Summary
Klasse 1 Histon deacetyltransferase (hdacs) som rpda har fået betydning som potentielle mål for behandling af svampeinfektioner. Her præsenterer vi en protokol til den specifikke berigelse af TAP-Tagged RpdA kombineret med en HDAC aktivitet assay, der tillader in vitro effekt testning af Histon histondeacetylase hæmmere.
Abstract
Klasse 1 histondeacetylaser (HDACs) som RpdA har fået betydning som potentielle mål for behandling af svampeinfektioner og for genomudvinding af svampe sekundære metabolitter. Inhibitor screening kræver dog rensede enzym aktiviteter. Da klasse 1-deacetylaser udøver deres funktion som multiproteinkomplekser, er de normalt ikke aktive, når de udtrykkes som enkelt polypeptider i bakterier. Derfor, endogene komplekser skal isoleres, som, når konventionelle teknikker som ion udveksling og størrelse udelukkelse kromatografi anvendes, er besværlig og tidskrævende. Tandem affinitet rensning er blevet udviklet som et værktøj til at berige multi protein komplekser fra celler og dermed viste sig at være ideel til isolering af endogene enzymer. Her giver vi en detaljeret protokol for enkelt-trins berigelse af aktive RpdA komplekser via det første rensningstrin af C-terminally TAP-Tagged RpdA fra Aspergillus nidulans. De oprensede komplekser kan derefter anvendes til den efterfølgende inhibitor screening, der anvender en histondeacetylase-analyse. Protein berigelsen sammen med den enzymatiske aktivitetsanalyse kan gennemføres inden for to dage.
Introduction
Histone deacetylaser (HDACs) er Zn2 +-afhængige hydrolytiske enzymer, der kan fjerne acetylgrupper fra lysinrester af histoner og andre proteiner. På baggrund af sekvens ligheden grupperes HDACs i flere klasser1. For nylig, svampe klasse 1 HDAC RpdA, en ortholog af bageri gær (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, viste sig at være afgørende for den opportunistiske svampe patogen Aspergillus fumigatus2. Derfor har RpdA fået betydning som et potentielt mål for behandling af svampeinfektioner2. Vurdering af histondeacetylase aktivitet in vitro er vigtig for karakterisering af enzymatiske egenskaber og gør det muligt at bestemme effekten af nye stoffer til inhibitor udvikling. Selv om rekombinant udtryk for en codon-optimeret version af human HDAC1 i Escherichia coli er blevet rapporteret for nylig3, forsøg på at udtrykke fuld længde rpda i denne vært mislykkedes4. Da svampe klasse 1-HDACs såsom RpdA og HosA udøver deres funktion som multiproteinkomplekser, er det desuden gunstigt at anvende indfødte endogene komplekser til forsøg med enzymatiske inhibitorer. På grund af hæmmende faktorer og tilstedeværelsen af forskellige HDAC'er i svampe lysater er katalytisk aktivitet målt i hele protein ekstrakter imidlertid relativt lav og kan ikke henføres til individuelle enzymer. Desuden identificerede tidligere undersøgelser i filamentøse svamp a. nidulans en klasse 2 HDAC, hdaa, som fremherskende histondeacetylase i kromatografiske fraktioner af svampe ekstrakter. Der er således behov for flere konventionelle kromatografiske rensningstrin for at adskille ikke-HdaA-aktivitet fra svampe stammer4. Introduktionen af en TAP-strategi (tandem Affinity oprensning) i A. nidulans5 har mindsket berigelsen af specifikke histondeacetylase-aktiviteter betydeligt. Det oprindelige TAP-tag består af to protein A-domæner og et calmodulinbindende peptid (CBP) adskilt af en tobak etch virus proteasehæmmere (TEV) spaltnings sted6. Dette giver mulighed for native rensning og eluering af mærkede proteiner, herunder deres interaktions partnere7. Ved brug af de berigede proteiner til aktivitets analyser er den milde eluering under de oprindelige forhold ved proteasespaltning et vigtigt træk ved rensning af TAP-tag. Et GFP-mærket protein, for eksempel, kan beriges ved immobiliserede antistoffer samt, dog, kan ikke elueres under indfødte forhold.
Her giver vi en detaljeret protokol for enkelt-trins berigelse af aktive RpdA komplekser via det første rensningstrin af C-terminally TAP-Tagged RpdA fra a. nidulans (IgG separation og TEV spaltning) til efterfølgende inhibitor screening, der anvender en Histon-histondeacetylase-assay. Som vist sig at være tilstrækkelig, affinitet berigelse var begrænset til blot et rensningstrin også fordi den enzymatiske aktivitet blev signifikant reduceret efter to-trins TAP rensning sammenlignet med IgG rensning alene.
Ikke desto mindre bør den indførte protokol også gælde for tilsætning af andre mærkede enzymer, der er involveret i kromatin regulering såsom acetyltransferaser, methyltransferaser og demethylaser. Ved at tilføje det andet rensningstrin i TAP-protokollen kan proteiner, der er co-renset med de kodede lokkemad, betragtes som komplekse partnere af (nye) enzymatiske komplekser.
Protocol
1. dyrkning af et. nidulans
- Klargøring af inokulum
Bemærk: alle trin bortset fra inkubationen skal udføres under et laminært flow kabinet.- Stribe ud TAP stamme (f. eks TIB 32.12) fra glycerol bestanden (-80 °c) på glucose/xylose minimalt medium (gxmm; pr. liter: 10,0 g glucose, 0,5 g xylose, 10 ml 1 M di-ammonium tartrat opløsning, 20 ml 50 × saltopløsning [pr. liter: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2po4, 1 mL chloroform], 1 ml 1.000 × Hutners sporstoffer8) inklusive 1,5% (w/v) agar og de nødvendige kosttilskud som beskrevet af Todd et al. 20079. Inkubeter i 2 – 3 dage ved 37 °C.
Bemærk: TIB 32.1 indeholder en Rpda:: Tap-fusion, der styres af en xylose-inducerbar promotor, xylp(p)10. Dette er grunden til xylose er inkluderet i ovenstående opskrift. Udelade xylose, når dyrkning stammer udtrykker konstruktioner, der ikke er under Xylp(p) kontrol. - Der tilberedes et sterilt 1,5 mL centrifugeglas med 1,5 mL steril nåle-/ophængs opløsning (CSS; 0,9% (w/v) NaCl, 0,01% (v/v) Polysorbat 80).
- Våd en engangs inokulations sløjfe i CSS, skrabe off nåle fra pladen fra trin 1.1.1 og suspendere i røret fra trin 1.1.2.
- Overfør 150 μL hver af nåleopslæmning til 10 25 cm2 cellekultur kolber med udluftnings hætte indeholdende GXMM agar, herunder kosttilskud og 200 μl CSS.
- Nåle skive suspensionen spredes i kolberne ved hjælp af en steril inokulations sløjfe, og kolberne inkuieres ved 37 °C i 2 – 3 dage.
- Brug 10 mL CSS pr. kolbe til høst af nåle. Opløsningen hældes i en kolbe, og kolben lukkes tæt med den leverede skruehætte, og Kolben rystes kraftigt.
- Efter befugtning af svampe overfladen, skrabes de resterende nåle helt ud med en steril inokulations sløjfe.
- Nåle gennem 40 μm celle sier anbringes på et sterilt 50 ml centrifugeglas og opslæmning af fem kolber i ét rør.
- Røret centrifugeres ved 1.000 × g i 10 min.
- Supernatanten decant og resuspension af pellet i 10 mL CSS pr. rør.
- Saml begge suspensioner i ét rør, skyl det tomme rør med 40 mL CSS, tilsæt suspensionen, og centrifuge som beskrevet i trin 1.1.9.
- Supernatanten desutrerer, og nåle skive pillen resuspenderes i 4 mL CSS.
- Der fremstilles to serielle 1:50 fortyndinger af nåle skive suspensionen, og antallet af nåle i den resulterende 1:2, 500-fortyndet suspension bestemmes med et tælle kammer som beskrevet11.
- Stribe ud TAP stamme (f. eks TIB 32.12) fra glycerol bestanden (-80 °c) på glucose/xylose minimalt medium (gxmm; pr. liter: 10,0 g glucose, 0,5 g xylose, 10 ml 1 M di-ammonium tartrat opløsning, 20 ml 50 × saltopløsning [pr. liter: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2po4, 1 mL chloroform], 1 ml 1.000 × Hutners sporstoffer8) inklusive 1,5% (w/v) agar og de nødvendige kosttilskud som beskrevet af Todd et al. 20079. Inkubeter i 2 – 3 dage ved 37 °C.
- Vækst og høst af mycelier
- Mens der arbejdes under et laminært flow kabinet, inokuleres 4-6 en-liters koniske kolber, der hver indeholder 250 mL GXMM, herunder passende kosttilskud med en densitet på 5 × 106 conidia/ml og inkube ved 180 rpm ved 37 °c i 14 – 16 timer.
- Anbring oste kluden i en tragt oven på en kolbe, og Filtrer mycelier gennem kluden. Vask kortvarigt med deioniseret vand.
- Fjern så meget fugt som muligt ved at klemme mycelier fanget i oste kluden mellem først hænderne og derefter papirhåndklæder.
- Overfør den tørrede mycelier som flade ark til et plastik bægerglas med et skrue låg og flash fryse med flydende nitrogen. Dette sikrer et højt område/volumen forhold for følgende lyofiliserings proces.
- Opbevar den frosne mycelier ved-80 °c før lyofilisering.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. - Lyophilize mycelier natten over.
- Stop fryse tørringsprocessen, når mycelier-temperaturen forbliver konstant (18 – 24 timer). Fjern bægre og forsegl straks med de leverede skruehætter.
Bemærk: når tætsluttende, lyofiliseret mycelier kan opbevares i flere uger ved rt.
2. enkelt trin berigelse af TAP-Tagged HDAC (tilpasset fra Bayram et al. 2012)12
- Klargøring af buffere og opløsninger
Bemærk: Tilsæt 2-mercaptoethanol (EtSH) og proteasehæmmere til buffere umiddelbart før brug. Filtrer alle buffere, der anvendes til kromatografi gennem 0,22 μm nitrocellulose membraner for at undgå tilførsel af urenheder/forureninger til kromatografi harpiks. Instruktioner i nedenstående trin refererer til forberedelsen af 1 L af hver buffer. Opbevar buffere ved 4 °C.- Ekstraktions buffer (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- 12,35 g af Tris-HCl, 2,62 g tris (fri base) og 13,2 g NaCl opløses i 800 mL afioniseret vand, og der tilsættes 10 mL 10% (v/v) TX-100 opløsning.
- Kontrollér pH ved RT, og Juster til pH 7,5 med enten NaOH eller HCl [5 M], hvis det er nødvendigt.
- Der skal dannes op til 1 L og filtreres gennem en 0,22 μm nitrocellulose membran.
- Der tilsættes 35 μL EtSH pr. 100 mL buffer (5 mM slutkoncentration) umiddelbart før brug.
- Vaskebuffer 250 (WB250): 250 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Forbered WB250 som beskrevet for B250 (2.1.1), men med 3,59 g Tris-HCl og 2,08 g tris (fri base).
- Vaskebuffer 150 (WB150): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Forbered WB150 som beskrevet for B250 (2.1.1), men med 3,59 g Tris-HCl, 2,08 g tris (fri base) og 8,77 g NaCl.
- TEV ækvilibrerings buffer (TEB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Samme som WB150, men tilsæt EDTA til 0,5 mM slutkoncentration.
- TEV-kavaler buffer (TCB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) glycerol, 5 mM EtSH.
- Forbered som beskrevet i trin 2.1.1 med 3,59 g Tris-HCl, 2,08 g tris (fri base) og 8,77 g NaCl og tilsæt 100 mL glycerol, inden lydstyrken justeres til 1 L.
- 50 × proteasehæmmer cocktail: 1 tablet af en kommercielt tilgængelig cocktail af proteasehæmmere opløses i 1 mL vand og opbevares ved-20 °C.
- TBS-T: 50 mM Tris-HCl pH 7,6 (RT), 0,9% (w/v) NaCl, 0,1% (v/v) Polysorbat 20.
- Forbered dig som beskrevet i trin 2.1.1. Der anvendes 6,06 g Tris-HCl, 1,40 g tris (fri base), 9 g NaCl og 1 mL Polysorbat 20.
- 5 × LSB (prøve buffer til laemmli): 315 mm Tris-HCL pH 6,8 (RT), 25% (v/v) etsh, 50% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) bromphenolblåt blåt.
- Ekstraktions buffer (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Fremstilling af proteinekstrakt
- Tilsæt 1,5 g lyofiliseret mycelier og en slibe kugle i slibe krukken på en kugle mølle.
Bemærk: frisk mycelier kan også anvendes. Når du gør det, tør mycelier så grundigt som muligt før frysning og sørg for at precool slibe krukker i flydende kvælstof til slibning frisk mycelier. - Grind mycelier til pulver ved 25 Hz i 30 s.
Bemærk: i tilfælde, hvor der ikke er en slibemaskine til rådighed, skal du male mycelier til et pulver ved hjælp af en mørtel og Pestle, som beskrevet af Bayram et al. 12. i. - Overfør mycelialt pulver til et 15 mL centrifugeglas.
- Hæld centrifugeglasset, herunder jord mycelier, for at tillade efterfølgende blanding af mycelier med buffer.
- Tilsæt 6 mL iskold B250 herunder 1 × proteasehæmmer cocktail pr. gram mycelialt pulver og blend med en lille spatel indtil fuldstændig homogenisering af den rå ekstrakt er opnået. Når du bruger frisk mycelia, henvises til Bayram et al. 12 for at opnå den rette biomasse til udvinding buffer ratio.
- Hold røret på is i 5 min.
- Røret og en balance slange anbringes i en centrifuge og centrifugeres ved 40.000 × g i ≥ 20 min ved 4 °c. Udfør ækvilibrering af IgG harpiks (trin 2,3) under centrifugeringen.
- Efter centrifugering fjernes 10 μL af supernatanten til SDS-PAGE-analyse. Prøven anbringes i et 1,5 mL rør, der indeholder 40 μL vand og 12,5 μL 5 × LSB; benævnt "ex" i figur 1.
- Tag forsigtigt supernatanten (renset lysbillede) ud ved hjælp af en serologisk pipette, og overfør den til den kolonne, der indeholder de ækvibrerede IgG perler (trin 2.3), og tæt ved hjælp af den leverede endehætte.
- Tilsæt 1,5 g lyofiliseret mycelier og en slibe kugle i slibe krukken på en kugle mølle.
- Ækvilibrering af IgG-harpiks (udført under trin 2.2.7)
- Der tilberedes en 10 mL engangs kromatografikolonne og pipet 300 μL velresuspenderet IgG harpiks (50% gylle) i kolonnen. Fyld kolonnen op til 10 mL med B250 og lad bufferen flyde gennem tyngdekraften.
- Tilsæt 1 mL B250 inklusive 1 × proteasehæmmer cocktail og lad flow igennem. Sæt bunden af kolonnen.
- Batch rensning af TAP-Tagged HDAC
- Kromatografi søjlen, der indeholder de ækvilibrerede perler og det ryddede lyspunkt, inkuperes fra trin 2.2.9 på en roterende mixer ved 10 rpm ved 4 °C i 2 – 4 timer.
- Efter batch binding, fjerne hætten og åbne kolonnen i bunden for at indsamle gennemstrømningen.
- Tag en prøve til SDS-PAGE analyse som beskrevet i trin 2.2.8; benævnt "FT" i figur 1.
- Vask perler med 10 mL WB250. Brug først 1 mL buffer til at fjerne indfangede perler fra kolonne hætten ved hjælp af en pipette, og Overfør denne suspension i en flush til den fastsatte harpiks for at tillade opslæmning af perlerne. Fyld derefter kolonnen op til toppen, Luk ved hjælp af en stak hætte og forbind til en peristaltisk pumpe. Juster en strømningshastighed på ca. 1 – 5 mL/min. undgå, at harpiksen løber tør.
- Gentag trin 2.4.4 tre gange for i alt fire skyller med WB250.
- Vask perler tre gange med 10 mL TEB som beskrevet i trin 2.4.4.
- Kromatografi søjlen lukkes i bunden, gensuspenderes IgG-perler i 1 mL TCB, og der tilsættes 20 μL 50 × proteaseinhibitor-cocktail samt 10 ΜL TEV (~ 1 mg/ml lager, S219V mutant variant produceret in-House).
- Kolonnen cap og inkube på en roterende mixer ved 10 rpm ved 4 °C natten over for at eluere de protein komplekser bundet via den mærkede HDAC.
Bemærk: Alternativt kan du udføre TEV-Digest ved forhøjet temperatur (16 – 25 °C), hvilket reducerer reaktionstiden, men øger risikoen for proteinnedbrydning. - På den næste dag åbnes kolonnen, og Eluatet opsamles i et 2 mL centrifugeglas. Brug 0,7 mL TCB til at fjerne perler fra hætten og skyl kolonnens væg.
- Kolonnen anbringes på det åbne 2 mL-rør fra det foregående trin, som selv er anbragt i et 50 mL-centrifugeglas.
- Overfør denne samling til en bordplade centrifuge og spin ved 300 × g i 2 min. Dette er den TEV eluat.
Bemærk: når du udfører tandem-affinitet, skal du bruge TEV-eluatet som input til calmodulin-affinitet. Du kan også opdele TEV-eluatet og bruge én del til bestemmelse af HDAC-aktivitet og den anden del til at fuldføre TAP-rensningen. - Fjern 50 μL fra TEV-eluatet, og tilsæt 12,5 μL 5 × LSB til SDS-PAGE (kaldet "TE" i figur 1 og 2), og opbevar det resterende eluat på is.
- For at vurdere effekten af proteaseeluering tilsættes 2 mL 5% (v/v) eddikesyre, og der inkueres ved RT i 5 min. Igen, brug den første mL til at resuspendere harpiksen.
- Opsaml syre eluatet og tag igen 50 μL prøve og tilsæt 12,5 μL 5 × LSB (refereret til som "AE" i figur 1). LSB bliver gul, når den tilsættes til den sure opløsning. For at neutralisere syren tilsættes 10 M NaOH i trin på 1 μL og blandes godt, indtil farven skifter til blå igen.
- Genækvilibrér IgG-harpiks med TBS-T for at neutralisere syren. Harpiksen opbevares i TBS-T/20% (v/v) ethanol ved 4 °C til genbrug med det samme mærkede protein.
- Opbevaring af eluering fraktioner
- Alikvot elueres i ~ 100 μL fraktioner for at undgå flere fryse tø-cyklusser.
- Frys aliquoter i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C.
Bemærk: prøver opbevaret på denne måde vil være stabile i månedsvis uden at miste enzymatisk aktivitet.
3. analyse af rensning ved SDS-PAGE og Western blotting
- Brug standardprotokoller til støbning af SDS-polyacrylamidgels eller brug præfabrikerede geler13. Denature gel prøver fra det foregående afsnit ved 95 °C i 5 min., centrifugeres ved ≥ 15.000 × g i 5 min, og belastningen på 12% geler. De anbefalede laste volumener er angivet i forklaringen til figur 1. Electrophorese prøverne i 1 × Tris-Glycine SDS-side kører buffer på 180 V konstant for 60 – 70 min, indtil bromphenolblåt blå markør af SDS-Page loading buffer begynder at migrere ud af gelen.
- Brug standardprotokoller for sølvfarvning af gels. Brug for eksempel protokollen af Blum et al. 198714 dette er også kompatibelt med MS-analysen.
- Brug standardprotokoller for Western blotting15. Til generering af repræsentative resultater nedenfor blev der anvendt et kommercielt tilgængeligt blotting system.
- Probe klatter med kommercielt tilgængelige anti-calmodulin binding protein (anti-CBP) antistof i 5% (w/v) mælkepulver i TBS-T ved 4 °c natten.
Bemærk: anti-CBP-antistoffer er rettet mod den del af TAP-tagget, der stadig er til stede efter TEV-spaltning. - Brug standardprotokoller til påvisning og udvikling af blots. For eksempel blev anti-kanin IgG-alkalisk fosfatasekonjugat og et BCIP/NBT-farve udviklings substrat anvendt til generering af repræsentative resultater nedenfor.
4. deacetylase-assay ved brug af in vitro [3H] acetat-mærkede kyllingetretikuulocyt-histoner (tilpasset fra Trojer et al. 2003)4
- Der henvises til protokollen til Kölle et al. 199816 til fremstilling af [3H] acetat-mærkede kyllinge reticulocyt histoner.
- Pr. analyse betingelse anbringes tre 1,5 mL centrifugeglas på is til målinger i triplicater. Også forberede tre rør til buffer-only baggrundskontrol.
- Der sættes 25 μL WB150 i hvert rør, og der tilsættes 25 μL af TEV-eluatet fra trin 2.4.11 og opbevares på is.
- Forvarm en rørinkubator til 25 °C.
- Brug 15 s intervaller (stopur) til tilsætning af 10 μL mærkede histoner [1,5 mg/mL] til hvert rør.
- Før du påbegynder analysen, skal du tage 10 μL af [3H] acetat-mærkede kyllinge histoner og starte stopuret.
- Fem sekunder efter starten, tilføje de mærkede histoner, lukke røret stramt, vortex, og sætte det ind i inkubator.
- Brug 15 s intervaller til tilsætning af 10 μL mærkede histoner og Fortsæt som beskrevet i det foregående trin.
- Efter 60 min inkubation tilsættes 50 μL stopopløsning (1 M HCl/0,4 M eddikesyre) til hvert rør i 15 s intervaller. vortex med det samme. Efter tilsætning af den sure opløsning er analyse blandingen stabil og kan opbevares ved RT indtil næste trin.
- Der tilsættes 800 μL ethylacetat til hvert rør for at udtrække den frigivne [3H] eddikesyre.
- Tæt lukke rørene og vortex hvert rør til 5 s.
- Røret anbringes i en mikrocentrifuge og centrifugeres ved 10.000 × g i 10 min ved rt.
- I mellemtiden skal der tilberedes et scintillationsglas pr. analyseprøve, og der tilsættes 3 mL scintillationscocktail til hydrofobe prøver.
- Efter centrifugering (trin 2,12) overføres der forsigtigt 600 μL af den øvre organiske fase til de tilberedte scintillationsrør, og rørene lukkes tæt.
- Mål den radioaktivitet, der svarer til HDAC-aktiviteten i en flydende scintilllation-tæller.
Representative Results
Et typisk resultat af den præsenterede enkelt trins berigelse af RpdA er vist i figur 1 (benævnt "IgG"). For fuldstændighedens skyld har vi også inkluderet flow-through og eluering fraktioner ("CFT" og "CE"), der illustrerer det andet rensningstrin med en calmodulin harpiks ("CaM") som beskrevet12. Den viste sølvfarvede gel (a) illustrerer tydeligt effekten af det første affinitet trin, der er endnu større, når man udfører tandem rensning. De fleste fremtrædende proteiner, der findes i protein ekstrakten og gennemstrømningen, er dog allerede udtømt i TEV-eluatet (TE). Det er vigtigt at bemærke, at TEV eluering fraktioner er > 100 × koncentreret i forhold til ekstrakt og gennemstrømning. Asteriskerne markerer mærket RpdA (Sammenlign panel B). Den beregnede MW RpdA, herunder CBP (RpdA:: CBP) er 82 kDa, men proteinet migrerer ved en meget højere tilsyneladende molekylvægt på ca. 120 kDa. Dette fænomen er blevet observeret tidligere og kan henføres til de specifikke egenskaber af sin C-Terminus4,17. Immunoblot (B) viser stærke signaler, der migrerer ved ca. 120 kDa svarende til CBP-mærkede rpda (rpda:: CBP) i TEV eluat ("te"), calmodulin flow-through ("CFT") og eluat ("CE") fraktioner. I syre eluatet ("AE") er et andet signal med en lidt større MW synlig. Dette repræsenterer andelen af TAP-Tagged RpdA bundet til IgG harpiks, der ikke blev frigivet af TEV spaltning. Forskellen i størrelse svarer til 16 kDa af proteinet en gentagelse af uncleaved RpdA:: TAP. Som forventet kunne ingen bands detekteres af anti-CBP-antistoffet i vildtype-kontrol fraktioner (panel B, "Wild type").
Resultaterne af en repræsentativ histondeacetylase-aktivitetsanalyse med den specifikke HDAC-hæmmer trichostatin A (TSA) vises i figur 2. Denne analyse blev oprindeligt udviklet til planter18 og er også blevet anvendt til inhibitor screening mod pattedyrs deacetylaser19,20. De histoner, der blev anvendt til analysen, blev mærket og forberedt som beskrevet16. Virkningen af stigende koncentrationer af TSA på den katalytiske aktivitet af det berigede RpdA-kompleks ("TE ± TSA") vises. Følsomheden af aktiviteten bekræfter, at målte CPM værdier faktisk skyldes RpdA og ikke forårsaget af uspecifik proteaseaktivitet. Dette er en vigtig observation, da det indikerer, at TEV, som er til stede ved temmelig høj koncentration, ikke forstyrrer HDAC-aktivitets analysen. For at tildele målt HDAC aktivitet til RpdA blev en Wild-type stamme anvendt som negativ kontrol ("Co"). Som forventet blev der kun påvist marginal HDAC-aktivitet (ca. 5-10% af de RpdA-berigede fraktioner) i TEV-eluatet af den vilde type. Det er interessant, at HDAC-aktiviteten reduceres signifikant efter det andet affinitet rensningstrin ("CE") sammenlignet med TEV-eluatet.
Figur 1. Tandem Affinity purificaftap-Tagged RpdA. Der vises en sølvfarvet 10% SDS-polyacrylamidgel (a) og en vestlig blot sonde med anti-CBP-antistof (B). Lane mærkning og indlæst volumener er som følger: "M": 2 μl af 1:10 fortyndet ufarvet protein markør (sølv bejdses), 3,5 μl forbejdset protein markør (Western blot); "Ex": prøve af proteinekstrakt som fremstillet i trin 2.2.8 (2 μl af 1:10 fortynding, 5 μl); "FT": IgG harpiks gennemstrømnings prøve som fremstillet i trin 2.4.3 (2 μl af 1:10 fortynding, 5 μl); "AE": syreeluat af trin 2.4.14 (10 μl, 10 μl); "TE": TEV-eluat af natten eluering ved TEV spaltning, Step 2.4.12 (10 μl, 10 μl); "CFT": calmodulin gennemstrømning (20 μL, 20 μL); "CE": calmodulin eluat (10 μL, 10 μL). Størrelsen af udvalgte markør proteiner er angivet på venstre side af panelerne. De mængder, der gives i parentes, svarer til prøve belastninger for henholdsvis sølv bejdsen og Western blot. Asterisker i den sølvfarvede gel angiver RpdA-fusions proteinet. Immunoblot (B) blev påvist med alkalisk fosfatase ved hjælp af bcip/NBT-farve udviklingssystemet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. HDAC-aktivitetsanalyse under stigende koncentrationer af trichostatin A. Effekten af RpdA-hæmning blev testet med 25 μL affinitet-renset rekombinant RpdA ("TE") og 25 μL af 0, 10, 50 og 500 nM af HDAC-hæmmeren TSA fortyndet i RPMI-1640 medium. RPMI blev brugt til at vurdere baggrundsaktivitet ("blank"). Aktiviteterne i det endelige eluat efter det andet calmodulin-affinitet ("CE") og en ukodet stamme efter det første affinitet rensningstrin (negativ kontrol, "Co") vises. Aktiviteter vises som procent af beriget RpdA uden TSA (100%, "TE"). Fejllinjer angiver standardafvigelsen for tre replikater. Dette tal er blevet ændret fra Bauer et al. 20162. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver en enkelt trins berigelse af en Tap-Tagged klasse 1 HDAC fra filamentøse svamp a. nidulans til vurdering af in vitro histondeacetylase aktivitet. TAP-mærket blev oprindeligt introduceret i bageri gær til identifikation af protein-protein interaktion partnere af det mærkede protein6. Efterfølgende blev tagget codon-optimeret til brug i A. nidulans5. Her giver vi en ligetil trin-for-trin protokol til anvendelse af det første affinitet rensningstrin i TAP strategi for enkelt-trins berigelse af klasse 1 HDAC RpdA. Det andet affinitet rensningstrin øger klart rensningsniveauet, hvilket er særlig vigtigt for identifikationen af agn-interagerende proteiner. Ikke desto mindre anbefales kun det første trin til efterfølgende aktivitets test, da manglen på signifikant kontaminering efter det første trin blev bekræftet af et kontrolforsøg med en vildtype stamme. Desuden er elueret aktivitet betydeligt højere efter enkelt trin berigelse sammenlignet med den fulde TAP. Ud over RpdA2, blev denne protokol også med held brugt til at rense A. nidulans komplekser af anden klasse 1 HDAC hosa21.
På grund af vores observationer, at svampe klasse 1 HDACs opbygge stabile komplekser4, er det lykkedes os at ændre protokollen ved Bayram et al. 201212 , der repræsenterer grundlaget for denne metode. Ikke desto mindre skal der nævnes nogle kritiske skridt. Fremstilling af stærkt koncentrerede protein ekstrakter for at sikre nær-fysiologiske forhold er afgørende for kompleks stabilitet. Derfor er det vigtigt at tænke på de givne anbefalinger vedrørende biomasse/udvinding buffer ratio. I denne henseende, det er også afgørende at bruge godt jorden fine mycelial pulvere for at sikre korrekt udvinding. Her er brugen af en slibemaskine klart fordelagtig. Som nævnt i protokollen afsnit, er det værd at prøve TEV-Cleavage trin for 1-2 h ved stuetemperatur for at fremskynde rensningen. Dette blev testet for RpdA uden at observere nogen skadelige virkninger på stabiliteten (ikke offentliggjorte observation, Bauer I, 2018). Desuden er udskiftning af NP40 (anvendes i den oprindelige protokol) med TX-100 måske ikke egnet til andre protein komplekser. Når du bruger denne metode til rensning af andre TAP-mærkede proteiner, bør man også henvise til Bayram-protokollen, som indeholder en rækkeværdi fulde hints, der kan være nyttige for en tilstrækkelig rensning af andre protein komplekser12.
Ud over de her beskrevne Tap-metode, andre affinitet Tags og teknikker er almindeligt anvendt til enkelt-trins berigelse af protein af filamentøse svampe, herunder hans-og gfp-Tags. Da klasse 1 HDACs generelt er funktionelle som højmolekylære komplekser, er Native elutions betingelser imidlertid en forudsætning for berigelse af katalytisk aktive HDACs. Vigtigere, mange andre affinitet purifikationer udføres under ugunstige forhold. For eksempel er tilsætning af HDACs via GFP-Trap, som er baseret på antigen-antistof-interaktion, ikke egnet på grund af de sure elueringsforhold, der forstyrrer protein-protein interaktionen mellem HDAC-komplekser, der er bundet til harpiks. Desuden medførte forsøg på at rense hans-mærkede RpdA med metalchelataffinitet kromatografi22, et betydeligt tab af katalytisk aktivitet under rensningsproceduren, selv om imidazol i stedet for lav-ph-betingelser blev anvendt til eluering ( ikke-offentliggjorte data, Bauer, I, 2010).
En begrænsning af den beskrevne enzymatiske assay-protokol er brugen af det radioaktive substrat. Men, analyser på et fluorescerende grundlag er blevet udviklet så godt23,24 og er kommercielt tilgængelige. Disse analyser udføres i brønd plader og er derfor også velegnede til screening af HDAC-hæmmere med høj dataoverførselshastighed. I så fald ville en opskalere af den præsenterede procedure være påkrævet.
Potentielle kommende anvendelser af denne protokol omfatter berigelse af specifikke sub-komplekser af klasse 1 HDACs til at vurdere deres specifikke fysiologiske roller og/eller forskelle i deres følsomhed over for HDAC-hæmmere. Ved fastlæggelsen af den beskrevne metode for andre enzymer anbefales det kraftigt at udføre et negativt kontrol eksperiment med en ukodet stamme. Dette sikrer specificitet af målte enzym aktiviteter og afslører kontaminering med ikke specifikt bundne enzymer.
Rensnings-og aktivitets analysen, der beskrives her, kan udføres inden for to dage, og de berigede enzymer er stabile i mindst flere måneder, når de opbevares i aliquoter ved-80 °C. Afslutningsvis, denne protokol giver en forholdsvis enkel og omkostningseffektivmåde at opnå klasse 1 HDAC komplekser til aktivitet måling og bestemmelse af inhibitor virkning.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Petra Merschak, afdelingen for molekylær biologi (Biocenter, Medical University of Innsbruck), for hendes hjælp og støtte til dette manuskript. Derudover vil vi gerne takke korrekturlæserne for deres værdifulde kommentarer.
Dette arbejde blev finansieret af den østrigske videnskabs fond (P24803 til SG og P21087 til GB) og af murene finansiering (MUI start, ST201405031 til Ib).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
| 2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
| 25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
| 47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
| AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
| Acetic acid | Roth | 7332 | |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
| Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
| BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
| Cell strainer | Greiner | 542040 | |
| Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
| EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
| Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
| Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
| Glycerol | Roth | 3783 | |
| HCl | Roth | 4625 | |
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
| Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
| KOH | Merck | 5033 | |
| Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
| Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NaOH | Roth | 6771 | |
| Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
| Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
| Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
| peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
| Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
| Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
| Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
| Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
| Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
| Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
| Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
| Tris (free base) | Serva | 37190 | |
| Tris-HCl | Roth | 9090 | |
| Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
| Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
| TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |
References
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. -M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338 (1), 17-31 (2004).
- Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7 (6), (2016).
- Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40 (9-10), 1355-1363 (2018).
- Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31 (14), 3971-3981 (2003).
- Bayram, Ö, et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320 (5882), 1504-1506 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66 (11), 4810-4816 (2000).
- Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Bayram, Ö, et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15 (4), 323-331 (1998).
- Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21 (2), 345-353 (2010).
- Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L. Characterization of pea histone deacetylases. Plant Molecular Biology. 11 (6), 857-866 (1988).
- Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (14), 6259-6265 (2014).
- Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (20), 6046-6056 (2006).
- Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10 (1), 61-68 (2003).
- Peng, L., Yuan, Z., Seto, E. Histone deacetylase activity assay. Methods in Molecular Biology. 1288, 95-108 (2015).
