibidores, y el crecimiento de las células cancerosas prevaleció después de la adición de inhibidores (Figura2). Se construyeron dos vectores de envasado lentiviral, que expresaron proteínas fluorescentes verdes o rojas y BCL2L1 como se muestra en la Figura3. El etiquetado fluorescente basado en virus también representaba el estado de supervivencia de las células. Las células cancerosas mixtas y los fibroblastos se inyectaron en el saco de yema de pez cebra a 48 hpf y fueron tratados con gemcitabina y/o navitoclax durante dos días. Las viabilidades celulares en diferentes poblaciones y la composición celular del xenoinjerto se modificaron como las respuestas al tratamiento farmacológico (Figura4).
Figura 1: Diagrama esquemático de la generación y evaluación de fármacos del modelo de xenoinjerto de pez cebra derivado del cáncer de páncreas. Los tejidos extirpados quirúrgicamente de los pacientes con cáncer de páncreas se cortan y digieren, seguidos del cultivo en dos condiciones diferentes, una de las cuales se agrega mediante un inhibidor del fibroblasto, y el otro grupo no. Después de 1-2 semanas, las células primarias fueron modificadas genéticamente para expresar una proteína antiapoptótica BCL2L1 y diferentes proteínas fluorescentes. Después de eso, las dos poblaciones fueron mezcladas y co-inyectadas en larvas de pez cebra de 48 hpf para evaluar los efectos de los medicamentos quimioterápicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cultivo y enriquecimiento de células cancerosas pancreáticas y fibroblastos. Imágenes de células cancerosas y fibroblastos enriquecidos de tres pacientes de cáncer de páncreas diferentes después de 10 días de cultivo. Barra de escala, 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estructura del vector lentiviral que expresa BCL2L1 y diferentes proteínas fluorescentes. Diagrama esquemático de dos vectores lentivirales que expresan constantemente mKate2-E2A-BCL2L1 o eGFP-E2A-BCL2L1, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos sobre el xenoinjerto por gemcitabina. (A) Vista lateral del xenoinjerto en el saco de yema de las larvas de pez cebra a las 3 h después del trasplante (hpt). (B) Imágenes representativas de los xenoinjertos en larvas de pez cebra a 60 hpt, tratadas por DMSO o gemcitabina. (C) Representación 3D de los xenoinjertos a 60 cvt. (D) Estadísticas de la intensidad de fluorescencia del xenoinjerto antes y después del tratamiento con inhibidores de gemcitabina y/o BCL2L1. N 10 por grupo por cada ensayo. Barra de escala a 100 m; NS, no significativo; *P < 0.05; P < 0.0001; media- SD, con diferencias estadísticas determinadas por ANOVA unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Tanto los modelos PDX como CDX son plataformas vitales en el campo de la biología tumoral22,y el paso crítico de un trasplante entre especies exitoso es mejorar la supervivencia del xenoinjerto. Recientemente, algunos estudios han demostrado que la expresión transitoria de BCL2L1 (BCL-XL) o BCL2 puede mejorar significativamente la viabilidad de las células madre embrionarias humanas en los huéspedes de ratones sin afectar las identidades celulares y los destinos23 , 24 , 25. En nuestro manuscrito, etiquetamos las células con lentivirus expresando constantemente el gen de la antiapoptosis BCL2L1 (BCL-XL),así como las proteínas fluorescentes. La introducción de BCL2L1 mejoró en gran medida el tiempo de supervivencia de las células humanas de xenoinjerto en el pez cebra para prolongar la ventana de observación para los estudios, mientras que las señales fluorescentes no sólo etiquetan las células, sino que también informan de la condición de vida de la células, ya que encontramos que la fluorescencia se desvanece rápidamente con la muerte celular. Mientras tanto, actualmente estamos modificando el pez cebra como un mejor huésped para los xenoinjertos humanos. Por un lado, el rag2 y el prkdc están siendo noqueados a través de la tecnología CRISPR/Cas9 para preparar un pez cebra inmune deficiente combinado, que era similar a los ratones combinados con deficiencia inmune, para hacer que las larvas de pez cebra más antiguas también sean compatibles con células y tejidos humanos26. Por otro lado, el pez cebra también fue modificado para expresar proteínas humanas como IGF1 e INS para apoyar mejor la supervivencia y proliferación de células humanas implantadas mediante el uso de la tecnología transgénica mediada por transposón Tol2. Además, zPDX también carece de un sistema inmune funcional similar al humano, y las interacciones entre las células estromales humanas y el sistema inmunitario, y en el futuro, podemos intentar co-inyectar células inmunitarias humanas para reconstruir un ambiente inmune humanizado a corto plazo en el pez cebra.
En los modelos PDX de ratones, las condiciones de xenoinjerto fueron monitoreadas tradicionalmente por la observación directa en nodos de tamaño visible, que requieren mucho tiempo para desarrollarse. En los modelos zPDX transparentes como comparación, el xenoinjerto se puede investigar bajo microscopía en tiempo real. Sin embargo, era difícil evaluar las alternancias del número de células en una población de un solo color sin un control adecuado, y la idea de introducir dos poblaciones celulares de fluorescencia diferente mejora significativamente la cuantificación de la viabilidad celular. Al mezclar e inyectar diferentes células a proporciones fijas, no sólo imitamos el microambiente tumoral, sino que también somos capaces de cuantificar con precisión la respuesta del fármaco comparando los dos grupos celulares. Aunque la proporción original de células cancerosas a fibroblastos en los tejidos primarios es muy diferente, aquí comenzamos con la relación 1:1, y los efectos del tratamiento farmacológico en la misma composición celular de una proporción diferente se investigarán en el futuro. Además, los efectos de 32 oC en lugar de incubaciones de 37 oC en los comportamientos de las células humanas también requieren estudios comparativos detallados. Por último, la estrategia del modelo de xenoinjerto heterogéneo derivado del paciente para el cáncer de páncreas para la evaluación comparativa de fármacos también se puede aplicar a otros tipos de cánceres sólidos. Este enfoque es particularmente útil para PDX utilizando larvas de pez cebra como huéspedes, que son cristalinas y factibles para el análisis con resolución de una sola célula.
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Disclosures
No se revelaron posibles conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 81402582, Fundación de Ciencias Naturales de Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 y 18ZR1404500
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| Penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| Phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| Collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| Dnase I | Sigma | D5025 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| Pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| Gemcitabine | Gemzan | ||
| Methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
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