Summary
Multiple Sklerose ist eine entzündliche demyelinisierende Krankheit ohne Heilung. Die Analyse von Hirngewebe liefert wichtige Hinweise auf das Verständnis der Pathogenese der Krankheit. Hier diskutieren wir die Methodik und die nachgelagerte Analyse von MS-Gehirngewebe, das durch ein einzigartiges Schnellautopsieprogramm in der Cleveland Clinic gesammelt wurde.
Abstract
Wir beschreiben ein schnelles Gewebespendeprogramm für Personen mit Multipler Sklerose (MS), bei dem Wissenschaftler und Techniker 24/7, 365 Tage im Jahr, auf Abruf sind. Die Teilnehmer stimmen zu, ihr Gehirn und Rückenmark zu spenden. Die meisten Patienten wurden von Neurologen am Cleveland Clinic Mellen Center for MS Treatment and Research verfolgt. Ihre klinischen Kurse und neurologischen Behinderungen sind gut charakterisiert. Kurz nach dem Tod wird der Körper zum MS Imaging Center transportiert, wo das Gehirn vor Ort durch 3 T Magnetresonanztomographie (MRT) gescannt wird. Der Körper wird dann in den Autopsieraum gebracht, wo Gehirn und Rückenmark entfernt werden. Das Gehirn ist in zwei Hemisphären unterteilt. Eine Hemisphäre wird sofort in eine Schneidebox gelegt und abwechselnd 1 cm dicke Scheiben werden entweder zwei Tage lang in 4% Paraformaldehyd fixiert oder schnell in Trockeneis und 2-Methylbutan eingefroren. Die kurzfixierten Hirnscheiben werden in einer Kryokonservierungslösung gespeichert und für histologische Analysen und den immunzytochemischen Nachweis empfindlicher Antigene verwendet. Gefrorene Scheiben werden bei -80 °C gelagert und für molekulare, immunzytochemische und In-situ-Hybridisierungs-/RNA-Scope-Studien verwendet. Die andere Hemisphäre wird mehrere Monate lang in 4% Paraformaldehyd gelegt, in die Schneidebox gelegt, im 3 T Magnetresonanzscanner (MR) erneut gescannt und in zentimeterdicke Scheiben geschnitten. Postmortem in situ MR-Bilder (MRT) werden mit 1 cm dicken Hirnscheiben koregistriert, um MRT-Pathologie-Korrelationen zu erleichtern. Alle Hirnscheiben werden fotografiert und Hirn-Weißmaterie-Läsionen identifiziert. Das Rückenmark wird in 2 cm Segmente geschnitten. Alternative Segmente werden in 4% Paraformaldehyd fixiert oder schnell eingefroren. Die schnelle Beschaffung von postmortalen MS-Geweben ermöglicht pathologische und molekulare Analysen von MS-Gehirnen und Rückenmarks sowie pathologische Korrelationen von MRT-Anomalien des Gehirns. Die Qualität dieser schnell verarbeiteten postmortalen Gewebe (in der Regel innerhalb von 6 h nach dem Tod) ist von großem Wert für die MS-Forschung und hat zu vielen hochwirksamen Entdeckungen geführt.
Introduction
Eine der besten Möglichkeiten, eine Krankheit zu untersuchen, ist, das erkrankte Gewebe selbst zu untersuchen. Dies stellt diejenigen vor Herausforderungen, die Krankheiten des Zentralnervensystems (ZNS) untersuchen. Biopsien von krankem Gehirn und Rückenmark sind extrem selten und beinhalten in der Regel atypische Fälle. Autopsieraten bei Personen mit ZNS-Erkrankungen sind in den letzten Jahren dramatisch zurückgegangen, und wenn sie durchgeführt werden, bieten sie oft keine schnelle Beschaffung von Geweben. Diese Herausforderungen haben zur Einrichtung von krankheitszentrierten Gehirnbanken geführt, darunter mehrere, die sich auf das Sammeln von Geweben von Personen mit Multipler Sklerose (MS) konzentrierten. MS ist eine entzündlich-vermittelte Erkrankung des ZNS, die Myelin, Oligodendrozyten (Myelin bildende Zellen), Neuronen und Axone zerstört. Die Mehrheit der MS-Patienten haben einen bi-phasischen Krankheitsverlauf, der mit anfallen neurologischen Behinderungen mit variabler Genesung beginnt, die sich schließlich zu einer allmählich fortschreitenden Erkrankung entwickelt, die in der Natur wahrscheinlich neurodegenerativ ist1. Bei der Mehrheit der gespendeten MS-Gehirne übersteigen die postmortalen Intervalle (PMI) zwischen Tod und Gewebeverarbeitung 24 h. Während diese Gewebe wertvolle Informationen über pathologische Veränderungen im MS-Gehirn geliefert haben, sind sie nicht für fortgeschrittenere molekulare Studien geeignet, die leistungsstarke Einblicke in die Krankheitpathophysiologie liefern können. Dies gilt insbesondere für Genprofilierungsstudien, die intakte RNA erfordern.
Um die oben beschriebenen Einschränkungen zu überwinden, haben wir ein schnelles Gewebespendeprogramm entwickelt, das MRT/pathologische Korrelationen ermöglicht. Dieses Protokoll bietet gut erhaltene Gewebe, die für moderne molekulare Studien geeignet sind, und ermöglicht einen direkten Vergleich von Hirnpathologie und MRT-Anomalien im MS-Gehirn. Das Cleveland Clinic Multiple Sklerose Gewebe-Spendenprogramm besteht seit über 20 Jahren. Dieses schnelle Gewebespende-Programm beschafft Gehirne und Rückenmark von Personen mit MS und anderen damit verbundenen autoimmunen neurologischen Erkrankungen. Das Programm zielt darauf ab, In-situ-MRTs innerhalb von 6 h nach dem Tod zu erhalten, gefolgt von der Entfernung von Gehirn und Rückenmark für die Gewebeverarbeitung.
rekrutierung
Spenden werden entweder durch die ante-mortem-Zustimmung erhalten, die direkt von Patienten (vorzustimmunged) oder von nächsten Verwandten nach dem Tod eingeholt wird. Voreinvernehmliche Patienten werden in der Regel aus der klinischen Bevölkerung am Mellen Center for Multiple Sklerose Treatment and Research in Cleveland, Ohio, identifiziert. Obwohl Patienten, die in Längsstudien verfolgt wurden, bevorzugt bei der Rekrutierung im Schnellgewebespendeprogramm bevorzugt werden, steht sie allen Patienten offen, die im Zentrum gesehen werden. Teilnehmer, die sich vor dem Tod einschreiben, erhalten Anweisungen für Familienmitglieder oder Pflegedienstleister, sich mit dem Forschungsteam in Verbindung zu setzen, entweder zum Zeitpunkt des Todes oder wenn der Tod als unmittelbar bevorstehend angesehen wird. Die zweite Methode für Einzelpersonen, das Gewebespendeprogramm zu betreten, ist zum Zeitpunkt des Todes durch Zustimmung der nächsten Verwandten. Der Us-Bundesstaat Ohio verlangt, dass Todesfälle an eine vom Bund beauftragte Organbeschaffungsorganisation namens LifeBanc verwiesen werden, die in 20 Countys im Nordosten Ohios tätig ist. LifeBanc prüft alle Todesfälle auf eine Ms-Diagnose, was ein Ausschluss für Organspenden ist. LifeBanc wurde vorkehrungen getroffen, die Ermittler des MS-Gewebespendeprogramms für alle Todesfälle mit einer damit verbundenen Diagnose von MS zu benachrichtigen, die in einem Umkreis von 75 Meilen von der Cleveland Clinic auftreten. Die nächsten Mitarbeiter des Verwandten und Deskrankenhauses werden dann vom Personal des Gewebespendeprogramms kontaktiert und die Zustimmung zur Spende von Hirn- und Rückenmarksgewebe eingeholt. Diese beiden Methoden der Rekrutierung ante-mortem und post-mortem durch LifeBanc führen zu etwa 10-12 Gehirnspenden pro Jahr. Es werden Anpassungen an der oberen Altersgrenze des Todes vorgenommen, um die Anzahl der von LifeBanc abgeleiteten Empfehlungen zu verwalten.
Beschaffung von Spenden
Das Programm erfordert 24 h Abdeckung, 365 Tage im Jahr von Mitgliedern des Gewebespende-Programms für die Gewebebeschaffung. Das klinische Team, das Gewebespenden abdeckt, verwendet ein zentrales Textbenachrichtigungssystem für Gewebespenden. LifeBanc erhält Nummern, um das Bereitschaftspersonal für das Gewebespendeprogramm zu kontaktieren. Mitglieder werden von Krankenhausanbietern/nächsten Angehörigen (vorzustimmunged) oder von LifeBanc und anderen Überweisungsquellen über den Tod informiert. Erstens wird der Zeitpunkt des Todes und die Durchführbarkeit der Gewebespende bestimmt. Todesfälle werden dann auf Bedingungen untersucht, die möglicherweise zu minderwertigem Gewebe führen, einschließlich längerer vor-mortem Hypoxie, massivem destruktivem Hirngewebe (z. B. große intrakranielle Blutungen, ausgedehnte bihemisphärische Schlaganfälle, umfangreiche Tumor Dauerventilatorunterstützung (>3 Tage) und längere Anwendung von vasoaktiven Wirkstoffen (>3 Tage) vor dem Tod. Wenn ein medizinischer Prüfer an einem Tod beteiligt ist, kann der Studienneurologe mit dem medizinischen Prüfer sprechen, um einen Weg zu erkunden, wie rechtzeitig Gewebe empfangen werden, ohne die Verantwortung des medizinischen Prüfers zu beeinträchtigen. Wenn sich als lebensfähiges Gewebe bemerkbar gemacht wird, wird eine schriftliche Zustimmung eingeholt (wenn nicht vor dem Mortem erlangt) und Es werden Vorbereitungen für den Körpertransport getroffen. Ein zuvor vertraglich vereinbarter Transportdienst wird dann für den Transport zu den MRT-Einrichtungen der Cleveland Clinic kontaktiert. Es wird darauf geachtet, dass der Körper bei Raumtemperatur bleibt und nicht in die Kühlung gebracht wird, da niedrigere Körpertemperaturen mit Veränderungen der MRT-Signaleigenschaften verbunden sind.
Klinische Geschichte
Die klinische Geschichte umfasst Details zur Diagnose von MS, zum Auftreten der Symptome, zu behandlungen, zu Ergebnissen klinischer und paraklinischer Tests (evozierte Potenziale, Cerebrospinalflüssigkeitsergebnisse, optische Kohärenztomographie), Multiple-Sklerose-Funktionsverbund , und erweiterte Behinderung Statusskala (EDSS; tatsächliche oder geschätzte), die aus der Krankenakte gesammelt werden (sofern verfügbar), und direkte Befragung der nächsten Verwandten. Vor-mortem MRT werden ebenfalls gesammelt.
Protocol
Dieses Protokoll wurde vom Cleveland Clinic Institutional Review Board genehmigt und folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung der Cleveland Clinic.
1. In Situ MRT
- Nehmen Sie den Spenderkörper mit in die MRT-Suite und führen Sie ein 2-h-MRT-Bildgebungsprotokoll in der MS Imaging Facility durch. Führen Sie MRT auf einem 3 T oder 7 T-Imager durch.
HINWEIS: Priorität hat 3T, da die meisten älteren Daten auf 3 T durchgeführt wurden, aber wenn nicht verfügbar, wird die Bildgebung mit 7T durchgeführt. Für alle Fälle ( Tabelle1) werden bestimmte Kernsequenzen durchgeführt und zusätzliche Sequenzen, die von aktuellen Forschungsinteressen abhängen, werden durchgeführt, wenn die Zeit dies zulässt (eingeschränkt durch Die Erreichung der Gewebefixierung weniger als 12 h nach dem Tod). Tabelle 1 beschreibt die Kernsequenzen.
2. Autopsie
HINWEIS: Nach der In-situ-MRT wird der Körper zur Hirn- und Rückenmarksextraktion durch eine Diener- und Gewebeverarbeitung durch Labormitglieder in die Leichenhalle transportiert.
- Führen Sie die folgenden Schritte vor der Ankunft des Körpers in der Leichenhalle durch. Zwei Stunden vorher 3 L mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und Etikettenbehältern und Beuteln für die Gewebelagerung vorbereiten. Bereiten Sie 3 L 8% PFA vor und verdünnen Sie 1,5 L von 8% PFA auf 4% PFA. Legen Sie die restlichen 8% PFA in 4 °C für Tag 2.
- Vor der Reise in die Leichenhalle, füllen Sie 2 Reisekühler zu 50% Kapazität mit Trockeneis (große Blöcke gebrochen, um zu passen und kleine Pellets).
- In der Leichenhalle einen Edelstahlbehälter auf halbem Weg mit 2-Methylbutan und Trockeneis füllen und mit einem Deckel bedecken, um das Gewebe zu fangen.
- Wiegen und fotografieren Sie das Gehirn, sobald es vom Diener entfernt wurde.
- Legen Sie alle angebauten Dura in einen mit PFA gefüllten Behälter.
- Trennen Sie Kleinhirn und Hirnstamm vom Großhirn und fotografieren Sie das Großhirn.
- Identifizieren Sie die Sehnerven, Denkreiz und Trakte und trennen Sie sie mit einer Sonde und einer Pinzette. Resektieren Sie die Struktur mit einem Skalpell.
HINWEIS: Das distale Segment einer Seite des Sehnervs wird zur Identifikation mit Higgins-Tinte markiert. - Trennen Sie die Zerebralparese längs und fotografieren Sie jede Hemisphäre einzeln.
- Tinte des primären Motorkortex (PMC) für die linke Hemisphäre, re-photographieren Sie ihn neu und legen Sie ihn in einen 3,3-L-Behälter für die Langfixierung. Dokumentieren Sie die Startzeit für die Hirnfixierung.
- Die PMC für die rechte Hemisphäre kann eingefärbt oder ausgeschnitten werden.
- Wenn sie ausgeschnitten werden, entfernen Sie zuerst die Verkleidungsmenings.
- Re-Photographed Tinte oder verbrauchen PMC.
- Wenn PMC ausgeschnitten wird, schneiden Sie sie in 6 gleich große Abschnitte.
- Tinte den rostralen Aspekt jedes Abschnitts.
- Platzieren Sie ungerade Nummerierungen zur Kurzfixierung in PFA-gefüllte Behälter.
- Snap-freeze gleichmäßig nummerierte Abschnitte und legen Sie in versiegelten Gefrierbeuteln in kühlere #1.
- Schneiden Sie die rechte Halbkugel nachaußen in 1 cm dicke koronale Abschnitte.
- Dokumentieren Sie grobe Anomalien (z. B. Schneiden von Artefakten, Blutungen und Läsionen).
- Platzieren Sie ungerade Nummerinabschnitte in Behältern, die mit PFA gefüllt sind, um sie kurz zu fixieren.
- Snap-freeze gleichmäßig nummerierte Abschnitte und legen Sie in versiegelten Gefrierbeutel.
- Dokument ende der Hirnfixierungszeit.
- Trennen Sie das Hirnstamm vom Kleinhirn und legen Sie es zur Kurzfixierung in einen PFA-gefüllten Behälter.
- Trennen Sie Kleinhirnhalbkugeln längs.
- Schneiden Sie jede Hemisphäre in 4 gleich dicke sagittale Abschnitte.
- Fotografieren Sie mediale und seitliche Ansichten.
- Legen Sie linke kleinhirnelhemisphärische Scheiben in einen mit PFA gefüllten Behälter für die Kurzfixierung.
- Snap-freeze rechts Kleinhirn hemisphärische Scheiben und legen Sie in versiegelten Gefrierbeutel nbiskühler #1.
- Erhalten Sie das Rückenmark mit Nervenwurzeln vom Diener.
- Rückenmarks-Dura-Mater entfernen und Dura in einem Behälter mit PFA lagern.
- Trennen Sie linke und rechte vordere und hintere Nervenwurzeln. Schneiden Sie die linken vorderen und hinteren Nervenwurzeln aus dem Rückenmark geschnitten und legen Sie in einem PFA gefüllten Behälter für Kurzfixierung.
- Schneiden Sie die rechten vorderen und hinteren Nervenwurzeln aus dem Rückenmark, schnappen Sie, legen Sie sie in versiegelte Gefrierbeutel und legen Sie sie dann in kühlere #2.
- Fotografieren Sie die kaudalsten 20 cm des Rückenmarks. Dokumentieren Sie den Speicherort der Lendenvergrößerung.
- Schneiden Sie 2 cm Querabschnitte der Schnur, die von kaudal zu rostral gehen.
- Tinte den rostralen Aspekt jedes Schnittabschnitts.
- Platzieren Sie ungerade Nummerinabschnitte in Behältern, die mit PFA gefüllt sind, um sie kurz zu fixieren.
- Snap-freeze gleichmäßig nummerierte Abschnitte, legen Sie in versiegelte Gefrierbeutel, und dann in kühlere #2.
- Dokumentieren Sie die Startzeit für die Rückenmarksfixierung und alle groben Anomalien.
- Fotografieren Sie den verbleibenden rostralen Teil des Rückenmarks.
- Dokumentieren Sie die Position der Gebärmutterhalsvergrößerung. Befolgen Sie die Schritte 2.13.5–2.13.8 für das verbleibende Rückenmark.
- Nach der Leichenhalle gefrorenes Gewebe in beschrifteten Kisten in -80 °C Gefrierschränken. Festes Gewebe bei 4 °C lagern.
- Bei 24 h nach der Autopsie (Tag 2) die restlichen 8% PFA auf 4% verdünnen.
- Ersetzen Sie 4% PFA in Fixationsbehältern durch frisch verdünnte 4% PFA.
- Bei 60 h nach der Autopsie bereiten Lösungen von 2,5% Glutaraldehyd in 4%PFA aus Glutaraldehyd, PFA, dH2 O und Sorenson Puffer (durch Mischen in Folge zubereitet: 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,4, Polyvinylpyrolidon 1% w/v, Saccharose 30% w/v, und Ethylenglykol 30% v/v).
- Entfernen Sie gebrauchte 4% PFA aus Kurzbefestigungsbehältern.
- Gewebe in Sorensons Puffer abspülen und in Kryoschutzlösung (Glycerin 20%, 0,4 M Sorenson-Puffer 20% und 0,02% Natriumazid in dH2O) legen.
- Fotografieren Sie kurzfixierte Gehirnscheiben, Kleinhirn, Hirnstamm und motorische Kortex (falls zutreffend).
- Mit einem Skalpellblatt geschnitten 2 mm dicke Querprofile aus jedem 2 cm kurz-festen Rückenmarksteil.
- Abschnitte in 2 ml Szintillationsfläschchen platzieren und mit einer Lösung von 2,5% Glutaraldehyd in 4% PFA füllen.
- Geben Sie den restlichen Abschnitt in die ursprüngliche 20 ml Szintillationsdurchstechse zurück. Abschnitt mit Sorensons Puffer abspülen und durch Kryoschutzlösung ersetzen.
3. Pathologie
HINWEIS: Kurzfixierte Scheiben der rechten Hemisphäre sowie die langfeste linke Halbkugel (mehrere Monate in 4% PFA) werden entweder in 30 m Abschnitte (als frei schwebend bezeichnet) geschnitten oder in Paraffin eingebettet und als 12–14 m Abschnitte (bezeichnet als paraffin-eingebettet). Diese Abschnitte werden in der Regel mit Proteolipidprotein (PLP) zum Nachweis von demyelinisierenden Läsionen und dem Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC-II) zur Immunaktivität mit der Diaminobenzidin -Methode (DAB) verarbeitet. Diese Protokolle wurden standardisiert und in mehreren Publikationen2,3,4,5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12.
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Frei schwebend (30 m) DAB-Avidin-Biotin Complex (ABC) Gewebefärbung
- Abschnitte von der Kryospeicherlösung entfernen, Abschnitte auf eine Sechs-Brunnen-Platte übertragen und 3x für jeweils 5 min in 2 ml 1x phosphatgepufferter kocherkochat eisolierter koch-pH 7.0 (PBS) waschen. Bei der Übertragung auf den nächsten Brunnen in der Sechs-Well-Platte verwenden Sie Pflege nicht das Gewebe zu reißen. Legen Sie bei jedem Wasch- und Inkubationsschritt die Sechs-Well-Platte auf einen Shaker und lassen Sie das Gewebe sanft schütteln.
HINWEIS: Gewebeabschnitte, die in kleineren Volumina und in größeren Platten (d. h. 12- und 24-Well-Platten) inkubiert werden, weisen tendenziell Oberflächen- und Kantenrisse auf. - Antigenabruf durch Mikrowaving-Abschnitte in einem Glasbecher mit ca. 30 ml 10 ml Citratpuffer (pH 6,0). Stellen Sie sicher, dass Gewebe nicht gefaltet werden, indem Sie 2–3 min mit einem Pinsel und Mikrowellenabschnitten manipulieren oder bis der Citratpuffer zu kochen beginnt. Abschnitte auf Raumtemperatur abkühlen lassen (ca. 20 min).
- Transferabschnitte zurück auf eine Sechs-Brunnen-Platte und Waschabschnitte 3x für je 5 min in 2 ml PBS/0,3% Triton X-100. Block endogene Peroxidase durch Inkubation von Abschnittenin 2 ml von 3% H2 O2 /0,3% Triton X-100/PBS für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
- Waschabschnitte 3x für je 5 min in 2 ml PBS/0,3% Triton X-100. Blockabschnitte in 2 ml mit 3% normalem Ziegenserum/0,3% Triton X-100/1x PBS für 1 h bei RT.
- Inkubieren Sie Abschnitte über Nacht bis zu 5 Tage (je nach Antikörper) in primären Antikörpern, die gegen Mikroglia- und Myelinepitope gerichtet sind, um Entzündungen (MHCII) und Demyelination (PLP) (siehe Materialtabelle)bei 4 °C zu erkennen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Abschnitte nicht gefaltet werden, wenn sie in diesem Schritt oder nachfolgenden Schritten inkubiert werden, da dies dazu führt, dass Bereiche innerhalb der Abschnitte nicht fleckfrei sind. - Waschen Sie Abschnitte 3x für je 5 min in 2 ml 1x PBS. Dann inkubieren Abschnitte in sekundären biotinylierten Antikörpern (siehe Materialtabelle) für 1 h bei RT. Bereiten Sie Avidin-Biotin Complex (ABC) Lösung während der Inkubation etwa 45 min vor dem nächsten Waschschritt, damit ABC-Komplexe bilden können.
- Waschen Sie Abschnitte 3x für je 5 min in 2 ml 1x PBS. Dann inkubieren Abschnitte in ABC für 1 h bei RT.
- Waschen Sie Abschnitte in 2 ml 1x PBS dreimal für je 5 min. Inkubieren Sie Abschnitte in gefiltertem DAB (2 ml/Well/Abschnitt), die H2O2 (1:500 Verdünnung von 30% H2 O2in DAB) enthalten, bis sich die Farbe angemessen entwickelt (ca. 3–8 min).
- Waschen Sie Abschnitte 3x für je 5 min in 2 ml 1x PBS. Um das Signal zu verbessern (optional), osmicate mit 0,04% OsO4 (ca. 30 s).
- Waschen Sie Abschnitte dreimal für 5 min pro Stück in 1x PBS. Individuell übertragen Sie jeden Abschnitt von der Sechs-Brunnen-Platte auf einen kleinen Behälter voller 1x PBS und positionieren Sie den Gewebeabschnitt auf einem Glasschlitten so flach wie möglich.
- Heben Sie die Rutsche vorsichtig aus dem PBS heraus, während Sie sicherstellen, dass der Gewebeabschnitt so flach wie möglich ist. Mit zwei Pinsel, sanft abflachen und dehnen Sie das Gewebe auf der Rutsche und dupmdas überschüssige Wasser mit Papiertuch abwischen. Befestigen Sie Gewebeabschnitte mit Glycerin (oder einem gleichwertigen Montagemedium) und versiegeln Sie den Deckelrutsch mit klarem Nagellack.
- Abschnitte von der Kryospeicherlösung entfernen, Abschnitte auf eine Sechs-Brunnen-Platte übertragen und 3x für jeweils 5 min in 2 ml 1x phosphatgepufferter kocherkochat eisolierter koch-pH 7.0 (PBS) waschen. Bei der Übertragung auf den nächsten Brunnen in der Sechs-Well-Platte verwenden Sie Pflege nicht das Gewebe zu reißen. Legen Sie bei jedem Wasch- und Inkubationsschritt die Sechs-Well-Platte auf einen Shaker und lassen Sie das Gewebe sanft schütteln.
4. Paraffin-eingebettete hemisphärische Abschnitte: DAB Färbung
- Paraffin in einem 60 °C-Ofen für 5–10 min von den Rutschen abschmelzen.
- Deparaffinisieren Abschnitte durch Inkubieren in Xylol 3x für jeweils 5 min.
- Rehydrieren Sie Gewebe in abgestuftem Ethanol bei 100% (2x für je 5 min), 95% (2x für 5 min), 70% (2x für je 5 min) und 50% (1x für je 5 min). Abdeckungsfolien in PBS.
- Antigen-Retriev durch Mikrowaving-Dias in einem Becher von 10 mM Citratpuffer (pH 6.0).
- Schlitten in 1x PBS (3x pro 5 min) waschen, sobald sie auf Raumtemperatur abgekühlt sind. Block endogene Peroxidase durch Inkubation von Gewebe in 3% H2O2/1% Triton-X 100/PBS für 30 min.
- Waschen Sie Gewebe in 1x PBS dreimal für jeweils 5 min. Blockgewebe mit 6% normalem Ziegenserum in PBS für 1 h.
- Inkubieren Sie Abschnitte in primärer Antikörper (siehe Materialtabelle) in PBS bei Raumtemperatur (RT) über Nacht (max. 20 h).
- Waschen Sie Abschnitte 3x für je 5 min in 1x PBS. Dann inkubieren Abschnitte in entsprechenden sekundären Antikörper (siehe Tabelle der Materialien) in PBS für 1 h bei RT.
- Bereiten Sie ABC-Lösung ca. 45 min vor dem nächsten Waschschritt während der Inkubation vor.
- Waschen Sie Abschnitte 3x für 5 min jeweils in 1x PBS und dann in ABC für 1 h bei RT inkubieren.
- Abschnitt 3x für je 5 min in 1x PBS waschen.
- Inkubieren Sie Abschnitte in gefilterten (0,45 m Filterporengröße) DAB mit H2O2 (1:500 Verdünnung von 30% H2 O2 in DAB), bis sich die Farbe angemessen entwickelt (ca. 3-8 min).
- Waschabschnitte (3x 5 min) in 1x PBS. Zur Verbesserung des Signals osmicate mit 0,04% Osmiumtetroxid (OsO4; ca. 30 s).
- Waschabschnitte (3x 5min) in 1x PBS.
- Dehydrieren Gewebe in einer abgestuften Reihe von Ethanol 50% (1x 5min), 70% (1x 5min), 95% (2x 5min), 100% (2x 5 min) und 100% Xylol (1x 5min). Xylole verdampfen lassen.
- Montageabschnitte mit Toluon-basierten schnellen Trockenmontagemedien. Formulierungen, die Antioxidantien enthalten, werden empfohlen, um Fleckenbleichen zu verhindern. Entfernen Sie überschüssige Montagemedien von Densazurn mit einem Rasiermesser für die nachfolgende Lagerung.
5. MRT/Pathology Korrelationen
HINWEIS: Für die Korrelation von MRT mit Pathologie führen wir zunächst ex vivo MRT der lang fixierten intakten Hirnhälfte (Schritt 2.9 oben) in einer verstellbaren Box mit MRT-sichtbaren Markern durch, die auf Schneidschlitze hinweisen. Wir schneiden dann das Gehirn und fotografieren die 1 cm Scheiben, um die Ko-Registrierung von In-situ-MRTs auf die einzelnen Gehirnscheiben zu ermöglichen. Anschließend können wir MRT-geführte Analysen durchführen, bei denen Interessengebiete (ROIs) auf MRT identifiziert werden, um Gewebeanalysen zu lenken. Wir können auch histopathologiegeführte Analysen durchführen, bei denen ROIs auf Gewebe identifiziert werden (z. B. Weiße Materieläsionen, weiße Materie ohne Demyelination usw.) und dann durch die kolokalisierten MRT-Maßnahmen gekennzeichnet werden (Tabelle 1).
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Identifizierung von MRT-basierten ROIs
ANMERKUNG: In früheren Studien haben wir ROIs in weißer Materie11,12,13,14,15 und graue Materie16,17, 18. Das folgende Beispiel dient der Analyse der weißen Materie.- Segment T2 hyperintense Läsionen auf In-situ-MRTs (ab Schritt 1.1), zunächst von einem automatischen Algorithmus verarbeitet und dann manuell von erfahrenen Benutzern korrigiert.
- Segment T1 hypointense Läsionen innerhalb von T2 Läsionen als Voxel mit einer Signalintensität weniger als oder gleich 80% der Signalintensität des umgebenden normal erscheinenden Hirngewebes.
- Segment hypointense Bereiche in Magnetisierungtransfer Ratio (MTR) Karten mit einem 80% Schwellenwert.
- Erstellen Sie drei Klassifikationen unter Verwendung der oben genannten Segmentierungen: a) Rindsionen, die bei T2-gewichteten/FLAIR-Scans abnormal, aber bei T1-gewichteten oder MTR-Scans normal sind, b) T2T1MTR-Läsionen, die bei allen T2-gewichteten/FLAIR-, T1-gewichteten und MTR-Scans abnormal sind; und (c) normal erscheinende weiße Materie (NAWM), die bei allen T2-gewichteten/FLAIR-, T1-gewichteten und MTR-Scans normal sind.
HINWEIS: Unsere Auswahl an Slices basiert auf der Existenz aller drei Interessengebiete (T2-only, T2T1MTR und NAWM) auf denselben Slices. - Berechnen Sie normalisierte Intensitäten für jeden ROI, um die Variabilität zu minimieren, die sich aus verschiedenen Gehirnen und verschiedenen Gehirnstandorten ergibt.
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Ko-Registrierung von In-situ-MRT an Hirnscheiben
- Scannen Sie die feste Gehirnhälfte in einer benutzerdefinierten Schneidebox mit vier Reihen von MRT-empfindlichen Markern, die die Steckplätze lokalisieren, in die ein Messer eingesetzt werden kann, um das Gehirn zu schneiden. Führen Sie eine T1-gewichtete 3D-MPRAGE-Erfassung mit einer isotropen Auflösung von 1 mm durch, die das fixierte Gehirn und alle Marker abdeckt.
HINWEIS: Dies wird als Post-Fixation MRT bezeichnet und wird nur als Zwischenschritt für die Ko-Registrierung der In-situ-MRTs in die Hirnscheiben verwendet. - Unmittelbar nach dem Scannen die Gehirnhälfte in Schlitze schneiden, die 1 cm voneinander entfernt liegen, was zu etwa 15 Scheiben führt.
- Fotografieren Sie die Gehirnscheiben sowohl auf der vorderen als auch auf der hinteren Seite.
- Registrieren Sie die In-situ-MRT und Fotos von Gehirnscheiben mit den folgenden Schritten.
- Zur Segmentierung von Post-Fixierung und In-situ-MPRAGE, Vorprozess sowohl Post-Fixierung und in-situ MPRAGE MRT für Intensität Ungleichmäßigkeit19.
- Segmentieren Sie das Gehirn und vier Reihen von Markern aus vorverarbeiteten Post-Fixation MPRAGE.
- Segmentieren Sie die Hemisphäre entsprechend dem Post-Fixierung MRT20,21 aus dem vorverarbeiteten in situ MPRAGE.
- Registrieren Sie die vom Gehirn extrahierten In-situ- und Post-Fixation-MRTs durch eine Reihe von linearen Registrierungsprozessen bis zu 12 Freiheitsgraden (affine registration) mit FSL FLIRT22. Die Skalierungs- und Scherkomponenten berücksichtigen den Effekt der Fixierungsschrumpfung.
- Finden Sie die Normalrichtung der Schnittebene, indem Sie die Summe der maximalen projizierten Intensitäten mithilfe der segmentierten Marker minimieren. Diese Neuausrichtungswinkel werden in die Transformationsmatrix des vorherigen Schritts integriert.
- Vergleichen Sie MRT-Bilder visuell mit Fotos von festen hinteren Gehirnscheiben mithilfe eines hauseigenen Bildbetrachters, der es ermöglicht, die Tiefe und Ausrichtung der normalen Vektoren zu ändern. Kleine Modifikationen sind notwendig, weil das Schneiden des Gehirns unvollkommen ist.
- Wenden Sie die AFFINE-Bildtransformation13 für jedes Slice an, um die In-situ-MRTs an die gleichen Schnittstellen wie die Fotos der Gehirnscheiben zu transformieren.
- Zur Segmentierung von Post-Fixierung und In-situ-MPRAGE, Vorprozess sowohl Post-Fixierung und in-situ MPRAGE MRT für Intensität Ungleichmäßigkeit19.
- Scannen Sie die feste Gehirnhälfte in einer benutzerdefinierten Schneidebox mit vier Reihen von MRT-empfindlichen Markern, die die Steckplätze lokalisieren, in die ein Messer eingesetzt werden kann, um das Gehirn zu schneiden. Führen Sie eine T1-gewichtete 3D-MPRAGE-Erfassung mit einer isotropen Auflösung von 1 mm durch, die das fixierte Gehirn und alle Marker abdeckt.
Representative Results
Wie oben erwähnt, ist fast die Hälfte der zerebralen Hemisphäre eingefroren und für molekulare Studien mit DNA, RNA oder Protein verfügbar. Historisch gesehen, Studien mit postmortalen Hirngeweben wurden gezeigt, dass durch prä-mortem Bedingungen beeinflusst werden, Alter, Geschlecht, Gewebe pH, mRNA Integrität (RIN), postmortem Intervall (PMI), diagnostische Sicherheit, Comorbiditätsverwendung, und vorherige medikamentöse Behandlung Status23. Basierend auf Studien mit Hirngewebe, DNA und Protein scheint in geringerem Ausmaß im Vergleich zu RNA beeinflusst werden. Basierend auf unserer Erfahrung wurden jedoch die RNA-Isolation und die nachgelagerte Analyse am stärksten von den prä-mortem-Bedingungen und dem postmortalen Intervall des Hirngewebes beeinflusst. Wir besprechen daher einige der Bedingungen, die für die Durchführung von RNA-basierten Analysen mit postmortalen MS-Geweben zu erfüllen sind.
Für alle unsere Studien wird das Gehirn nach der Autopsie in Scheiben geschnitten (1 cm dick) und dann entweder in 4% Paraformaldehyd für morphologische Studien fixiert oder schnell für biochemische Analysen eingefroren. Alle Gewebeblöcke sind für die Demyelination durch Immunfärbung mit PLP wie oben beschrieben gekennzeichnet. Abbildung 1zeigt ein repräsentatives Analyseschema. Gewebeabschnitte werden auf das Vorhandensein von Läsionen aus weißer Materie untersucht (Abbildung 1A). Ausgewählte Regionen sind für Immunaktivität gefärbt (Abbildung 1B) und Demyelination (Abbildung 1C). Das gefrorene Gewebe wird auf dem Kryostat montiert (Abbildung 1D) und gefrorene 30 m Abschnitte werden geschnitten. Es folgen die Sammlung von 3-4 nachfolgenden Abschnitten, die Trennung vom angrenzenden Gewebe und die Speicherung für DNA, RNA oder Proteinisolation. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich DNA24,25, RNA5,6,7,8,9 sowie Proteine26isoliert. Während wichtige Ergebnisse aus einigen der Studien zur Analyse von RNA aus MS-Gehirnen diskutiert werden, hier sind einige der Fragen im Zusammenhang mit der Analyse von RNA postmortem MS Gehirne.
Abbildung 1: Probensammlung für die mRNA-Analyse. (A) Autopsiegewebe wird zur Analyse ausgewählt. Gewebebereiche werden ausgewählt und ein Teil des Gewebes wird ausgeschnitten. Alle Abschnitte sind mit (B) MHC-II (Major Histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43) Antikörper zum Nachweis von Entzündungsaktivität und mit (C) Proteolipidprotein (PLP) zur Bestimmung des Myelinstatus mittels veröffentlichter Protokolle gefärbt. Basierend auf dem Myelin-Status wird der Block durch ein Skalpell (D) erzielt. Abschnitte (60 m) werden geschnitten (E) und die Bereiche, die zuvor bewertet wurden, werden entfernt, in Rohre getrennt und beschriftet (F). PLP- und MHC-II-Färbungen werden nach jedem 5 Abschnitt wiederholt, um eine ordnungsgemäße Gewebesammlung zu gewährleisten. Normal erscheinende weiße Materie (NAWM) wird festgestellt und weiße Materieläsionen (WML) sind rot umrissen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Axonale Transektion in den Läsionen von MS10. Ein erster wissenschaftlicher Schwerpunkt dieses Programms lag auf der Charakterisierung zellulärer Komponenten von entmyzintierten White-Matter-Läsionen. Unter den lokalisierten Antigenen waren nicht-phosphorylierte Neurofilamente (NFs). Die meisten NFs werden in myelinierten Axonen phosphoryliert. Bei der Entmyzinierung werden Axone dephosphoryliert. Wir haben die erwartete Expression von nicht phosphorylierten NFs in demyelinierten Axonen entdeckt. Bei akuten MS-Läsionen endeten viele dieser demyelinierten Axone als axonale Rückzugsbirnen (Abbildung 2A), die die proximalen Enden transsektierter Axone widerspiegeln. Transektierte Axone übersteigen 11.000 mm3 in den akuten Läsionen im Vergleich zu benachbarten normalen Regionen10. Diese Beobachtungen trugen dazu bei, einen Paradigmenwechsel in der MS-Forschung zu katalysieren, der das Feld in Richtung Charakterisierung der Neurodegeneration als Hauptursache für dauerhafte neurologische Behinderungen bei Personen mit MS bewegte.
Abbildung 2: Axonale Transektion bei entzündlicher Entmyzinierung. Axonale Transektion tritt während der entzündlichen Entmylixierung (A, Pfeilspitzen) auf und induziert die Bildung von terminalen axonalen Eiräumen (A, Pfeile). Wenn quantifiziert (B), sind transekte Axone reichlich in MS-Läsionen und scheinen mit der entzündlichen Aktivität der Läsion korrelieren. Panel A reproduziert von Trapp et al.10 mit Genehmigung. Rot: Proteolipidprotein, grün: Anti-nichtphosphoryliertes Neurofilament. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Remyelination in chronischen MS Gehirnen3. Die Remyelination kann in frühen Stadien von MS robust sein. Viele chronische MS-Läsionen werden jedoch nicht remyeliniert. Wir untersuchten, ob das Vorhandensein von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) oder die Erzeugung neuer Oligodendrozyten die Remyelination chronisch demyelinierter White-Matter-Läsionen begrenzt. Während die OPC-Dichte oft verringert wurde, waren sie in allen chronisch demyelinierten Läsionen3enthalten. Neu erzeugte Oligodendrozyten waren auch bei vielen chronischen MS-Läsionen vorhanden. Oligodendrozytenprozesse verbunden mit, aber nicht myeliat demyelinierten Axonen (Abbildung 3). Diese Studien deuten darauf hin, dass OPCs und ihre Fähigkeit, neue Oligodendrozyten zu produzieren, die Remyelination chronischer White-Matter-Läsionen nicht einschränken. Wir vermuteten, dass die chronisch demyelinierten Axone, die oft dystrophisch erschienen, nicht empfänglich für remyelination durch neu produzierte Oligodendrozyten waren.
Abbildung 3: Prozesse der vormyelinierenden Oligodendrozyten im Zusammenhang mit Axonen. Gezeigt werden konfokale Mikrographien von MS-Läsionen, die mit PLP-Antikörpern (rot in den Panels A, B) und Neurofilament-Antikörpern (grün in den Panels A, B) gefärbt sind. Ein vormyelinierendes Oligodendrozyten (rot in Panel A) in der subventrikulären Zone (SVZ) erweiterte Prozesse in den Bereich der demyelinierten Axone (grün in Panel A) bei einer chronischen MS-Läsion. Viele dieser Prozesse (Pfeile in Panel A) drehten sich um Axone, wie bei höherer Vergrößerung (Panel B) gezeigt. Die Skalenstäbe stellen 20 m (A) und 5 m (B) dar. Reproduziert von Chang et al.3 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Mitochondriale Dysfunktion bei MS6. Wir führten eine unvoreingenommene Suche nach neuronalen Genveränderungen in schnell eingefrorenen motorischen Kortex von chronischen MS-Patienten durch (Abbildung 4A). Bei einer unvoreingenommenen Suche nach diesem Datensatz wurde eine signifikante Verringerung von 23 kernkraftcodierten mitochondrialen mRNAs bei MS festgestellt (Abbildung 4B). Beglaubigende Studien mit Immunzytochemie und In-situ-Hybridisierung zeigten, dass diese Gene in kortikalen Projektionsneuronen hoch angereichert waren (Abbildung 4C) und dass mitochondrien, die aus Projektionsaxonen isoliert sind, eine reduzierte Glykolyse zeigen ( Abbildung 4D). Dieses Papier katalysierte einen Fokus auf mitochondriale Dysfunktion und reduzierte ATP-Produktion als hauptbeitrag zur axonalen Degeneration bei MS.
Abbildung 4: Mikroarray-Daten und nachgeschaltete Validierungstechniken, die im MOTORkortex von MS durchgeführt werden. (A) Hierarchische Clusterbildung von signifikant veränderten Transkripten aus der Kontrolle (C1-C6) und SPMS (MS1-MS6) Motorkortexproben, die krankheitsbedingte Genexpressionsmuster separat unterstützen. Unter den verringerten Transkripten im MOTORkortex von MS gehörten 26 zur Elektronentransportkette (B). Mitochondrialer Komplex I (NDUFA6) mRNA wurde in Neuronen (n = 55-130) in MS MotorKortex (CII) im Vergleich zur Kontrolle (CI) verringert, während PLP mRNA Dichten zwischen der Kontrolle (CIII) und MS (CIV) Großrintrinähnlichheit ähnlich waren. Die Aktivität der Elektronentransportkomplexe I und III wurde in mitochondrial angereicherten Fraktionen aus dem motorischen Kortex von MS-Patienten verringert (n = 3) (D). Nachdruck von Dutta et al.6 mit Genehmigung. Fehlerbalken stellen SEM dar; Die Skalenstange in CI-IV beträgt 25 m. * p < 0,05 Students es t-test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Pathogenese der kognitiven Dysfunktion bei MS8. Vierzig bis 60% der MS-Patienten haben kognitiven Verfall und reduzierte Exekutivfunktion. Wir identifizierten den Hippocampus, der eine funktionelle Seite des Gedächtnisses/Lernens ist, als eine gemeinsame Stelle für Demyelination bei MS. Als nächstes verglichen wir die neuronale Genexpression in myelinierten und demyelinierten Hippocampi und fanden signifikante Reduktionen neuronaler mRNAs, die Proteine kodieren, die am Gedächtnis/Lernen beteiligt sind. Wir haben diese Daten erweitert, indem wir gezeigt haben, dass ausgewählte microRNAs im demyelinierten Hippocampus erhöht sind und dass diese microRNAs die Expression von Glutamatrezeptoren verringern können. Wir haben diese Beobachtungen in Nagetiermodellen reproduziert und erweitert. Als nächstes verglichen wir die neuronale Genexpression in myelinierten und demyelinierten Hippocampi und fanden signifikante Reduktionen neuronaler mRNA-kodierender Proteine, die am Gedächtnis/Lernen beteiligt sind.
Abbildung 5: Gewebesammlung, histologische Analyse und Genexpressionsstudien im MS-Hippocampus. Gehirnscheiben, die Hippocampus enthalten, werden während der Autopsie ausgewählt (A) und der Hippocampus und der angrenzende Bereich werden für weitere Analysen entfernt (rote Box). Immunostaining für PLP zeigte die Konservierung von Myelin bei allen Kontrollen (B) und 40% der MS Hippocampi (C). Umfangreiche Demyelination wurde bei 60% der MS Hippocampi (D) nachgewiesen. Im Vergleich zur Kontrolle Hippocampi (E, G, I), signifikanter neuronaler Verlust wurde nicht in CA1, CA3, oder CA4 Regionen der demyelinierten MS Hippocampi (F, H, J) wie von HuR Immunhistochemie gezeigt. Die Doppeletikettierung der Immunfluoreszenz für Myelin (Myelin-Basisprotein (MBP), grün) und Axone (SMI32, rot) zeigte den Verlust von Myelin (L) mit relativer Erhaltung von Axonen (N) im demyelinierten Hippocampus im Vergleich zur Kontrolle des Hippocampus ( MBP, K; SMI32, M). Dualclustering von mRNA-Expressionsebenen ordnete Proben in diskrete Cluster auf der Grundlage des Myelinstatus (myeliniert und demyeliniert) und der Lage (Hippocampus vs. Motorkortex) (O) an. Hohe mRNA-Werte werden durch rote und blaue Werte für niedrige Expressionsniveaus angezeigt. Panels C-O Adapted von Dutta et al.8 mit Genehmigung. B-D: 2 mm, E-J: 100 m, K-N: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Pathologische Korrelationen von MRT-Änderungen12. Während MRT ein geschätzter Indikator für die MS-Diagnose und das Ansprechen auf die Behandlung ist und auch ein Prädiktor für das Fortschreiten der MS-Krankheit ist, sind die pathologischen Korrelate von MRT-Veränderungen schlecht verstanden. Unsere postmortalen MRT-Studien konzentrierten sich auf zwei MRT-ROI. Cerebral White-Matter ROIs, die nur T2 hyperintense (T2 only) und ROIs waren, die eine Kombination aus T1-Hypointensität, T2-Hyperintensität und reduziertem Magnetisierungstransfer-Verhältnis (MTR) (T2T1MTR) hatten. Ungefähr 45% der zerebralen Weißstoff-T2-ROIs wurden myeliniert, was ihre unspezifische Natur bestätigt. Im Gegensatz dazu wurden 83% der T2T1MTR ROIs chronisch entmyzint und erschienen als Schwarze Löcher. T1- und MTR-Werte sind semiquantitativ und ihre Werte variierten in den T2T1MTR ROIs stark. Wenn der Verlust von Myelin der einzige Beitrag zu diesen MRT-Änderungen ist, sollten die Werte konstant sein. Geschwollene demyelinierte Axone korrelierten sowohl mit T1- als auch mit MTR-Werten.
Abbildung 6: Magnetisierungs-Transferverhältnisse (MTR) und T1-Kontrastverhältnisse korrelieren linear mit dem Prozentsatz von Na+/K+ ATPase-positiven Axonen bei chronischen MS-Läsionen. Chronisch demyelinierte Läsionen, die für Na+/K+ ATPase (grün) gefärbt wurden, variierten von fast 100% (A) bis null (B) im Neurofilament (rot). Viele Axone ohne Na+/K+ ATPase hatten erhöhte Durchmesser (B). Ein Vergleich des Prozentsatzes von Na+/K+ ATPase-positiven Axonen in chronisch demyelinierten MS-Läsionen korreliert mit quantitativen postmortalen MTR (p < 0.0001, C) und T1-Kontrastverhältnissen (p < 0.0006, D). Jeder Datenpunkt stammt aus einer einzigen Läsion und jede eindeutige Farbsymbolkombination bezeichnet eines der untersuchten Gehirne. Schuppenstäbe = 5 m. Reproduziert von Young et al.12 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Neurodegeneration unabhängig von Demyelination11. Historisch gesehen, Neurodegeneration bei MS wurde gedacht, um aus Demyelination resultieren. Hirnbildgebungsstudien haben jedoch die Möglichkeit erhöht, dass Neurodegeneration und Demyelination unabhängige Ereignisse sein können. Kürzlich haben wir eine Subpopulation von MS-Patienten identifiziert, die eine Demyelination des Rückenmarks und der Großhirnrinde haben, aber nicht der großräumigen weißen Substanz. Wir prägten diesen MS-Subtyp als myelocortical MS (MCMS). MCMS-Fälle boten eine Plattform, um den Zusammenhang zwischen zerebraler Weißer Materie-Demyelination und kortikalen neuronalen Verlust zu untersuchen. Im Vergleich zu Kontrollkortika war der kortikale neuronale Verlust bei MCMS-Kortiken signifikant größer als bei typischen MS-Kortiken. Die Kontrolle des Hirngewebes wurde aus der Pathologieabteilung der Cleveland Clinic gewonnen. Diese Studie liefert die ersten pathologischen Beweise für Neurodegeneration in Abwesenheit von Demyelination.
Abbildung 7: Neuronaler Verlust in Abwesenheit von zerebraler Deryelination aus weißer Materie. Ein Kresylviolett -gefärbter koronaler hemisphärischer Abschnitt aus einem Individuum, das als typisch MS (A )eingestuft ist. Neuronale Dichten wurden in den kortikalen Schichten III, V und VI in jedem der fünf markierten Bereiche verglichen. Neuronen mit einer Fläche von mehr als 60 m2 (gelb) werden in einem repräsentativen Bild aus dem oberen temporalen Kortex (B)dargestellt. Etikettierung für PLP und die Verteilung von demyelinierten Läsionen (weiße Materie-Demyelination ist blau hervorgehoben; subpiale Demyelination ist rosa hervorgehoben) in hemisphärischen Abschnitten von Personen mit typischen MS (C) und myeloortischen MS (D ) angezeigt. Eine signifikante Korrelation zwischen reduzierter kortikaler neuronaler Dichte und erhöhtem hirnweißen Läsionsvolumen wurde bei typischen MS gefunden, jedoch nicht in myelocortical MS (E); gestrichelte Linien zeigen 95% Konfidenzintervall (CI) an. IFG = minderwertiger frontaler Gyrus. STG = überlegener zeitlicher Gyrus. INi = minderwertige Insula. INs = überlegene Insula. CG = cingulate Gyrus. Reproduziert von Trapp et al.11 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Sequenzdauer | Sequenzbeschreibung | Sequenzverwendung |
| 0:09 | Localizer | Lokalisierung für nachfolgende Sequenzen |
| 9:14 Uhr | 3D-Magnetisierung vorbereitet schnellgradient Echo (MPRAGE) | Strukturelle Bildgebung Volumetrische Abschätzung von Hirnstrukturen |
| 5:14 | 3D Fluid abgeschwächte Inversionsrückgewinnung (FLAIR) | Läsionsidentifikation Läsionssegmentierung Volumetrige Läsionsbeurteilung |
| 2:35 Uhr | 2D T2 gewichtet | Läsionsidentifikation Läsionssegmentierung Volumetrige Läsionsbeurteilung |
| 5:12 | 3D Gradienten-zurückgerufenes Echo mit Magnetisierungstransfer-Vorpuls , (MT-ON) | Angebliches Maß des Myelingehalts im normal erscheinenden und lesionalen Gewebe |
| 5:12 | 3D Gradienten-zurückgerufenes Echo ohne Magnetisierungstransfer-Vorpuls , (MT-OFF) | |
| 0:27 | Diffusion Tensor Imaging (DTI)-Feldzuordnung | Messung der Wasserdiffusion im Hirngewebe, von dem angenommen wird, dass er die Integrität des Gehirngewebes widerspiegelt. |
| 10:27 Uhr | Diffusion Tensor Imaging (DTI) Multi-Shell | |
| 1:18 Uhr | Diffusion Tensor Imaging (DTI) Multi-Shell | |
| 39:48:00 Uhr | ZWISCHENSUMME: KERN |
Tabelle 1: Postmortem-Bildgebungsprotokoll.
Discussion
Wir beschreiben ein Protokoll, das verwendet wurde, um schnell Gewebe von über 150 Personen mit MS zu beschaffen und zu verarbeiten. Ein wichtiges Merkmal dieses Protokolls ist, dass die Wissenschaftler, die das Gewebe nutzen, auch für die Erstellung des Protokolls und die Durchführung der Gewebesammlung verantwortlich sind. Dies bietet Flexibilität bei der Erfüllung der wissenschaftlichen Bedürfnisse einzelner Forschungsprojekte. Mehrere Aspekte dieses Protokolls verbessern seinen Nutzen. Die Patienten sind in der Regel vor dem Tod gut charakterisiert, da viele von ihnen von Neurologen in unserem Zentrum gefolgt wurden. Ein kritischer Schritt ist die Verarbeitung von Gewebespenden kurz nach dem Tod, was die Qualität des gefrorenen Gewebes im Vergleich zu einigen anderen Gehirnbanken erhöht. Dies ermöglicht molekulare Studien, die bei der Beschreibung von Veränderungen in transkriptionellen und translationalen Genprodukten von großem Wert sind, die für die Substantiation histologischer und immunzytochemischer Beobachtungen unerlässlich sind. Die Nutzung morphologischer/immunozytochemischer und molekularer Daten in mehreren Fällen erhöht die Zuverlässigkeit von Schlussfolgerungen. Dies zeigt sich am besten in unserer Beschreibung von mitochondrialen Genveränderungen in der Großhirnrinde und neuronalen Genveränderungen in demyelinierten Hippocampi. Neuartige Genprofilierungsprotokolle werden schnell entwickelt und das gefrorene Gewebe in unserer Bank sollte hochwertige RNA für Gewebe- und Einzelzellanalysen liefern.
Ein weiterer wertvoller Aspekt unseres Protokolls sind die kurzfixierten Gehirnscheiben. Diese Gewebe werden in 30 m dicke, frei schwebende Abschnitte geschnitten. Diese Abschnitte sind ideal für die Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um zwei oder mehr Antigene in drei Dimensionen zu analysieren. Gute Beispiele sind die Wechselwirkung von vormyelinierenden Oligodendrozytenprozessen mit dystrophischen Axonen bei chronischen MS-Läsionen sowie die Identifizierung einzelner axonaler Verbindungen zu transektierten axonalen Retraktionsbirnen. Dies steht im Gegensatz zur routinemäßigen Verwendung von 7 m dicken Paraffinabschnitten, bei denen 3D-Bilder nicht möglich sind. Paraffin-eingebettete Gewebe haben einen großen Wert für einige Fragen, insbesondere die Quantifizierung der neuronalen Dichten in hemisphärischen 7-m-dicken Abschnitten. Unsere Gewebeverarbeitungsprotokolle sind daher vielfältig und bieten Flexibilität, um festes und schnell eingefrorenes Gewebe zu gewährleisten.
Ein weiteres einzigartiges Merkmal unseres Protokolls ist die postmortale In-situ-Gehirn-MRT. Hirn-MRTs sind ein unersetzlicher Biomarker der MS-Krankheit. Es ist daher wichtig, die pathologischen Korrelationen von abnormen MRT-Signalen zu ermitteln. Unsere Studien haben ergeben, dass sowohl T2- als auch T2T1MTR-ROIs oft myeliniert sind. Dieser Befund unterstützt die Notwendigkeit spezifischerer bildgebender Verfahren, die zuverlässig zwischen myelinierter und demyelinierter zerebraler weißer Materie unterscheiden. MRT scheint empfindlich für den Nachweis von Myelin zu sein, aber unsere Studien zeigen, dass selbst eine Kombination von T1/T2/MTR nicht spezifisch für die Identifizierung der Myelination ist. Unser Postmortem-Protokoll bietet eine ideale Plattform, um die Fähigkeit neuer bildgebender Verfahren zu testen, um zwischen myelinierter und demyelinierter zerebraler weißer Materie zu unterscheiden. DIE MRT ist auch das ideale Instrument für die Umsetzung grundlegender wissenschaftlicher Ergebnisse in die klinische Praxis, da SIE MRT in unserer translationalen Forschung einsetzen und sie bei lebenden Patienten weit verbreitet sind.
Während das Schneiden von kurz- und langfesten sowie gefrorenen Scheiben einen Vorteil für die Verarbeitung von Gewebe in verschiedenen Modi für verschiedene Studien bietet, gibt es einige Einschränkungen mit dieser Methode. Die Bewertung der Gesamtheit einer Struktur kann eingeschränkt sein, da Teile davon auf benachbarten Slices unterschiedlich verarbeitet werden können. Das große Volumen der Gewebebank bietet jedoch die Möglichkeit, eine Struktur von Interesse in mehreren Probanden zu untersuchen, um die Probenahme zu verbessern. Eine weitere allgemeine Einschränkung für Studien, die postmortale Gewebe verwenden, ist, dass sie Querschnittsmittel sind. Schlussfolgerungen zum Zeitpunkt und zum Fortschreiten der Veränderungen müssen in diesem Zusammenhang interpretiert werden. Es kann eine Selektionsverzerrung für Patienten geben, die ihr Gewebe spenden, was die Verallgemeinerung der Daten auf alle Patienten mit MS beschränken kann. Da die meisten Spender an Komplikationen fortgeschrittener MS sterben, ist es möglicherweise nicht angemessen, die Befunde dieser Patienten auf die Inden früherer MS-Stadien zu extrapolieren. Nichtsdestotrotz haben wir Gewebe von jüngeren Patienten erhalten, die an nicht-MS-bedingten Erkrankungen starben (d. h. akuter Myokardinfarkt, Drogenüberdosierung, Selbstmord). Der Anwendungsbereich unseres Protokolls umfasst nicht die Probenahme anderer Organe (z. B. Magen-Darm- und Knochenmark), die an MS beteiligt waren. Wir glauben, dass die Stärken des Programms seine Grenzen bei weitem überwiegen.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken auch Dr. Christopher Nelson für die redaktionelle Unterstützung. Das Autopsieprogramm wird teilweise durch R35 Grant NS097303 an BDT unterstützt. Die Arbeit im Labor für RD wird durch Stipendien von NINDS (NS096148) und der National Multiple Sklerose Society, USA (RG 5298) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
| Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
| Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
| HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
| Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30 µm free floating. RRID: AB_2313661 |
| Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
| Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
| Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
| Reagents | |||
| 125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
| Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
| Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400 mL/2 L Cryoprotection solution. |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
| Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
| Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2 g/2 L Sorenson's buffer. |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8 g/2 L Sorenson's buffer. |
| Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352 g/2 L Sorenson's buffer. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
| VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1,000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
| Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
| Equipment | |||
| 3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
| 7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |
References
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