Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

برنامج التشريح الشامل للأفراد الذين يعانون من التصلب المتعدد

Published: July 19, 2019 doi: 10.3791/59511
Automatic Translation
*1, *1,3, *3, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Department of Neurosciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Biomedical Engineering, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 3Mellen Center for Treatment and Research in Multiple Sclerosis, Neurological Institute, Cleveland Clinic
* These authors contributed equally

Summary

التصلب المتعدد هو مرض التهابي مزيل للملينة بدون علاج. تحليل أنسجة الدماغ يوفر أدلة هامة لفهم مسببات المرض. هنا نناقش منهجية وتحليل المصب من أنسجة الدماغ MS التي تم جمعها من خلال برنامج تشريح سريع فريد من نوعه في العملية في كليفلاند كلينك.

Abstract

نحن نصف برنامج التبرع بالأنسجة السريعة للأفراد الذين يعانون من التصلب المتعدد (MS) الذي يتطلب العلماء والفنيين أن يكون تحت الطلب 24/7، 365 يوما في السنة. يوافق المشاركون على التبرع بالدماغ والحبل الشوكي. وأعقب معظم المرضى من قبل أطباء الأعصاب في كليفلاند كلينك ميلين مركز لعلاج مرض التصلب العصبي المتعدد والبحوث. وتتميز دوراتهم السريرية وإعاقاتهم العصبية بشكل جيد. بعد وقت قصير من الوفاة، يتم نقل الجسم إلى مركز التصوير MS، حيث يتم مسح الدماغ في الموقع بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي 3 T (MRI). ثم يتم نقل الجثة إلى غرفة التشريح، حيث يتم إزالة الدماغ والحبل الشوكي. وينقسم الدماغ إلى نصفين. يتم وضع نصف الكرة على الفور في مربع تقطيع وبديلة 1 سم سميكة شرائح إما ثابتة في 4٪ paraformaldehyde لمدة يومين أو المجمدة بسرعة في الجليد الجاف و 2-ميثيلبيوتان. يتم تخزين شرائح الدماغ قصيرة ثابتة في محلول الحفظ بالتبريد وتستخدم للتحليلات النسيجية والكشف المناعي الكيميائي للمستضدات الحساسة. يتم تخزين الشرائح المجمدة في -80 درجة مئوية وتستخدم لدراسات النطاق الجزيئية والمناعية والفيزيائية في الموقع/الحمض النووي الريبي. يتم وضع نصف الكرة الأخرى في 4٪ paraformaldehyde لعدة أشهر، وضعت في مربع التقطيع، وإعادة مسحها ضوئيا في الماسح الضوئي الرنين المغناطيسي 3 T (MR) وشرائح إلى شرائح سميكة سنتيمتر. يتم تسجيل صور MR في الموقع (MRIs) مع شرائح الدماغ 1 سم سميكة لتسهيل الارتباطات علم الأمراض التصوير بالرنين المغناطيسي. يتم تصوير جميع شرائح الدماغ ويتم تحديد آفات الدماغ المادة البيضاء. يتم قطع الحبل الشوكي إلى شرائح 2 سم. يتم إصلاح الأجزاء البديلة في 4٪ بارافورمالدهايد أو المجمدة بسرعة. يسمح الشراء السريع لأنسجة التصلب المتعدد بعد الوفاة بالتحليلات المرضية والجزيئية لأدمغة التصلب المتعدد والحبل الشوكي والارتباطات المرضية لتشوهات التصوير بالرنين المغناطيسي في الدماغ. نوعية هذه الأنسجة بعد الوفاة سريعة المعالجة (عادة في غضون 6 ساعة من الوفاة) ذات قيمة كبيرة لبحوث مرض التصلب العصبي المتعدد، وقد أسفرت عن العديد من الاكتشافات عالية التأثير.

Introduction

واحدة من أفضل الطرق لدراسة المرض هو فحص الأنسجة المريضة نفسها. وهذا يطرح تحديات لأولئك الذين يدرسون أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS). الخزعات من الدماغ المريض والحبل الشوكي نادرة للغاية وعادة ما تنطوي على حالات غير نمطية. وقد انخفضت معدلات تشريح الأفراد المصابين بأمراض الجهاز العصبي الوطني انخفاضاً كبيراً في السنوات الأخيرة، وعندما يتم ذلك، فإنها لا توفر في كثير من الأحيان شراء سريع للأنسجة. وقد أدت هذه التحديات إلى إنشاء بنوك الدماغ التي تركز على الأمراض، بما في ذلك العديد من التركيز على جمع الأنسجة من الأفراد الذين يعانون من التصلب المتعدد (MS). مرض التصلب العصبي المتعدد هو مرض التهابي بوساطة الجهاز العصبي الوطني الذي يدمر الملين، والخلايا القلة (خلايا تشكيل الملين)، والخلايا العصبية، والمحاور. غالبية مرضى التصلب المتعدد لديهم دورة مرض ثنائي المراحل التي تبدأ مع نوبات من الإعاقة العصبية مع الانتعاش المتغير الذي يتطور في نهاية المطاف إلى مرض تدريجي التدريجي الذي من المرجح أن تكون عصبية في الطبيعة1. بالنسبة لغالبية العقول MS المتبرع بها، فترات ما بعد الوفاة (PMI) بين الوفاة ومعالجة الأنسجة تتجاوز 24 ساعة. في حين أن هذه الأنسجة قد وفرت معلومات قيمة بشأن التغيرات المرضية في العقول مرض التصلب العصبي المتعدد، فهي ليست مناسبة للدراسات الجزيئية أكثر تقدما التي يمكن أن توفر رؤى قوية في الفيزيولوجيا المرضية المرض. وهذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة لدراسات توصيف الجينات، والتي تتطلب الحمض النووي الريبي سليمة.

للتغلب على القيود التي نوقشت أعلاه، قمنا بتطوير برنامج التبرع السريع للأنسجة الذي يسمح بالارتباط بالرنين المغناطيسي/المرضي. يوفر هذا البروتوكول أنسجة محفوظة بشكل جيد مناسبة للدراسات الجزيئية الحديثة ويسمح بإجراء مقارنة مباشرة بين أمراض الدماغ وتشوهات التصوير بالرنين المغناطيسي في عقول التصلب المتعدد. برنامج كليفلاند كلينك للتبرع بالأنسجة التصلب المتعدد موجود منذ أكثر من 20 عاماً. هذا البرنامج التبرع بالأنسجة السريعة يشتري العقول والحبل الشوكي من الأفراد الذين يعانون من مرض التصلب العصبي المتعدد وغيرها من الحالات العصبية المناعية الذاتية المرتبطة بها. يهدف البرنامج إلى الحصول على التصوير بالرنين المغناطيسي في الموقع في غضون 6 ساعة من الوفاة، تليها إزالة الدماغ والحبل الشوكي لمعالجة الأنسجة.

التوظيف
ويتم الحصول على التبرعات إما عن طريق الموافقة السابقة للتشريح التي يتم الحصول عليها مباشرة من المرضى (الموافقين مسبقاً) أو من أقرب الأقارب بعد الوفاة. يتم تحديد المرضى الذين تمت الموافقة عليهم مسبقًا عادة ً من السكان السريريين في مركز ميلين لعلاج التصلب المتعدد والبحوث في كليفلاند، أوهايو. على الرغم من أن الأفضلية في التوظيف في برنامج التبرع بالأنسجة السريعة تعطى للمرضى الذين تم اتباعهم في الدراسات البحثية الطولية، إلا أنها مفتوحة لجميع المرضى الذين ينظر إليهم في المركز. ويُعطى المشاركون الذين يلتحقون قبل الوفاة تعليمات لأفراد الأسرة أو مقدمي الرعاية بالاتصال بفريق البحث، إما وقت الوفاة أو عندما يُعتقد أن الوفاة وشيكة. الطريقة الثانية للأفراد للدخول في برنامج التبرع بالأنسجة هي في وقت الوفاة من خلال موافقة أقرب الأقارب. ولاية أوهايو يتطلب أن تحال الوفيات إلى منظمة شراء الأعضاء بتكليف اتحادي يدعى LifeBanc، والتي تعمل في 20 مقاطعة في شمال شرق أوهايو. LifeBanc بفحص جميع الوفيات لتشخيص مرض التصلب العصبي المتعدد، وهو استثناء للتبرع بالأعضاء. تم اتخاذ الترتيبات اللازمة لLifeBanc لإخطار المحققين من برنامج التبرع بالأنسجة MS لجميع الوفيات مع التشخيص المرتبط ة من مرض التصلب العصبي المتعدد التي تحدث داخل دائرة نصف قطرها 75 ميلا من كليفلاند كلينك. ثم يتم الاتصال بأقرب الأقارب وموظفي المستشفى من قبل موظفي برنامج التبرع بالأنسجة ويتم الحصول على الموافقة للتبرع بأنسجة الدماغ والحبل الشوكي. هذه الطريقتين للتجنيد قبل الوفاة وبعد الوفاة من خلال LifeBanc يؤدي إلى ما يقرب من 10-12 التبرع الدماغ سنويا. يتم إجراء تعديلات على الحد الأعلى لسن الوفاة لإدارة عدد الإحالات المستمدة من LifeBanc.

شراء التبرعات
يتطلب البرنامج تغطية 24 ساعة، 365 يوما في السنة من قبل أعضاء برنامج التبرع بالأنسجة لشراء الأنسجة. يتم استخدام نظام إعلام مركزي للتبرع بالأنسجة بالبريد الإلكتروني/جهاز النداء/الجهاز المحمول من قبل الفريق السريري الذي يغطي تبرعات الأنسجة. يتم توفير أرقام LifeBanc للاتصال بالموظفين تحت الطلب لبرنامج التبرع بالأنسجة. يتم إخطار الأعضاء بالوفاة من قبل مقدمي خدمات المستشفيات/أقرب الأقارب (الموافقة المسبقة) أو من قبل LifeBanc وغيرها من مصادر الإحالة. أولا، يتم تحديد وقت الوفاة وجدوى التبرع بالأنسجة. ثم يتم فحص الوفيات للحالات التي قد تؤدي إلى ضعف نوعية الأنسجة، بما في ذلك نقص الأكسجة قبل الوفاة لفترات طويلة، وأنسجة الدماغ المدمرة الضخمة (على سبيل المثال، نزيف داخل الجمجمة كبيرة، والسكتات الدماغية واسعة النطاق في نصف الكرة الغربي، ورم واسع النطاق العبء)، ودعم التهوية لفترات طويلة (>3 أيام)، والاستخدام المطول للعوامل vasoactive (>3 أيام) قبل الوفاة. عندما يشارك الطبيب الشرعي في الوفاة، يمكن لطبيب الأعصاب الدراسة التحدث مع الطبيب الشرعي لاستكشاف طريقة لتلقي الأنسجة في الوقت المناسب دون المساس بمسؤولية الطبيب الشرعي. إذا كان يشعر الأنسجة القابلة للحياة أن تكون موجودة، ثم يتم الحصول على موافقة خطية (إذا لم يتم الحصول عليها قبل الوفاة) ويتم التحضير لنقل الجسم. ثم يتم الاتصال بخدمة النقل المتهالكة التي تم التعاقد عليها من قبل لنقلها إلى مرافق التصوير بالرنين المغناطيسي في كليفلاند كلينك. يتم الحرص على التأكد من أن الجسم لا يزال في درجة حرارة الغرفة ولا يوضع في التبريد، كما ترتبط درجات حرارة الجسم المنخفضة مع التعديلات في خصائص إشارة التصوير بالرنين المغناطيسي.

التاريخ السريري
التاريخ السريري يتضمن تفاصيل عن تشخيص مرض التصلب العصبي المتعدد، بداية الأعراض، والعلاجات المستخدمة، ونتائج الاختبارات السريرية وشبه السريرية (الإمكانات التي أثيرت، ونتائج السائل الدماغي الشوكي، التصوير المقطعي التماسك البصري)، والتصلب المتعدد مركب وظيفي ، وتوسيع نطاق حالة الإعاقة (EDSS؛ الفعلي أو المقدر)، التي يتم جمعها من السجل الطبي (حيثما كان ذلك متاحا)، ومقابلة مباشرة من أقرب الأقارب. كما يتم جمع التصوير بالرنين المغناطيسي قبل الوفاة.

Protocol

وقد تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل مجلس كليفلاند كلينك للمراجعة المؤسسية ويتبع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية في كليفلاند كلينك.

1. التصوير بالرنين المغناطيسي في الموقع

  1. خذ الجسم المانح إلى جناح التصوير بالرنين المغناطيسي واجري بروتوكول تصوير بالرنين المغناطيسي بساعتين في مرفق التصوير MS. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي على 3 T أو 7 T الصور.
    ملاحظة: تعطى الأولوية ل3T حيث تم تنفيذ معظم البيانات القديمة على 3 T، ولكن عندما لا تكون متاحة، يتم إجراء التصوير مع 7T. يتم تنفيذ التسلسلات الأساسية المعينة لجميع الحالات (الجدول1)ويتم تنفيذ تسلسلات إضافية تعتمد على المصالح البحثية الحالية إذا سمح الوقت (مقيدة بتحقيق تثبيت الأنسجة أقل من 12 ساعة بعد الوفاة). ويصف الجدول 1 التسلسلات الأساسية.

2- تشريح الجثة

ملاحظة: بعد التصوير بالرنين المغناطيسي في الموقع، يتم نقل الجسم إلى المشرحة لاستخراج الدماغ والحبل الشوكي من قبل diener ومعالجة الأنسجة من قبل أعضاء المختبر.

  1. تنفيذ الخطوات التالية قبل وصول الجسم إلى المشرحة. قبل ساعتين، إعداد 3 L من 4٪ paraformaldehyde (PFA) وحاويات التسمية وأكياس لتخزين الأنسجة. إعداد 3 لتر من 8٪ PFA وتخفيف 1.5 لتر من 8٪ PFA إلى 4٪ PFA. ضع نسبة الـ 8% المتبقية من PFA في 4 درجة مئوية لليوم الثاني.
  2. قبل السفر إلى المشرحة، املأ مبردين متنقلين بسعة 50% بالثلج الجاف (كتل كبيرة مكسورة لتناسب وكريات صغيرة).
  3. في المشرحة، ملء حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ في منتصف الطريق مع 2-ميثيل بيوتان والجليد الجاف وتغطية مع غطاء استعدادا لتجميد المفاجئة الأنسجة.
  4. وزن وتصوير الدماغ مرة واحدة إزالتها من قبل diener.
  5. وضع أي دورا المرفقة في حاوية مليئة PFA.
  6. فصل المخيخ وجذع الدماغ من المخيّر وصورة المخيّل.
  7. تحديد الأعصاب البصرية، chiasm، والمسارات ومنفصلة باستخدام التحقيق وملاقط. استئصال الهيكل مع مشرط.
    ملاحظة: يتم وضع علامة على الجزء القاصي من جانب واحد من العصب البصري باستخدام حبر Higgins لتحديد الهوية.
  8. فصل نصف الكرة الدماغيطولا وتصوير كل نصف الكرة على حدة.
  9. قم بالحبر على القشرة الحركية الأولية (PMC) لنصف الكرة الأيسر، وأعاد تصويره، وضعه في حاوية سعة 3.3 لتر للتثبيت الطويل. توثيق وقت البدء لتثبيت الدماغ.
  10. ويمكن توقيع أو استئصال الـ PMC لنصف الكرة الأيمن.
    1. إذا تم استئصالها، أولا إزالة يغطي السحايا.
    2. إعادة تصوير PMC التي تم توقيعها أو اقتطاعها.
    3. إذا تم استئصال PMC، مقطعة إلى 6 أقسام متساوية الحجم.
    4. حبر الجانب rostral من كل قسم.
    5. ضع الأقسام ذات الأرقام الفردية في حاويات مملوءة بـ PFA للتثبيت القصير.
    6. قم بتجميد المقاطع ذات الأرقام الزوجية ووضعها في أكياس فريزر مغلقة في #1 أكثر برودة.
  11. قطع نصف الكرة الأيمن الأمامي إلى الخلفي إلى 1 سم سميكة أقسام الإكليل.
    1. توثيق التشوهات الجسيمة (على سبيل المثال، قطع القطع الأثرية، والنزيف، والآفات).
    2. ضع الأقسام ذات الأرقام الفردية في حاويات مليئة بـ PFA للتثبيت القصير.
    3. قم بتجميد المقاطع ذات الأرقام الزوجية ووضعها في أكياس فريزر مختومة.
    4. وثيقة نهاية وقت تثبيت الدماغ.
  12. فصل جذع الدماغ من المخيخ ووضعها في حاوية مليئة PFA لتثبيت قصيرة.
    1. نصف الكرة المخيخ منفصلة طوليا.
    2. قطع كل نصف الكرة الأرضية إلى 4 أقسام sagittal سميكة على قدم المساواة.
    3. صورة وسيطة ومناظر جانبية.
    4. ضع شرائح نصف الكرة الأرضية المخيخ اليسرى في حاوية مليئة PFA لتثبيت قصيرة.
    5. تُجمّد شرائح نصف الكرة الأرضية المخيخ اليمنى وتوضع في أكياس فريزر مغلقة في #1 أكثر برودة.
  13. الحصول على الحبل الشوكي مع جذور الأعصاب من diener.
    1. إزالة الحبل الشوكي دورا ماتر وتخزين دورا في وعاء مع PFA.
    2. منفصلة اليسار واليمين جذور الأعصاب الأمامية والخلفية. قطع جذور العصب الأمامي ة اليسرى والخلفية المقطوعة من الحبل الشوكي ونضعها في حاوية مملوءة بـ PFA للتثبيت القصير.
    3. قطع جذور العصب الأمامي والخلفي الأيمن من الحبل الشوكي، والمفاجئة تجميد، ووضعها في أكياس الفريزر مختومة، ومن ثم وضعها في #2 برودة.
    4. تصوير أكثر 20 سم من الحبل الشوكي. توثيق موقع التوسيع القطني.
    5. قطع 2 سم المقاطع العرضية من الحبل انطلاقا من caudal إلى rostral.
    6. حبر الجانب rostral من كل قسم قطع.
    7. ضع الأقسام ذات الأرقام الفردية في حاويات مليئة بـ PFA للتثبيت القصير.
    8. قم بتجميد المقاطع ذات الأرقام الزوجية، ووضعها في أكياس فريزر مختومة، ثم وضعها في #2 أكثر برودة.
    9. توثيق وقت البدء لتثبيت الحبل الشوكي وأي تشوهات جسيمة.
    10. تصوير الجزء الوردي المتبقي من الحبل الشوكي.
    11. توثيق موقف توسيع عنق الرحم. اتبع الخطوات 2.13.5-2.13.8 للحبل الشوكي المتبقي.
  14. بعد وضع المشرحة الأنسجة المجمدة في صناديق المسمى في -80 درجة مئوية المجمدات. تخزين الأنسجة الثابتة في 4 درجة مئوية.
  15. في 24 ساعة بعد تشريح الجثة (اليوم 2) تخفيف ما تبقى 8٪ PFA إلى 4٪.
  16. استبدال 4٪ PFA في حاويات التثبيت مع المخففة حديثا 4٪ PFA.
  17. في 60 ح بعد تشريح الجثة إعداد حلول من 2.5٪ الجلوتالارهايد في 4٪ PFA من الجلوتالارهايد، PFA، DH2O وسورينسون العازلة (التي أعدت عن طريق الخلط في تسلسل: 0.2 M الفوسفات العازلة الحموضة 7.4، بولي فينيل بيروليدون 1٪ ث / الخامس، السكروز 30٪ ث / الخامس، وجلايكول الإيثيلين 30٪ v / v).
  18. إزالة PFA المستخدمة 4٪ من حاويات التثبيت القصير.
  19. شطف الأنسجة في العازلة سورنسون ووضعها في حل الحماية من التبريد (الجلسرين 20٪، 0.4 M سورنسون العازلة 20٪، و 0.02٪ أزيد الصوديوم في dH2O).
  20. صورة قصيرة ثابتة شرائح الدماغ، المخيخ، جذع الدماغ والقشرة الحركية (إن وجدت).
  21. مع شفرة مشرط قطع 2 مم المقاطع عرضية سميكة من كل 2 سم قصيرة ثابتة قسم الحبل الشوكي.
  22. وضع أقسام في 2 مل قارورة التلألؤ وملء مع حل من 2.5٪ الجلوتالارهايد في 4٪ PFA.
  23. إرجاع القسم المتبقي إلى قارورة التلألؤ الأصلي 20 مل. شطف القسم مع العازلة سورنسون واستبدالها مع حل الحماية من التبريد.

3. علم الأمراض

ملاحظة: يتم قطع الشرائح القصيرة الثابتة في نصف الكرة الأيمن وكذلك نصف الكرة الأيسر الثابت منذ فترة طويلة (الموضوعة في 4% PFA لعدة أشهر) إلى أقسام تبلغ 30 ميكرومتر (يشار إليها باسم الطفو الحر) أو مُدمجة في البارافين ومقطعة على أنها مقاطع 12-14 ميكرومتر (يشار إليها باسم البارافين جزءا لا يتجزأ من). تتم معالجة هذه الأقسام عادة مع بروتين بروتيوليبيد (PLP) للكشف عن الآفات demyelinating ومجمع التوافق النسيجي الرئيسي الثاني (MHC-II) للنشاط المناعي باستخدام طريقة diaminobenzidine (DAB). وقد تم توحيد هذه البروتوكولات واستخدامهافي العديد من المنشورات2و3و4و5و6و7و8و9 , 10 سنوات , 11 , 12.

  1. الحرة العائمة (30 درجة) DAB-Avidin-البيوتين مجمع (ABC) تلطيخ الأنسجة
    1. إزالة أقسام من محلول التخزين بالتبريد، ونقل المقاطع إلى لوحة ستة آبار، وغسلها 3X لمدة 5 دقائق كل في 2 مل من 1X الفوسفات المخزنة المالحة الحموضة 7.0 (PBS). عند نقل إلى البئر التالي في لوحة ستة جيدا استخدام الرعاية لا لتمزيق الأنسجة. خلال كل خطوة غسل وحضانة، وضع لوحة ستة جيدا على شاكر والسماح للأنسجة ليهز بلطف.
      ملاحظة: أقسام الأنسجة الحاضنة في أحجام أصغر وفي لوحات أكبر (أي 12- و 24-جيدا لوحات) تميل إلى عرض السطح وحافة تمزيق.
    2. إجراء استرجاع مستضد بواسطة أقسام microwaving في كوب زجاجي يحتوي على ما يقرب من 30 مل من 10 mM citrate العازلة (درجة الحموضة 6.0). تأكد من عدم طي الأنسجة عن طريق التلاعب بفرشاة الطلاء وأقسام الميكروويف لمدة 2-3 دقائق أو حتى يبدأ المخزن المؤقت للسيترات في الغليان. السماح للأقسام لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة (~ 20 دقيقة).
    3. نقل أقسام العودة إلى لوحة ستة جيدا وغسل أقسام 3X لمدة 5 دقائق لكل منهما في 2 مل من PBS / 0.3٪ تريتون X-100. كتلة بيروكسيداسيس الذاتية عن طريق أقسام الحضانة في 2 مل من 3٪ H2O2/0.3٪ تريتون X-100/PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. غسل أقسام 3X لمدة 5 دقائق لكل في 2 مل من PBS / 0.3٪ تريتون X-100. كتل أقسام في 2 مل من 3٪ مصل الماعز العادي / 0.3٪ تريتون X-100/1X PBS لمدة 1 ساعة في RT.
    5. حضانة أقسام بين عشية وضحاها إلى 5 أيام (اعتمادا على الأجسام المضادة) في الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد microglia وepitopes الملين للكشف عن التهاب (MHCII) وdemyelination (PLP) (انظر جدولالمواد) في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تأكد من عدم طي الأقسام عند الحضانة في هذه الخطوة أو الخطوات اللاحقة لأن هذا سيؤدي إلى مناطق داخل الأقسام تكون خالية من وصمة عار.
    6. غسل أقسام 3X لمدة 5 دقائق لكل في 2 مل من 1X PBS. ثم احتضان المقاطع في الأجسام المضادة biotinylated الثانوية (انظر جدولالمواد) لمدة 1 ساعة في RT. إعداد أفيدين البيوتين مجمع (ABC) الحل خلال الحضانة ما يقرب من 45 دقيقة قبل الخطوة غسل المقبل للسماح مجمعات ABC لتشكيل.
    7. غسل أقسام 3X لمدة 5 دقائق لكل في 2 مل من 1X PBS. ثم احتضان الأقسام في ABC لمدة 1 ساعة في RT.
    8. غسل المقاطع في 2 مل من 1X PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. أقسام الحضانة في DAB المصفاة (2 مل / بئر / قسم) تحتوي على H2O2 (1:500 تخفيف 30٪ H2O2 في DAB) حتى يتطور اللون بشكل كاف (~ 3-8 دقيقة).
    9. غسل أقسام 3X لمدة 5 دقائق لكل في 2 مل من 1X PBS. لتعزيز الإشارة (اختياري)، قم بالتشغيل باستخدام OsO4 بنسبة 0.04% (~30 s).
    10. غسل أقسام ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل في 1X PBS. بشكل فردي، نقل كل قسم من لوحة ستة آبار إلى حاوية صغيرة كاملة من 1X PBS ووضع قسم الأنسجة على شريحة زجاجية مسطحة قدر الإمكان.
    11. رفع بلطف الشريحة من PBS مع ضمان قسم الأنسجة مسطحة قدر الإمكان. باستخدام اثنين من فرش الطلاء، تسطيح بلطف وتمتد الأنسجة على الشريحة والدب بعيدا المياه الزائدة مع منشفة ورقية. جبل أقسام الأنسجة مع الجلسرين (أو ما يعادلها تصاعد وسائل الإعلام) وختم غطاء مع طلاء الأظافر واضحة.

4. البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام نصف الكرة الأرضية: DAB تلطيخ

  1. يُذوّب البارافين من الشرائح في فرن بزاوية 60 درجة مئوية لمدّة 5-10 دقائق.
  2. إزالة البارافيين أقسام عن طريق احتضان في إكسيلين 3X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  3. إعادة ترطيب الأنسجة في الإيثانول متدرج في 100٪ (2X لمدة 5 دقائق لكل منهما)، 95٪ (2X لمدة 5 دقائق)، 70٪ (2X لمدة 5 دقائق لكل منهما)، و 50٪ (1X لمدة 5 دقائق لكل منهما). تغطية الشرائح في PBS.
  4. مستضد استرداد بواسطة الشرائح microwaving في كوب من 10 mM citrate المخزن المؤقت (درجة الحموضة 6.0).
  5. اغسل الشرائح في 1x PBS (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما) مرة واحدة تبريد إلى درجة حرارة الغرفة. كتلة بيروكسيداسيس الذاتية عن طريق احتضان الأنسجة في 3٪ H2O2/1٪ تريتون-X 100/PBS لمدة 30 دقيقة.
  6. غسل الأنسجة في 1X PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. كتلة الأنسجة مع 6٪ مصل الماعز العادي في PBS لمدة 1 ساعة.
  7. أقسام الحضانة في الأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد) في PBS في درجة حرارة الغرفة (RT) بين عشية وضحاها (بحد أقصى 20 ساعة).
  8. غسل أقسام 3X لمدة 5 دقائق كل في 1X PBS. ثم احتضان المقاطع في الأجسام المضادة الثانوية المقابلة (انظر جدولالمواد) في PBS لمدة 1 ساعة في RT.
  9. إعداد ABC الحل ما يقرب من 45 دقيقة قبل خطوة الغسيل المقبل أثناء الحضانة.
  10. غسل أقسام 3X لمدة 5 دقائق كل في 1X PBS ومن ثم حضانة في ABC لمدة 1 ساعة في RT.
  11. غسل القسم 3X لمدة 5 دقائق كل في 1X PBS.
  12. أقسام الحضانة في تصفية (0.45 ميكرومتر حجم المسام فلتر) DAB تحتوي على H2O2 (1:500 تخفيف 30٪ H2O2 في DAB) حتى يتطور اللون بشكل كاف (~ 3-8 دقيقة).
  13. غسل المقاطع (3X 5 دقيقة) في 1X PBS. لتعزيز الإشارة، osmicate باستخدام 0.04٪ أوستروكسيد أوزميوم (OsO4; تقريبا 30 s).
  14. غسل المقاطع (3X 5min) في 1X PBS.
  15. تجفيف الأنسجة في سلسلة متدرجة من الإيثانول 50٪ (1X 5min)، 70٪ (1X 5min)، 95٪ (2X 5min)، 100٪ (2X 5 دقيقة)، و 100٪ إكسيلين (1X 5min). السماح للإكسيلين تتبخر.
  16. قم بتركيب مقاطع مزودة بوسائط تركيب سريعة سريعة تعتمد على التولوين. يوصى بتركيبات تحتوي على مضادات الأكسدة لمنع تبييض البقع. قم بإزالة وسائط التركيب الزائدة من حواف الشرائح باستخدام ماكينة حلاقة للتخزين اللاحق.

5. العلاقات بالرنين المغناطيسي / علم الأمراض الارتباطات

ملاحظة: للربط التصوير بالرنين المغناطيسي مع علم الأمراض، ونحن أولا إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي السابق من نصف الكرة الدماغ سليمة ثابتة منذ فترة طويلة (الخطوة 2.9 أعلاه) في مربع قابل للتعديل مع علامات التصوير بالرنين المغناطيسي مرئية تشير إلى فتحات التقطيع. ثم نقوم بتقطيع الدماغ وتصوير شرائح 1 سم لتمكين التسجيل المشترك للتصوير بالرنين المغناطيسي في الموقع إلى شرائح الدماغ الفردية. يمكننا بعد ذلك إجراء تحليلات موجهة بالتصوير بالرنين المغناطيسي، حيث يتم تحديد المناطق ذات الأهمية (ROIs) على التصوير بالرنين المغناطيسي لتوجيه تحليل الأنسجة. يمكننا أيضًا إجراء التحليلات الموجهة إلى علم أمراض الأنسجة، حيث يتم تحديد ROIs على الأنسجة (على سبيل المثال، آفات المادة البيضاء، المادةالبيضاء دون إزالة التمن، وما إلى ذلك) ومن ثم تتميز بتدابير التصوير بالرنين المغناطيسي المترجمة (الجدول 1).

  1. تحديد ROIs المستندة إلى التصوير بالرنين المغناطيسي
    ملاحظة:     في الدراسات السابقة، حددنا ROIs في المادة البيضاء11،12،13،14،15 والرمادي المادة16،17، 18- والمثال الوارد أدناه هو تحليل المادة البيضاء.
    1. الآفات Hyperintense T2 الجزء على التصوير بالرنين المغناطيسي في الموقع (من الخطوة 1.1)، معالجتها في البداية بواسطة خوارزمية تلقائية، ومن ثم تصحيحها يدوياً من قبل المستخدمين ذوي الخبرة.
    2. الجزء T1 الآفات نقص الكثافة داخل الآفات T2 كما voxels مع كثافة إشارة أقل من أو يساوي 80٪ من شدة إشارة من أنسجة الدماغ المحيطة الطبيعية التي تظهر.
    3. خرائط نسبة نقل المغناطيسية (MTR) مع عتبة 80٪.
    4. إنشاء ثلاثة تصنيفات باستخدام الشرائح المذكورة أعلاه: (أ) الآفات T2 فقط التي هي غير طبيعية على T2 المرجحة / الفلور المسح الضوئي ولكن طبيعية على T1 المرجحة أو التصوير بالرنين المغناطيسي، (ب) T2T1MTR الآفات، والتي هي غير طبيعية على جميع T2 المرجحة / الذوق، T1 المرجحة، وMTR المسح؛ و (ج) المادة البيضاء العادية الظهور (NAWM)، والتي هي طبيعية على جميع T2 المرجحة / FLAIR، T1 المرجحة، وMTR المسح الضوئي.
      ملاحظة: تعتمد مجموعة الشرائح الخاصة بنا على وجود جميع أنواع المناطق الثلاث ذات الاهتمام (T2-only وT2T1MTR وNAWM) على نفس الشرائح.
    5. حساب الكثافات الطبيعية لكل عائد استثمار لتقليل التباين الناجم عن العقول المختلفة ومواقع الدماغ المختلفة.
  2. التسجيل المشترك للتصوير بالرنين المغناطيسي في الموقع لشرائح الدماغ
    1. مسح نصف الكرة الدماغ الثابتة في مربع تشريح مخصص مع أربعة صفوف من علامات حساسة التصوير بالرنين المغناطيسي توطين فتحات حيث يمكن إدراج سكين لشريحة الدماغ. قم بإجراء عملية استحواذ على MPRAGE ثلاثية الجوانب ذات وزن T1 مع دقة متساوية الوزن مقاس 1 مم تغطي الدماغ الثابت وجميع العلامات.
      ملاحظة: ويسمى هذا التصوير بالرنين المغناطيسي بعد التثبيت ويستخدم فقط كخطوة وسيطة للتسجيل المشترك للتصوير بالرنين المغناطيسي في الموقع إلى شرائح الدماغ.
    2. مباشرة بعد المسح الضوئي، شريحة نصف الكرة الدماغ في فتحات تقع 1 سم بعيدا، مما أدى إلى ما يقرب من 15 شرائح.
    3. تصوير شرائح الدماغ على كلا الجانبين الأمامي والخلفي.
    4. شارك في تسجيل التصوير بالرنين المغناطيسي في الموقع والصور الفوتوغرافية لشرائح الدماغ مع الخطوات التالية.
      1. لتقسيم ما بعد التثبيت وفي الموقع MPRAGE، قبل العملية على حد سواء بعد التثبيت وفي الموقع MPRAGE MRIs لكثافة غير التوحيد19.
        1. تقسيم الدماغ وأربعة صفوف من علامات من MPRAGE ما بعد المعالجة مسبقا.
        2. الجزء نصف الكرة المقابلة للتصوير بالرنين المغناطيسي بعد التثبيت20،21 من MPRAGE المجهزة مسبقا في الموقع.
      2. الاشتراك في تسجيل الدماغ المستخرجة في الموقع وما بعد التثبيت التصوير بالرنين المغناطيسي من خلال سلسلة من عمليات التسجيل الخطي تصل إلى 12 درجة من الحرية (تسجيل affine) باستخدام FSL FLIRT22. مكونات التحجيم والقص حساب تأثير انكماش التثبيت.
      3. ابحث عن الاتجاه الطبيعي للمستوى التقطيع عن طريق تقليل مجموع الكثافات القصوى المتوقعة باستخدام العلامات المجزأة. وتدرج زوايا إعادة التوجيه هذه في مصفوفة التحويل التي تم الحصول عليها من الخطوة السابقة.
      4. تطابق صور التصوير بالرنين المغناطيسي بصريا ً مع صور شرائح الدماغ الخلفية الثابتة باستخدام عارض صور داخلي يسمح بتغيير عمق واتجاه المتجهات العادية. هناك حاجة إلى تعديلات صغيرة لأن تشريح الدماغ غير كامل.
      5. تطبيق AFFINE تحويل الصورة13 لكل شريحة لتحويل التصوير بالرنين المغناطيسي في الموقع إلى نفس مواقع التقطيع مثل الصور من شرائح الدماغ.

Representative Results

كما ذكر أعلاه، يتم تجميد ما يقرب من نصف نصف الكرة الدماغية والمتاحة للدراسات الجزيئية باستخدام الحمض النووي، RNA، أو البروتين. تاريخيا، وقد تبين أن الدراسات التي تستخدم أنسجة الدماغ بعد الوفاة تتأثر بظروف ما قبل الوفاة، والعمر، والجنس، ودرجة الحموضة في الأنسجة، وسلامة الحمض النووي الريبي (RIN)، والفاصل الزمني بعد الوفاة (PMI)، واليقين التشخيصي، واستخدام المواد الرضوضة، والعلاج السابق للأدوية الحالة23. استناداً إلى الدراسات التي تستخدم أنسجة الدماغ, الحمض النووي والبروتين ويبدو أن تتأثر بمدى أقل بالمقارنة مع الحمض النووي الريبي. واستناداً إلى تجربتنا، فقد تبين أن عزل الحمض النووي الريبي وتحليل المصب هو الأكثر تأثراً بظروف ما قبل الوفاة والفاصل الزمني بعد الوفاة لأنسجة الدماغ. لذلك نناقش بعض الشروط التي يجب اتباعها لإجراء تحليل يستند إلى الحمض النووي الريبي باستخدام أنسجة MS بعد الوفاة.

لجميع دراساتنا، بعد أن يتم جمع الدماغ في تشريح الجثة، يتم تقطيعه (1 سم سميكة) ومن ثم إما ثابتة في 4٪ paraformaldehyde للدراسات المورفولوجية أو المجمدة بسرعة للتحليل البيوكيميائي. تتميز جميع كتل الأنسجة لإزالة التميّز عن طريق تلطيخ المناعة باستخدام PLP كما هو موضح أعلاه. ويرد مخطط تحليل تمثيلي في الشكل 1. يتم فحص أقسام الأنسجة لوجود آفات المادة البيضاء (الشكل1A). مناطق مختارة ملطخة للنشاط المناعي (الشكل1B)وإزالة المليون (الشكل1C). يتم تركيب الأنسجة المجمدة على cryostat (الشكل1D)ويتم قطع أقسام 30 ميكرومتر المجمدة. ويلي ذلك جمع 3-4 أقسام لاحقة، وفصل عن الأنسجة المجاورة، وتخزين الحمض النووي، RNA، أو عزل البروتين. باستخدام هذا البروتوكول، لقد عزلنا بنجاح الحمض النووي24،25،RNA5،6،7،8،9 وكذلك البروتينات26. في حين أن النتائج الرئيسية من بعض الدراسات تحليل الحمض النووي الريبي من العقول MS تناقش، وهنا بعض القضايا المتعلقة بتحليل الحمض النووي الريبي العقول MS بعد الوفاة.

Figure 1
الشكل 1: جمع العينات لتحليل الحمض اتّلاف الحمض النووي الريبي. (أ) يتم اختيار أنسجة التشريح للتحليل. يتم اختيار مناطق الأنسجة ويتم استئصال جزء من الأنسجة. جميع الأقسام ملطخة(B) MHC-II (مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) الفئة الثانية HLA-DR CR3/43) الأجسام المضادة للكشف عن النشاط الالتهابي ومع (C) بروتين بروتيفوليبيد (PLP) لتحديد حالة الملين باستخدام البروتوكولات المنشورة. على أساس حالة الملين، يتم تسجيل كتلة منقبل مشرط (D). يتم قطع المقاطع (60درجة مئوية) (E) ويتم إزالة المناطق التي تم تسجيلها من قبل، وفصلها في أنابيب، ووصفت (F). تتكرر بقع PLP وMHC-II بعد كل 5 أقسام لضمان جمع مناسب من الأنسجة. تتم الإشارة إلى المادة البيضاء العادية (NAWM) ويتم تحديد آفات المادة البيضاء (WML) باللون الأحمر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

استئصال أكسونال في آفات مرض التصلب العصبي المتعدد10. وكان التركيز العلمي الأولي لهذا البرنامج على توصيف المكونات الخلوية للآفات البيضاء demyelinated. وكان من بين المستضدات المترجمة خيوط عصبية غير فوسفورية (NFs). معظم عوامل التراكم اتّزفيفيت في المحاور المُلّية. عند إزالة الإذاية، يتم إزالة الفسفوريات. اكتشفنا التعبير المتوقع عن الـ NFs غير الفوسفورية في المحاور المنهية. في الآفات الحادة MS، انتهى العديد من هذه المحاور demyelinated كما المصابيح التراجع axonal (الشكل2A)،والتي تعكس نهايات القريبة من المحاور المنقولة. وتتجاوز المحاور المقطعة 11000 مم3 في الآفات الحادة مقارنة بالمناطق الطبيعية المجاورة10. ساعدت هذه الملاحظات على تحفيز نقل النموذج في أبحاث مرض التصلب العصبي المتعدد التي حركت المجال نحو وصف التنكب العصبي بأنه السبب الرئيسي للإعاقة العصبية الدائمة في الأفراد الذين يعانون من مرض التصلب العصبي المتعدد.

Figure 2
الشكل 2: تشريح أكسونال أثناء إزالة التميّز الالتهابي. يحدث تشريح أكسونال أثناء إزالة النشوان الالتهابي(A، رؤوس الأسهم) ويحفز على تشكيل الفراغات المحاور الطرفية (A ، الأسهم). عندما كميا (B) ، والمحاور المقطعة وفيرة في آفات مرض التصلب العصبي المتعدد ويبدو أنها ترتبط مع النشاط الالتهابي للآفة. الفريق ألف مستنسخ من تراب وآخرون10 بإذن. الأحمر: بروتين بروتيفوليبيد، أخضر: خيوط عصبية مضادة للفسفورية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التَحَمَلفي العقولالمزمنة MS 3 . يمكن أن تكون إزالة التنامع قوية خلال المراحل المبكرة من مرض التصلب العصبي المتعدد. العديد من الآفات المزمنة MS، ومع ذلك، ليست remyelinated. لقد قمنا بالتحقيق فيما إذا كان وجود خلايا ذرية oligodendrocyte (OPCs) أو توليد خلايا أوليغودندريات جديدة يحد من استئصال آفات المادة البيضاء التي تعاني من التحلل المزمن. في حين انخفضت كثافة OPC في كثير من الأحيان، كانت موجودة في جميع الآفات المزمنة demyelinated3. كما كانت الخلايا القلة التي تم إنشاؤها حديثا موجودة في العديد من الآفات المزمنة MS. عمليات Oligodendrocyte المرتبطة، ولكن لم myelinate demyelinated محاور (الشكل3). وتشير هذه الدراسات إلى أن OPCs وقدرتها على إنتاج خلايا أوليغودندريليستات جديدة لا تحد من استئصال الآفات المزمنة في المادة البيضاء. افترضنا أن المحاور المزمنة المنعدمة، والتي غالبا ً ما تبدو عسر التغذية، لم تكن متقبلة للتَحَمَل من قِبل خلايا القلة المنتجة حديثاً.

Figure 3
الشكل 3: عمليات الخلايا القلة قبل التملّف المرتبطة بالمحاور. تظهر الميكروغرافيا البؤرية لآفات التصلب المتعدد الملطخة بالأجسام المضادة لـ PLP (الأحمر في الألواح A، B) والأجسام المضادة للخيوط العصبية (الأخضر في الألواح A ، B). قامت الخلايا القلة قبل التملّف (الحمراء في اللوحة A) في المنطقة التحتية (SVZ) بتوسيع العمليات في منطقة المحاور المنزوعة اللميلية (الخضراء في اللوحة A) في آفة مرض التصلب العصبي المتعدد المزمنة. وقد تصاعدالعديد من هذه العمليات (الأسهم في الفريق ألف) حول المحاور، كما هو مبين في التكبير الأعلى (اللوحة باء). تمثل أشرطة المقياس 20 ميكرومتر (A) و5 ميكرومتر (B). مستنسخة من تشانغ وآخرون3 بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخلل الميتوكوندريا في مرض التصلب العصبي المتعدد6. قمنا ببحث غير متحيز عن التغيرات الجينية العصبية في القشرة الحركية المجمدة بسرعة التي تم الحصول عليها من مرضى التصلب المتعدد المزمن (الشكل4A). وقد حدد بحث غير متحيز لمجموعة البيانات هذه تخفيضات كبيرة في 23 من الميتوكوندريا المرمزة نووياً في التصلب المتعدد (الشكل4باء). وأشارت الدراسات المعتمدة باستخدام الكيمياء المناعية والتهجين في الموقع إلى أن هذه الجينات كانت غنية للغاية في الخلايا العصبية الإسقاط القشرية (الشكل4C)وأن الميتوكوندريا معزولة عن محاور الإسقاط عرض انخفاض تحلل السكر ( الشكل 4دال). حفزت هذه الورقة التركيز على خلل الميتوكوندريا وخفض إنتاج ATP كمساهم رئيسي في انحطاط أكسونال في مرض التصلب العصبي المتعدد.

Figure 4
الشكل 4: بيانات المصفوفة الدقيقة وتقنيات التحقق من صحة المصب التي يتم تنفيذها في القشرة الحركية MS. (أ) التجميع الهرمي للنصوص المعدلة بشكل كبير من السيطرة (C1-C6) وSPMS (MS1-MS6) عينات القشرة الحركية، ودعم أنماط التعبير الجيني المتعلقة بالأمراض بشكل منفصل. من بين النصوص المنخفضة في القشرة الحركية MS،ينتمي ستة وعشرون إلى سلسلة نقل الإلكترون (B). تم تخفيض مجمع الميتوكوندريا الأول (NDUFA6) mRNA في الخلايا العصبية (ن = 55-130) في القشرة الحركية MS(CII)مقارنة بالسيطرة (CI)، في حين أن كثافات MRNA PLP كانت مماثلة بين السيطرة (CIII) وMS (CIV) القشرة الدماغية. انخفض نشاط مجمعات نقل الإلكترون الأول والثالث في الكسور الغنية بالميتوكوندريا من القشرةالحركية لمرضى التصلب المتعدد (ن = 3) (D). أعيد طبعها من دوتا وآخرون6 بإذن. تمثل أشرطة الخطأ SEM; شريط مقياس في CI-IV هي 25 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مسببات الأمراض من الخلل المعرفي في مرض التصلب العصبي المتعدد8. 40 إلى 60٪ من مرضى التصلب المتعدد لديهم انخفاض المعرفي وانخفاض الوظيفة التنفيذية. حددنا الحصين، وهو موقع وظيفي للذاكرة / التعلم، كموقع مشترك لإزالة التمن في مرض التصلب العصبي المتعدد. قارنا بعد ذلك التعبير الجيني العصبي في فرس النهر الملينات وdemyelinated ووجدت تخفيضات كبيرة في mRNAs الخلايا العصبية ترميز البروتينات المشاركة في الذاكرة / التعلم. قمنا بتوسيع هذه البيانات من خلال إثبات أن يتم زيادة microRNAs مختارة في الحصين demyelinated وأن هذه microRNAs يمكن أن تقلل من التعبير عن مستقبلات الغلوتامات. وقد استنسخنا هذه الملاحظات ووسعنا نطاقها في نماذج القوارض. قارنا بعد ذلك التعبير الجيني العصبي في فرس النهر الملينات وdemyelinated ووجدت تخفيضات كبيرة في البروتينات ترميز mRNA الخلايا العصبية المشاركة في الذاكرة / التعلم.

Figure 5
الشكل 5: جمع الأنسجة، والتحليل النسيجي، ودراسات التعبير الجيني في الحصين MS. يتم اختيار شرائح الدماغ التيتحتوي على الحصين أثناء تشريح الجثة (أ) ويتم إزالة الحصين والمنطقة المجاورة (المربع الأحمر) لمزيد من التحليل. وأظهرت مناعة لPLP الحفاظ على الملينفي جميع السيطرة (B) و 40٪ من مرض التصلب العصبي المتعدد hippocampi (C). تم الكشف عن إزالة المليون واسعة النطاق في ~60٪ من مرض فرس النهر MS (D). بالمقارنة مع السيطرة hippocampi (E، G، I) ، لم يتم الكشف عن فقدان الخلايا العصبية الكبيرة في المناطق CA1 ، CA3 ، أو CA4 من فرس النهر MS demyelinated (F، H، J) كما هو مبين من قبل HuR الكيمياء المناعية. أظهرت الفلورة المناعية المزدوجة للميلين (البروتين الأساسي الملين (ميغابت في الثانية)، الأخضر) والمحاور (SMI32، الأحمر) فقدان الملين (L) مع الحفاظ النسبي على المحاور (N) في الحصين MS demyelinated مقارنة مع الحصين السيطرة ( ميغابت في الثانية، K؛ SMI32, M). تجميع مزدوج من مستويات التعبير mRNA ترتيب عينات في مجموعات منفصلة على أساس حالة الملين (myelinated وdemyelinated) والموقع (الحصين مقابل القشرة الحركية) (O). يتم الإشارة إلى مستويات mRNA عالية بالأحمر والأزرق يشير إلى انخفاض مستويات التعبير. لوحات C-O تكييفها من Dutta وآخرون8 بإذن. B-D: 2 مم، E-J: 100 درجة مئوية، K-N: 50 ميكرومتر.

الروابط المرضية للرنين المغناطيسي يتغير12. في حين أن التصوير بالرنين المغناطيسي هو مؤشر قيم لتشخيص مرض التصلب العصبي المتعدد والاستجابة للعلاج، وهو أيضا توقع لتطور مرض التصلب العصبي المتعدد، فإن الروابط المرضية للتغيرات التصوير بالرنين المغناطيسي غير مفهومة بشكل جيد. وقد ركزت دراساتنا التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الوفاة على اثنين من التصوير بالرنين المغناطيسي ROI. الـ ROIs الدماغية البيضاء التي كانت فقط T2 فرط الكثافة (T2 فقط) وROIs التي لديها مزيج من كثافة T1، كثافة Hyperintensity T2، وانخفاض نسبة نقل المغناطيسية (MTR) (T2T1MTR). ما يقرب من 45٪ من الدماغ الأبيض المسألة T2 فقط ROIs كانت myelinated، مما يؤكد طبيعتها غير محددة. وعلى النقيض من ذلك، فإن 83% من ROIs T2T1MTR كانت منزوعة المليون بشكل مزمن وظهرت كثقوب سوداء. قيم T1 وMTR شبه كمية وقيمها تختلف بشكل كبير في RoIs T2T1MTR. إذا كان فقدان الملين هو المساهم الوحيد في هذه التغييرات التصوير بالرنين المغناطيسي، ثم يجب أن تكون القيم ثابتة. ترتبط المحاور المتورمة مع كل من قيم T1 وMTR.

Figure 6
الشكل 6: نسب نقل المغنطة (MTR) ونسب التباين T1 ترتبط خطيا مع النسبة المئوية للمحاور Na+ /K+ ATPase إيجابية في الآفات المزمنة MS. تختلف الآفات المزمنة الملطخة بـ Na+/K+ ATPase (الأخضر) من حوالي 100٪ (A) إلى صفر (B) في خيوط عصبية (أحمر). وكان العديد من المحاور دون Na+/ K+ ATPase زيادة أقطار (B). مقارنة النسبة المئوية لمحاور Na+/K+ ATPase إيجابية في آفات التصلب المتعدد المزمن ة المزيلة للبيانات المرتبطة بمترو الأنفاق الكمي بعد الوفاة (p < 0.0001, C)ونسب التباين T1 (p < 0.0006, D). كل نقطة بيانات هي من آفة واحدة وكل مزيج فريد من نوعه لون رمز يدل على واحدة من العقول التي تمت دراستها. قضبان الموازين = 5 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الانحطاط العصبي مستقلة عن إزالة المليون11. تاريخيا، كان يعتقد أن التنكب العصبي في مرض التصلب العصبي المتعدد نتيجة لإزالة التمهل. ومع ذلك، أثارت دراسات تصوير الدماغ إمكانية أن يكون التنكب العصبي والتنكّل أحداثاً مستقلة. لقد حددنا مؤخراً مجموعة فرعية من مرضى التصلب المتعدد الذين لديهم إزالة من الحبل الشوكي والقشرة الدماغية، ولكن ليس من المادة البيضاء الدماغية. نحن صاغ هذا النوع الفرعي MS كما MS النخاعية (MCMS). وقد وفرت حالات MCMS منبراً للتحقيق في العلاقة بين إزالة الميميلينيشن الدماغي ة وخسارة الخلايا العصبية القشرية. بالمقارنة مع القشرية السيطرة، وفقدان الخلايا العصبية القشرية كانت أكبر بكثير في القشرية MCMS مما كانت عليه في القشرية MS نموذجية. تم الحصول على أنسجة الدماغ السيطرة من قسم علم الأمراض في كليفلاند كلينك. توفر هذه الدراسة أول دليل مرضي لتنكس الأعصاب في غياب التحلل.

Figure 7
الشكل 7: فقدان الخلايا العصبية في غياب إزالة التمن ة البيضاء الدماغية. مقطع نصف الكرة الإكليلي الملطخ بالبنفسج من فرد مصنفعلى أنه مرض التصلب العصبي المتعدد النموذجي (A). تمت مقارنة الكثافات العصبية في الطبقات القشرية III و V و VI في كل من المناطق الخمس التي تحمل علامات. تظهر الخلايا العصبية التي تزيد مساحتها عن 60 ميكرومتر2 (أصفر) في صورة تمثيلية من القشرة الزمنية الفائقة (B). وضع العلامات على PLP وتوزيع الآفات demyelinated (يتم تسليط الضوء على إزالة النخاع الأبيض باللون الأزرق؛ يتم تسليط الضوء على إزالة النخاع تحتيبج في الوردي) في أقسام نصف الكرة الغربي من الأفراد الذين يعانون من مرض التصلب المتعدد نموذجي (C) وMS النخاعية (D ) يتم عرضها. تم العثور على ارتباط كبير بين انخفاض كثافة الخلايا العصبية القشرية وزيادة حجم آفة المادة البيضاء الدماغية في مرض التصلب العصبي المتعدد نموذجية، ولكن ليس في مرض التصلب العصبي المتعدد النخاعي (E) ؛ خطوط متقطعة تشير إلى فاصل الثقة 95٪ (CI). IFG = سايروس الأمامي السفلي. STG = الغيروس الزمني متفوقة. INi = insula السفلي. INs = insula متفوقة. CG = الكجنة سايروس. مستنسخة من تراب وآخرون11 بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مدة التسلسل وصف التسلسل استخدام التسلسل
0:09:09 المترجم تعريب للتسلسلات اللاحقة
9:14 3D المغناطيسية أعدت صدى التدرج السريع (MPRAGE) تقدير الحجمي للتصوير الهيكلي لهياكل الدماغ
5:14 استرداد انعكاس مخفف للسوائل ثلاثية الدّالة (FLAIR) تحديد الآفة تجزئة الآفة تقييم الآفة الحجمية
2:35 2D T2 المرجحة تحديد الآفة تجزئة الآفة تقييم الآفة الحجمية
الساعة 5:12 3D التدرج وأشار صدى مع نقل المغناطيسية قبل النبض، (MT-ON) قياس مزعوم لمحتوى الملين في الأنسجة الطبيعية والآفة
الساعة 5:12 3D التدرج يذكر صدى دون نقل المغناطيسية قبل النبض، (MT-OFF)
الساعة 00:27 نشر تعيين حقل التصوير Tensor (DTI) قياس انتشار المياه في أنسجة الدماغ يعتقد أن تعكس سلامة أنسجة الدماغ.
الساعة 10:27 نشر عشرات التصوير (DTI) متعددة قذيفة
1:18 نشر عشرات التصوير (DTI) متعددة قذيفة
39:48:00 المجموع الفرعي: الموارد الأساسية

الجدول 1: بروتوكول التصوير بعد الوفاة.

Discussion

نحن نصف البروتوكول الذي تم استخدامه لشراء بسرعة ومعالجة الأنسجة من أكثر من 150 شخصا مع مرض التصلب العصبي المتعدد. ومن السمات الهامة لهذا البروتوكول أن العلماء الذين يستخدمون الأنسجة هم أيضا مسؤولون عن وضع البروتوكول وتنفيذ جمع الأنسجة. وهذا يوفر المرونة في تلبية الاحتياجات العلمية للمشاريع البحثية الفردية. وتعزز عدة جوانب من هذا البروتوكول فائدته. وعادة ما يكون المرضى يتميزون بشكل جيد قبل الوفاة، حيث أن العديد منهم قد تبعهم أطباء الأعصاب في مركزنا. خطوة حاسمة هي معالجة التبرعات الأنسجة بعد وقت قصير من الوفاة، مما يزيد من نوعية الأنسجة المجمدة بالمقارنة مع بعض البنوك الدماغ الأخرى. وهذا يمكّن الدراسات الجزيئية ذات القيمة الكبيرة في وصف التغيرات في المنتجات الجينية النسخية والترجمة، والتي تعتبر أساسية لإثبات الملاحظات النسيجية والمناعية الكيميائية. إن الاستفادة من البيانات المورفولوجية/المناعية والكيميائية والجزيئية عبر حالات متعددة يعزز موثوقية الاستنتاجات. ويتجلى ذلك على أفضل وجه من خلال وصفنا للتغيرات الجينية الميتوكوندريا في القشرة الدماغية والتغيرات الجينية العصبية في فرس النهر demyelinated. ويجري وضع بروتوكولات جديدة لتوصيف الجينات بمعدل سريع، وينبغي أن توفر الأنسجة المجمدة في مصرفنا الحمض النووي الريبي عالي الجودة لتحليل الأنسجة والخلايا الواحدة.

جانب آخر من جوانب بروتوكولنا هو شرائح الدماغ قصيرة ثابتة. يتم قطع هذه الأنسجة إلى 30 ميكرومتر سميكة، وأقسام عائمة حرة. هذه الأقسام مثالية لاستخدام الفحص المجهري البؤري لتحليل اثنين أو أكثر من المستضدات في ثلاثة أبعاد. وتشمل الأمثلة الجيدة على ذلك التفاعل بين عمليات الخلايا القلة قبل التميّز مع المحاور المزيلة للضمور في آفات التصلب المتعدد المزمنة، فضلاً عن تحديد الوصلات الأحادية ذات المحاور إلى المصابيح الصدغية ذات الأصابع الإبطية. وهذا على النقيض من الاستخدام الروتيني لمقاطع البارافين التي يبلغ سمكها 7 ميكرومتر، حيث لا يمكن استخدام الصور ثلاثية الأبعاد. الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين لها قيمة كبيرة لبعض الأسئلة، وخاصة الكم من الكثافات العصبية في أقسام نصف الكرة الأرضية 7 ميكرومتر سميكة. وبالتالي، فإن بروتوكولات معالجة الأنسجة لدينا متنوعة وتوفر المرونة لضمان الأنسجة الثابتة والمجمدة بسرعة.

ميزة أخرى فريدة من نوعها من بروتوكولنا هو التصوير بالرنين المغناطيسي الدماغ بعد الوفاة في الموقع. التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ هو علامة حيوية لا يمكن استبدالها لمرض التصلب المتعدد. لذلك، من الضروري إنشاء الروابط المرضية لإشارات التصوير بالرنين المغناطيسي غير الطبيعية. أثبتت دراساتنا أن كلا من T2 فقط و T2T1MTR ROIs غالبا ما تكون مُلَيَّة. تدعم هذه النتيجة الحاجة إلى طرائق تصوير أكثر تحديداً تميز بشكل موثوق بين المادة البيضاء الدماغية المُلبة والمخية. التصوير بالرنين المغناطيسي يبدو حساسا للكشف عن الملين، ولكن دراساتنا تبين أنه حتى مزيج من T1 / T2 / MTR ليست محددة لتحديد myelination. يوفر بروتوكول ما بعد الوفاة لدينا منصة مثالية لاختبار قدرة طرائق التصوير الجديدة للتمييز بين المادة البيضاء الدماغية المايليناد ة ومنزوعة اللمينات. كما يوفر التصوير بالرنين المغناطيسي الوسيلة المثالية لترجمة نتائج العلوم الأساسية إلى ممارسة سريرية، نظراً لاستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي في أبحاثنا الترجمة واستخدامه السريري على نطاق واسع في المرضى الأحياء.

في حين أن قطع قصيرة وطويلة ثابتة وكذلك شرائح المجمدة يقدم ميزة لمعالجة الأنسجة في وسائط متعددة لدراسات مختلفة، وهناك بعض القيود مع هذه الطريقة. قد يكون تقييم الهيكل بأكمله محدوداً حيث يمكن معالجة أجزاء منه بشكل مختلف على الشرائح المجاورة. حجم كبير من بنك الأنسجة، ومع ذلك، يوفر القدرة على التحقيق في بنية من الاهتمام في مواضيع متعددة لتحسين أخذ العينات. وثمة قيد عام آخر على الدراسات التي تستخدم أنسجة ما بعد الوفاة هو أنها عبر التكلّم. وينبغي تفسير الاستنتاجات المتعلقة بتوقيت التغييرات وتطورها في هذا السياق. قد يكون هناك تحيز اختيار للمرضى الذين يتبرعون الأنسجة الخاصة بهم، والتي قد تحد من تعميم البيانات لجميع المرضى الذين يعانون من مرض التصلب العصبي المتعدد. منذ معظم المتبرعين يموتون من مضاعفات مرض التصلب المتعدد المتقدمة، قد لا يكون من المناسب استقراء النتائج من هؤلاء المرضى لأولئك الذين هم في المراحل المبكرة من مرض التصلب العصبي المتعدد. ومع ذلك، تلقينا أنسجة من المرضى الأصغر سنا الذين توفوا من الحالات غير المتعلقة بالتصلب المتعدد (أي احتشاء عضلة القلب الحاد، جرعة زائدة من المخدرات، الانتحار). نطاق بروتوكولنا لا يشمل أخذ عينات من الأجهزة الأخرى (مثل الجهاز الهضمي ونخاع العظام) التي تورطت في مرض التصلب العصبي المتعدد. ونحن نعتقد أن نقاط القوة في البرنامج تفوق إلى حد كبير حدودها.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويود المؤلفان أيضا أن يشكرا الدكتور كريستوفر نيلسون على مساعدته التحريرية. ويدعم برنامج التشريح جزئيا من قبل R35 منحة NS097303 إلى BDT. ويدعم العمل في مختبر RD من خلال المنح من NINDS (NS096148) والجمعية الوطنية للتصلب المتعدد، الولايات المتحدة الأمريكية (RG 5298).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Biotinylated goat anti-mouse IgG Vector Laboratories BA-9200 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating.
RRID: AB_2336171
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboratories BA-1000 1:500 dilution.
Biotinylated goat anti-rat IgG Vector Laboratories BA-9400 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating.
RRID: AB_2336208
Glial fibrillary acid protein (GFAP) Dako Z0334 1:700 dilution for hemispheric.
RRID: AB_10013382
HuR, mouse IgG, 3A2 clone Santa Cruz SC-5261 1:500 for 30µm free floating.
RRID: AB_627770
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 Dako Mo746 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30 µm free floating.
RRID: AB_2313661
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) Biolegend 801701 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating.
RRID: AB_2564642
Phosphorylated neurofilament (SMI31) Biolegend 801601 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating.
RRID: AB_2564641
Proteolipid protein (PLP) Gift from Wendy Macklin 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.
Reagents
125 mm filter paper Whatman 1452-125 For filtering PFA.
50% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320 Electron microscopy grade.
Cytoseal ThermoScientific 8310-16
Ethylene glycol Fisher Chemical BP230-4
Glycerol Sigma-Aldrich G7893 400 mL/2 L Cryoprotection solution.
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore-Sigma SLHV033RB
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19200 Prills form.
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) Fisher Chemical BP220-212
Sodium azide Fisher Chemical S227I 2 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S0876 98.8 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate mono basic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 14.352 g/2 L Sorenson's buffer.
Sucrose Sigma-Aldrich PVP40-500G
VectaStain ABC Kit Vector Laboratories PK-6100 1:1,000 dilution of A and B.
RRID: AB_2336819
Waterproof drawing black ink Higgins 44201
Xylene Fisher Chemical X3S Histological grade.
Equipment
3T MRI Magnetom Prisma Siemens Healthineers
7T MRI Agilent 830AS Siemens Healthineers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder? Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).
  2. Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions. Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).
  3. Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).
  4. Chang, A., et al. Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis. Brain. 131, 2366-2375 (2008).
  5. Chang, A., et al. Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).
  6. Dutta, R., et al. Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients. Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).
  7. Dutta, R., et al. Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients. Brain. 130, 2566-2576 (2007).
  8. Dutta, R., et al. Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients. Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).
  9. Dutta, R., et al. Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors. Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).
  10. Trapp, B. D., et al. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).
  11. Trapp, B. D., et al. Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study. Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).
  12. Young, E. A., et al. Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions. Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).
  13. Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).
  14. Moll, N. M., et al. Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis. Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).
  15. Moll, N. M., et al. Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations. Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).
  16. Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).
  17. Chen, J. T., et al. Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS. Neurology. 80, 246-252 (2013).
  18. Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm. Neuroimage. 54, 278-289 (2011).
  19. Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data. IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).
  20. Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking. Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. , 19-25 (1997).
  21. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. Neuroimage. 17, 825-841 (2002).
  23. Lewis, D. A. The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders. Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).
  24. Chomyk, A. M., et al. DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus. Scientific Reports. 7, 8696 (2017).
  25. Huynh, J. L., et al. Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains. Nature Neuroscience. , (2014).
  26. Ishii, A., et al. Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin. Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).

Tags

علم الأعصاب، العدد 149، التصلب المتعدد، أنسجة ما بعد الوفاة، التصوير بالرنين المغناطيسي، علم الأمراض العصبية، الكيمياء المناعية، الحمض النووي وعزل الحمض النووي الريبي
برنامج التشريح الشامل للأفراد الذين يعانون من التصلب المتعدد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dutta, R., Mahajan, K. R., Nakamura, … More

Dutta, R., Mahajan, K. R., Nakamura, K., Ontaneda, D., Chen, J., Volsko, C., Dudman, J., Christie, E., Dunham, J., Fox, R. J., Trapp, B. D. Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (149), e59511, doi:10.3791/59511 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter