Summary

In vivo intracerebral Stereotaxiske injektioner til Optogenetisk stimulering af langtrækkende indgange i musehjerne skiver

Published: September 20, 2019
doi:

Summary

Denne protokol beskriver et sæt af metoder til at identificere celle typen specifik funktionel konnektivitet af langtrækkende input fra fjerntliggende hjerneområder ved hjælp af optogenetiske stimuleringer i ex vivo hjerne skiver.

Abstract

Viden om celle-typespecifikke synaptiske tilslutningsmuligheder er en afgørende forudsætning for at forstå hjernen-dækkende neuronal kredsløb. Den funktionelle undersøgelse af langtrækkende forbindelser kræver målrettede optagelser af enkelt neuroner kombineret med den specifikke stimulering af identificerede fjerne indgange. Dette er ofte vanskeligt at opnå med konventionel og elektrisk stimulation teknikker, fordi axoner fra konvergerende opstrøms hjerneområder kan blande sig i målregionen. Den stereotaxiske målretning af en specifik hjerneregion for virus medieret ekspression af lysfølsomme Ionkanaler muliggør selektiv stimulering af axoner, der kommer fra denne region med lys. Intracerebral stereotaxiske injektioner kan anvendes i veldefinerede strukturer, såsom den forreste thalamic kerner, foruden andre subkortikale eller kortikale områder i hele hjernen.

Beskrevet her er et sæt af teknikker til præcis stereotaxisk injektion af virale vektorer udtrykker channelrhodopsin i muse hjernen, efterfulgt af foto stimulation af Axon terminaler i hjernen skive forberedelse. Disse protokoller er enkle og almindeligt anvendelige. I kombination med hel-celle patch clamp optagelse fra en postsynaptisk forbundet Neuron, foto stimulation af axoner tillader påvisning af funktionelle synaptiske forbindelser, farmakologisk karakterisering, og evaluering af deres styrke. Desuden kan biocytinel fyldning af den indspillede neuron anvendes til post-hoc morfologiske identifikation af den postsynaptiske neuron.

Introduction

Det er nødvendigt at definere konnektivitet mellem hjerneregioner for at forstå neurale kredsløb. Klassiske anatomiske sporingsmetoder gør det muligt at etablere interregionale tilslutningsmuligheder, og læsions undersøgelser er med til at forstå den hierarkiske organisering af informationsstrømmen. For eksempel, hjerne kredsløb for rumlig orientering og hovedretning signalering involverer den retningsbestemte strøm af oplysninger fra thalamus til formodbiculum. Dette er blevet påvist ved læsions studier af Antero-dorsale thalamic kerner (ADN), der nedbryder hovedretningen signal i nedstrøms dorsale formodbiculum, samt parahippocampale gittercelle signal1,2.

Den funktionelle konnektivitet mellem hjerneområder er vanskeligere at etablere på et cellulært og subcellulært niveau. I hippocampus, en meget organiseret anatomi gør det muligt at undersøge pathway-specifikke synaptiske forbindelser ved hjælp af elektrisk simulering i Skive forberedelse. Stimulerings elektroder placeret i Stratum radiatum af Carnot kan bruges til specifikt at stimulere Schaffer-sikkerhedsstillelse fra3. Stimulering af elektroder placeret i Stratum lacunosum moleulare af Carnot vil aktivere stien Path-indgangen til4,5. Elektrisk stimulation aktiverer neurotransmitter frigivelse fra Axon terminaler; men det aktiverer neuroner med somata nær stimulerings stedet samt axoner passage. Det er derfor af begrænset brug for at studere afferenter fra definerede hjerneområder, når fibre af forskellige regioner i oprindelse blander sig i målstrukturen, som det typisk er tilfældet i neocortex.

Neuroner kan også stimuleres med lys. Optiske metoder omfatter fotoaktivering af bur glutamat, som kan kombineres med en-eller to-foton Laserscanning. Flere tæt fordelt steder kan stimuleres sekventielt, uden mekaniske skader på vævet6. Dette er blevet brugt med succes til at kort synaptisk receptorer samt aktivere individuelle neuroner7. Mens glutamat-uncaging kan bruges til lokal kredsløbsanalyse, giver det ikke mulighed for specifik aktivering af langtrækkende indgange.

En metode til valg til undersøgelse af langtrækkende konnektivitet i neuronal kredsløb er brugen af virus-medieret channelrhodopsin udtryk. Brug in vivo stereotaxiske injektioner som beskrevet her, kan ekspression af lys-gated ion kanaler målrettes og rumligt begrænses til en ønsket hjerneregion. På denne måde, channelrhodopsins er effektive til kortlægning excitatoriske eller hæmmende tilslutningsmuligheder fra en region til sit mål. Transfected axoner terminaler kan stimuleres med lys i en hjerne skive forberedelse, og patch-klemme optagelser som en læse-out tillade undersøgelse af de funktioner og styrker af specifikke kredsløb komponenter i hjernen8. Den optogenetiske tilgang kombineret med stereotaxisk injektion af en virus giver enestående specificitet og genetisk kontrol9. Stimulering med lys giver desuden mulighed for både høj tidsmæssig og rumlig præcision10,11.

Den formodbiculum er en seks-lags kortikale struktur ved overgangen af hippocampus og para-hippocampale dannelse12,13. Det modtager vigtige synaptiske input fra ADN11 , men også fra flere andre kortikale og subkortikale regioner14. Således er selektiv stimulering af thalamic axoner terminaler inden for en formodnings skive ikke mulig med elektrisk stimulation eller glutamat-ondning. Beskrevet i denne protokol er metoder til at bestemme funktionelle forbindelser mellem hjernen regioner (ADN og formodbiculum) ved hjælp af præcise stereotaksisk injektioner af virale vektorer udtrykker lys-gated kanaler. Også beskrevet er foto stimulation af axoner terminaler af projicerende neuroner i deres målregion, kombineret med hele cellen patch-clamp optagelser af post-Synaptic neuroner i hjernen skive forberedelse.

Protocol

Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med det europæiske rådsdirektiv (2010/63/EU) og godkendt af den etiske komité i Paris Descartes Universitet. Eksperimentatoren skal indhente tilladelse til proceduren for at overholde lokale regler. 1. planlægning af eksperimentet Definer det hjerne område, der skal målrettes. Bestem de stereotaxiske koordinater på injektionsstedet ved hjælp af en musehjerne Atlas15. For den rigtige Antero-dorsale tha…

Representative Results

Den procedure, der præsenteres her, blev brugt til at udtrykke en blå lys-følsom channelrhodopsin (Chronos) smeltet til gfp i Antero-dorsal kernen af thalamus (ADN), ved stereotaxisk injektion af anterograd adeno-associeret virus. De stereotype koordinater blev bestemt i henhold til et muse-hjerne Atlas og afprøvet ved injektion af 200 nL fluorescerende Tracer fluoro-Ruby. Dyret blev ofret 10 min efter injektionen, og hjernen blev ekstraheret og fikseret natten over. Coronal Brain sektioner var parat til at undersøg…

Discussion

In vivo viral injektion til at udtrykke lysfølsomme opsynder i et defineret hjerne område er en valgmetode til optogenetiske analyse af langtrækkende funktionelle tilslutningsmuligheder10,11,17,18. Stereotaxiske injektioner giver mulighed for præcist at målrette et bestemt område af hjernen. Coexpression af en opsin med en fluorescerende reporter bekvemt gør det muligt at evaluere den ve…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Bertrand Mathon, mérie Nassar, Li-Wen Huang, og Jean simonnet for deres hjælp i udviklingen af tidligere versioner af stereotaksisk Injection Protocol og Marin manuel og Patrice Jegouzo for teknisk hjælp. Dette arbejde blev støttet af det franske ministerium for uddannelse og forskning (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) og Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).

Materials

0.5 mm bur  Harvard Apparatus 724962
10 µL Hamilton syringe Hamilton 1701 RN – 7653-01
10X PBS solution Thermofisher Scientific AM9624  text
36% PFA Sigma-Aldrich F8775
470 nm LED  Cairn Research P1105/470/LED  DC/59022m use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP 
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Penn Vector Core AV-5-PV3446 lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 
All chemicals Sigma
Bath temperature controler Luigs & Neumann SM7 Set at 34°C 
beveled metal needle Hamilton 7803-05 33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors Dahle Allround 50038
Biocytin Sigma B4261 final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries Havard Apparatus GC150-10 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller Sutter Instruments P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack Thermofisher Scientific 28372
butterfly needle for perfusion Braun  Venofix A 24G
CCD Camera Andor  DL-604M
Confocal Microscope Zeiss LSM710 20X
curved forceps FST  11011-17
CY5 configuration (confocal) Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 
CY5 configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI Sigma D9542
DAPI configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A Axon Instruments
Digital handheld optical meter ThorLabs PM100D Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight Nightsea DFP-1 excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA Sigma E4368 final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse TE-2000E 10 or 20X
Filter paper Whatman
Fluoro-Ruby 10% Millipore AG335 disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate Physitemp HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml Sanofi 5 ml vial
HEPES Sigma H3375 final 10 mM
High speed rotary micromotor kit Foredom K.1070 maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator A-M Systems 2100
KCl Sigma P4504 final 1,2 mM
Ketamine 1000 Virbac
Ketofen 10% Merial 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine) MSD 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery Photonic (via Phymep) 10044
LED Power Supply Cairn Research OptoLED Light Source
Manipulators Luigs & Neumann SM-7
Mg-ATP 2H20 Sigma A9187 final 4 mM
MgCl2 Sigma 63069 final 2 mM
Micro temperature controler Physitemp MTC-1
Milk powder Carnation
MultiClamp 700B Axon Instruments
Na Phosphocreatine Sigma P7936 final 10 mM
Na3-GTP 2H20 Sigma G9002 final 0.4 mM
needle holder/hemostat FST 13005-14
pClamp acquisition software Axon Instruments
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3 14-16 on the display for 2-3 ml/min 
Potassium gluconate (K-gluconate) Sigma G4500 Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium Thermofisher Scientific P36390
Rompun 2% (xylazine) Bayer
small scissors FST 14060-09
Sodium chloride 0.9%  Virbac dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT VWR 630-1584
Stereotaxic frame with digital display Kopf Model 940 Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate Life technologies  434315
Streptavidin-Cy5 conjugate Thermofisher Scientific S32357
Superglue3 Loctite Dutscher 999227 1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid Ethicon F3210
Syringe pump kdScientific Legato 130 – 788130 Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer Leica VT1200S speed 0.07, amplitude 1.
tubing Gilson F117942, F117946 Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope Olympus BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper Nalgene

References

  1. Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
  2. Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
  3. Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
  4. Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
  5. Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
  6. Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
  7. Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
  8. Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
  9. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
  10. Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
  11. Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
  12. Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
  13. Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
  14. Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
  15. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
  16. Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
  17. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
  19. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
  20. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
  21. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  22. Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).

Play Video

Cite This Article
Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).

View Video