Summary
Este protocolo describe un conjunto de métodos para identificar la conectividad funcional específica de tipo celular de entradas de largo alcance de regiones cerebrales distantes utilizando estimulaciones optogenéticas en rebanadas cerebrales ex vivo.
Abstract
El conocimiento de la conectividad sináptica específica de tipo celular es un requisito previo crucial para comprender los circuitos neuronales de todo el cerebro. La investigación funcional de conexiones de largo alcance requiere registros específicos de neuronas individuales combinadas con la estimulación específica de entradas distantes identificadas. Esto es a menudo difícil de lograr con las técnicas de estimulación convencionales y eléctricas, porque los axones de las áreas cerebrales ascendentes convergentes pueden entremezclarse en la región objetivo. La orientación estereotaxcde de una región cerebral específica para la expresión mediada por virus de canales iónicos sensibles a la luz permite la estimulación selectiva de axónes procedentes de esa región con luz. Las inyecciones estereoónicas intracerebrales se pueden utilizar en estructuras bien delimitadas, como los núcleos talámicos anteriores, además de otras áreas subcorticales o corticales en todo el cerebro.
Aquí se describe un conjunto de técnicas para la inyección estereoopónica precisa de vectores virales que expresan la cifrodonina en el cerebro del ratón, seguido de la fotoestimulación de los terminales de axón en la preparación de la rebanada del cerebro. Estos protocolos son simples y ampliamente aplicables. En combinación con la grabación de abrazaderas de parche de células enteras de una neurona conectada postsinánicamente, la fotoestimulación de los axons permite la detección de conexiones sinápticas funcionales, caracterización farmacológica y evaluación de su fuerza. Además, el llenado de biocitetina de la neurona registrada se puede utilizar para la identificación morfológica post-hoc de la neurona postsináptica.
Introduction
Definir la conectividad entre las regiones cerebrales es necesario para entender los circuitos neuronales. Los métodos clásicos de rastreo anatómico permiten establecer la conectividad interregional, y los estudios de lesiones ayudan a entender la organización jerárquica del flujo de información. Por ejemplo, los circuitos cerebrales para la orientación espacial y la señalización de la dirección de la cabeza implican el flujo direccional de información desde el tálamo hasta el presubiculum. Esto ha sido demostrado por estudios de lesiones de núcleos talámicos antero-dorsales (ADN) que degradan la señal de dirección de la cabeza en el presubiculo dorsal aguas abajo, así como la señal celular de la red parahipocampal1,2.
La conectividad funcional entre las áreas cerebrales es más difícil de establecer a nivel celular y subcelular. En el hipocampo, una anatomía altamente organizada permite investigar conexiones sinápticas específicas de la vía utilizando la simulación eléctrica en la preparación de la rebanada. Los electrodos de estimulación colocados en el estrato radiato de CA1 se pueden utilizar para estimular específicamente la entrada colateral de Schaffer de CA33. Los electrodos estimulantes colocados en el lacunos molecular e estrato de CA1 activarán la entrada de trayectoria perforante a CA14,5. La estimulación eléctrica activa la liberación de neurotransmisores de los terminales de axón; sin embargo, activa las neuronas con somata cerca del sitio de estimulación, así como axones de paso. Por lo tanto, es de uso limitado para el estudio de afferents de regiones cerebrales definidas cuando las fibras de diferentes regiones de origen se entremezclan en la estructura objetivo, como es típicamente el caso en el neocórtex.
Las neuronas también pueden estimularse con luz. Los métodos ópticos incluyen la fotoactivación del glutamato enjaulado, que se puede combinar con el escaneo láser de uno o dos fotones. Múltiples sitios estrechamente espaciados pueden ser estimulados secuencialmente, sin daño mecánico al tejido6. Esto se ha utilizado con éxito para mapear receptores sinápticos, así como activar las neuronas individuales7. Mientras que el desafiamiento de glutamato se puede utilizar para el análisis de circuitos locales, no permite la activación específica de entradas de largo alcance.
Un método de elección para la investigación de la conectividad de largo alcance en circuitos neuronales es el uso de la expresión de canalizarpsina mediada por virus. Utilizando inyecciones estereotaxócicas in vivo como se describe aquí, la expresión de canales iónicos bloqueados por la luz puede ser dirigida y restringida espacialmente a una región cerebral deseada. De esta manera, las clasrodoninas son eficaces para mapear la conectividad excitatoria o inhibitoria de una región a su objetivo. Los terminales de axón transfectó pueden estimularse con luz en una preparación de corte cerebral, y las grabaciones de abrazaderas de parche como una lectura permiten el examen de las funciones y fortalezas de los componentes específicos del circuito en el cerebro8. El enfoque optogenético combinado con la inyección estereotaxia de un virus ofrece una especificidad sin precedentes y un control genético9. Estimular con la luz además permite una alta precisión temporal y espacial10,11.
El presubiculum es una estructura cortical de seis capas en la transición del hipocampo y la formación para-hipopótamo12,13. Recibe importantes aportaciones sinápticas del ADN11, pero también de varias otras regiones corticales y subcorticales14. Por lo tanto, la estimulación selectiva de terminales de axones talámicos dentro de una rebanada presubicular no es posible con la estimulación eléctrica ni el desatonación de glutamato. En este protocolo se describen métodos para determinar la conectividad funcional entre las regiones cerebrales (ADN y presubiculum) utilizando inyecciones estereoofócicas precisas de vectores virales que expresan canales de luz cerrada. También se describe la fotoestimulación de los terminales de axón de las neuronas que se proyectan en su región objetivo, junto con las grabaciones de abrazaderas de parche de células enteras de las neuronas postsinápticas en la preparación de la rebanada del cerebro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea (2010/63/UE) y aprobados por el comité de ética de la Universidad Paris Descartes. El experimentador debe obtener autorización para el procedimiento para cumplir con las regulaciones locales.
1. Planificación del experimento
- Defina el área del cerebro a la que se va a seleccionar. Determinar las coordenadas estereotaxica del lugar de inyección con la ayuda de un atlas cerebral de ratón15. Para el núcleo talámico antero-dorsal derecho (ADN), las coordenadas son: -0,82 posterior, 0,75 laterales, -3,2 de profundidad (mm) en relación con bregma. Es posible que sea necesario ajustar las coordenadas para animales de diferentes edades, sexo o tensión.
- Confirmar y documentar la exactitud de las coordenadas inyectando un trazador fluorescente (150 a 300 nL) observable con un microscopio de epifluorescencia en un experimento piloto(Figura 1A,B).
- Defina el tipo de virus que se va a inyectar. Almacene el virus en alícuotas de 6 l a -80 oC según lo recomendado por el productor. Lleve 1 alícuota colocada en hielo a la sala de cirugía, para la inyección de uno a seis animales en un día dado. Las regulaciones de bioseguridad para el uso de AAV pueden depender del país o institución, y el uso de una campana PSM 2 puede ser necesario.
NOTA: Aquí, utilizamos un serotipo AAV2/5 que expresa Chronos, una variante rápida channelrhodospin-2, fusionada a proteína fluorescente verde bajo el control del promotor Synapsin: AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH.
2. Cirugía estereotaxica
- Instale un bastidor estereotaxico equipado con un soporte de bomba en un banco de laboratorio estándar estable. Ajuste el estescopio para ver claramente la zona donde se colocará la cabeza del animal. Utilice una fuente de luz LED para la iluminación. Gire el estereoscopio para acceder al soporte de la bomba, que no es necesario para los primeros pasos de la cirugía.
- Instale una jeringa Hamilton de 10 l equipada con una aguja metálica biselada de 33 G en el soporte de la bomba. Pruebe el sistema de eyección con agua.
- Anestetizar un ratón C57BL6 de 4 a 5 semanas de edad con una inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina y xilazina (100 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente). Preparar una mezcla de 1 ml de ketamina y 0,5 ml de xilazina en 8,5 ml de 0,9% de NaCl. Esto dará lugar a 10 mg/ml de ketamina y 1 mg/ml de xilazina en la mezcla. De esta mezcla, inyectar por vía intraperitoneal de 10 ml por gramo del peso corporal del animal. La duración de la anestesia es de aproximadamente 1 h.
- Verifique que el animal esté bien anestesiado con un pellizco en el dedo del pie. Luego, extraiga la lengua para facilitar la respiración. Afeitar el cabello craneal.
- Inyectar 20 l de clorhidrato de lidocaína (4 mg/ml; 2 mg/kg) debajo de la piel de la cabeza para la anestesia local y esperar 5 minutos para que comience el efecto. Para evitar daños oculares debidos a la sequedad, cúbralos con pomada oftálmica tópica.
- Para exponer el cráneo, cree un corte recto en el cuero cabelludo con tijeras de cirugía pequeñas. Coloque el animal en un marco estereotaxico, insertando las barras de los oídos ligeramente rostral a la oreja real para descansar sobre el hueso y tirar hacia abajo de la piel, lo que debe crear un buen acceso al cráneo. Apriete en su lugar. Instale la pieza de la nariz.
- Mantener el cuerpo del animal horizontalmente a nivel de la cabeza utilizando un soporte ajustado por altura. Coloque una almohadilla de calentamiento debajo del ratón para mantenerla a temperatura fisiológica.
- Limpie el cráneo aplicando 0.9% NaCl con un hisopo de algodón para eliminar el tejido blando del hueso. Use el estereoscopio para el resto de la cirugía.
- Ajuste el cráneo de modo que el eje bregma-lambda esté nivelado, moviéndose hacia arriba o hacia abajo de la nariz y la pieza de los dientes. Esto requiere medidas iterativas de bregma y lamba, ya que ambas cambiarán tras el ajuste del nivel de la nariz.
- Encuentre la ubicación del lugar de inyección en el cráneo. Ajuste la aguja de inyección por encima del lugar de inyección de acuerdo con las coordenadas posteriores y mediales y marque el cráneo con una aguja desechable. Mueva la aguja de inyección hacia arriba 4 cm.
- Utilice una rebaba de 0,5 mm con un taladro para realizar una craneotomía de 1 mm de diámetro en la marca, a la mitad de la velocidad máxima. Swab eventual sangrado con un pañuelo de papel.
- Vacíe el agua contenida en la jeringa de Hamilton para almacenarla expulsándola completamente con la bomba. Sólo la aguja seguirá llena de agua. La aguja se lava entre cada uso con agua desionizada pura. No se requiere esterilización.
- Tome la alícuota del virus que se va a utilizar para este día. Asegúrese de que la solución viral ya no esté congelada pero que haya permanecido enfriada (cerca de 0 oC, sobre hielo). Sólo retire brevemente del hielo para obtener 700 nL con un micropipeta para volúmenes pequeños. Deposite la gota en una pieza de 5 cm x 5 cm de película de parafina. Evite crear burbujas. Vuelva a colocar la solución viral restante en hielo.
NOTA: El volumen de caída debe ser mayor que el volumen de inyección deseado (700 nL para 200 nL inyectados). Esto dará un margen de seguridad en caso de que parte del líquido se pierda durante la transferencia y permite realizar una pequeña eyección de la prueba (paso 2.16) antes de proceder. - Coloque la película de parafina encima de la craneotomía. Sumerja la aguja en la gota de solución viral sin cambiar la posición anteroposterior y lateral.
- Utilice la función "retirar" de la bomba para llenar la jeringa con unos 500 nL de solución viral desechada en la película de parafina. Haga esto bajo control visual (estereoscopio), vea desaparecer la caída y asegúrese de no aspirar aire.
- Asegúrese de que la jeringa se ha llenado correctamente. Verifique el funcionamiento del sistema de eyección conduciendo por el émbolo para probar expulsar una pequeña gota de líquido de 50 nL bajo control visual. Limpie la gota.
- Inserte la aguja en el cerebro a la profundidad elegida, girando la perilla que controla el eje dorso-ventral del aparato estereotaxico en el sentido de las agujas del reloj. Pulse el botón "ejecutar" (velocidad de 15 nL/min por volumen de 150 nL inyectado). Un pequeño volumen (50-300 nL, dependiendo del virus utilizado) se expulsa lentamente durante 10 minutos con una bomba automática.
- Espere 10 minutos después de la inyección para evitar fugas del lugar de inyección. A continuación, retire lentamente la aguja durante 3-5 minutos girando la perilla que controla el eje dorso-ventral en sentido antihorario.
- Gire la parte vertical del marco estereotaxico con la jeringa lejos del animal. Lave inmediatamente la aguja con agua destilada limpia llenándola varias veces, para evitar obstrucciones. Almacene la jeringa llena de agua.
- Retire el ratón del marco estereotaxico. Sutura la piel con filamento de sutura de poliamida 4-0. Hacer tres o cuatro stiches, atado con 2-1-1 nudos quirúrgicos estándar.
- Coloque el ratón en una jaula climatizada hasta que despierte completamente de la anestesia, y proporcione agua y alimentos empapados en un plato DePetr colocado en el suelo. Si la fuente de calor está debajo de la jaula, utilice una rejilla espaciadora para evitar el sobrecalentamiento.
NOTA: De acuerdo con las directrices locales, se puede aplicar una dosis única de ketoprofeno (2-5 mg/kg, por vía subcutánea) o buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, por vía subcutánea) para prevenir el dolor. - Cuando el animal esté completamente despierto, devuélvalo a su jaula de origen y controle su bienestar, especialmente al día siguiente de la inyección. Compruebe si hay signos de dolor. Si se observa alguna modificación del comportamiento, el animal se pesa para controlar su peso corporal.
- Dependiendo del virus utilizado, el tiempo para la expresión completa puede variar. Aquí, permitimos 3 semanas para la expresión de AAV5. Syn.Chronos-GFP.
3. Soluciones para grabaciones agudas de rebanadas y fijación
- Preparar soluciones de stock de 10x solución de corte concentrado (125 mM NaCl, sacarosa de 25 mM, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, y 2,5 mM de D-glucosa) y solución de fluido artificial espinal (ACSF) (124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, y 11 mM D-glucosa) en agua desionizada pura antes de los experimentos de electrofisiología. Almacene estas soluciones a 4 oC en botellas de 1 L sin CaCl2 y MgCl2.
- El día del experimento, diluir las soluciones de stock de solución de corte y ACSF 10x a un volumen final de 0,5 L cada una. Agitar con un agitador magnético y oxigenar burbujeando con 95%/5% O2/CO2. Añadir iones divalentes para obtener concentraciones finales de 0,1 mM CaCl2 y 7 mM MgCl2 para la solución de corte, y 2 mM CaCl2 y 2 mM MgCl2 para ACSF.
- Preparar la solución de pipeta a base de potasio-gluconato para contener: 135 mM de K-gluconato, 1.2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 4 mM MgATP, 0.4 mM Tris-GTP, 10 mM Na2-fosfocreatina, y 2.7–7.1 mM biocitina para células post-hoc morfología. Ajuste el pH de la solución a 7,3 y la osmolaridad a 290 mOsm. Conservar 1 ml de alícuotas a -20oC.
- Preparar 0,1 M PBS diluyendo bolsas de polvo de mezcla seca BupH PBS en 500 ml de agua destilada, lo que resulta en 0,1 M de fosfato sódico, 0,15 M NaCl, pH 7,2.
- Para preparar 1 L de 4% de solución de PFA, diluir 111 ml de 36% de PFA líquido y 90 ml de solución de 10pbS en agua destilada.
- Preparar una solución de sacarosa al 30% que contenga 150 g de sacarosa en 500 ml de 0,1 M PBS.
4. Preparación de rebanadas cerebrales
- Prepare el espacio del banco con papel de banco absorbente antes de la perfusión.
- Instale un goteo de aproximadamente 1 m por encima del banco para la perfusión alimentada por gravedad. Coloque una aguja de mariposa de 24 G.
- Rodear la cámara de corte del vibratome con hielo y almacenarlo en un congelador.
- Anestetizar el ratón con inyección intraperitoneal de la misma mezcla de ketamina-xilazina utilizada para la cirugía. Evalúe la etapa de la anestesia pellizcando el dedo del dedo del dedo del el doel con fórceps. Cuando esté completamente dormido, inyecte 100 ml de heparina (5000 U.I./ml) por vía intraperitoneal.
- Fije al animal con cinta adhesiva en el papel absorbente, acostado boca atrás. Abra la jaula torácica cortando las costillas en los lados izquierdo y derecho con tijeras pequeñas, desde el diafragma hacia arriba. Mantenga abierta la jaula torácica con la ayuda de cinta adhesiva.
- Sujetar la aorta descendente con un hemostat y perfumar a través del ventrículo izquierdo del corazón con 4oC enfriados y oxigenados (95%/5% O2/CO2), cortando la solución a través de la aguja de mariposa de 24 G. Después de 5 s, abra la aurícula derecha con tijeras pequeñas.
- Después de 5 min de perfusión, cuando los órganos están sin sangre, detener la perfusión. Decapita al animal con tijeras grandes e infunde la cabeza en una solución de corte enfriada y oxigenada a 4oC en un plato De Petri.
- Para extraer el cerebro, corta la piel del cuello a la nariz, luego secciona las últimas vértebras del cráneo con tijeras. Retrate manualmente la piel y usa pequeñas tijeras para abrir el cráneo, cortándola a lo largo de la línea media, de caudal a rostral, hacia arriba hasta entre los ojos.
- Retire cuidadosamente el hueso parietal y la parte caudal del hueso frontal con fórceps curvados o óseos. Extrae el cerebro con una pequeña espátula redondeada insertando el instrumento entre el cerebro y el suelo craneal, seccionando el bulbo olfativo, el nervio óptico y otros nervios craneales, y el cerebelo.
- Sumerja suavemente el cerebro en una solución de corte helada (4oC) en un vaso de precipitados. Coloque el cerebro en papel filtrante para secar suavemente la superficie cortical. Pega la corteza cerebral al soporte de la muestra de un vibratome, con el lado caudal mirando a la hoja, con el fin de cortar rebanadas cerebrales horizontales.
- Llene la cámara de corte con solución de corte oxigenada helada para que el cerebro esté completamente infusionado. Haga un corte en el hemisferio izquierdo (contralateral hacia el lado inyectado) para evitar una posible ambiguedad izquierda-derecha en las rodajas.
ADVERTENCIA: Oxigene siempre la solución y proteja las rodajas de la exposición a la luz. - Corte las rodajas de 300 m de espesor con el vibratomo, a una velocidad de 0,07 mm/s a una amplitud de 1 mm. En esta etapa, se recomienda comprobar brevemente la expresión Chronos-GFP en el tálamo utilizando una linterna fluorescente (440-460 nm) y las gafas de filtro correspondientes (paso largo de 500 nm).
- Aísle la región del hipocampo con un bisturí y transfiérala a una cámara colocada en un vaso de precipitados lleno de baño calentado (34 oC), oxigenado (95%/5% O2/CO2) ACSF.
- Después de 15 minutos, saque la cámara del baño de agua caliente y deje reposar las rodajas a temperatura ambiente, todavía oxigenada durante al menos 45 minutos hasta su uso.
5. Grabación de abrazadera de parche de celda completa
- Transfiera suavemente una rebanada cerebral que contenga el complejo del hipocampo con una pipeta de transferencia de vidrio hecha a medida a la cámara de grabación montada en un microscopio vertical. Una pipeta de transferencia está hecha de una pipeta Pasteur acortada (diámetro interior 6,5 mm) unida a una bombilla de pipeta de goma. Perfunde continuamente la cámara de grabación (3 mL) con 34oC (calentado) ACSF burbujeado con 95%/5% O2/CO2. Ajuste la velocidad de la bomba peristáltica a 2-3 ml/min.
- Examine brevemente la expresión Chronos-GFP en terminales de axón en la región de interés con iluminación LED azul (470 nm) y observe con un objetivo 4x. La fluorescencia GFP se visualiza a través de un filtro de emisión adecuado, con una imagen de cámara CCD mostrada en la pantalla de un ordenador.
- Coloque un ancla de rodaja hecha de un alambre de platino en forma de U con cuerdas de nylon estrechamente espaciadas ("arpa") en la rebanada para mantenerla.
- Cambia a un objetivo de inmersión de 63x y ajusta el enfoque. Compruebe si hay axons que expresen Chronos-GFP y elija una neurona piramidal para la grabación de parches.
- Mueva el objetivo hacia arriba.
- Tire de pipetas con un tirador de electrodo Brown-Flaming de vidrio borosilicato. El tirador está configurado para producir pipetas con aproximadamente 1 m de diámetro de punta. Llene las pipetas con una solución interna basada en K-gluconato.
- Monte la pipeta en el soporte de la pipeta en el cabezal. Baje la pipeta en la cámara y encuentre la punta debajo del objetivo. La resistencia de las pipetas debe estar entre 3-8 M. Aplique una ligera presión positiva con una jeringa para ver un cono de solución saliendo de la pipeta y bajando progresivamente la pipeta y el objetivo a la superficie de la rebanada.
- Parchear la célula en la configuración de la abrazadera de voltaje: acercarse a la neurona identificada y presionar delicadamente la punta de la pipeta en el soma. La presión positiva debe producir un hoyuelo en la superficie de la membrana. Suelte la presión para crear un sello giga-ohm (>1 G de resistencia). Una vez sellado, ajuste la tensión de retención a -65 mV. Romper la membrana con un pulso agudo de presión negativa: esto se logra mediante la aplicación de una fuerte succión a un tubo conectado al soporte de la pipeta.
- Registre en modo de abrazadera de corriente de células enteras las respuestas de la neurona a los pasos de corriente hiperpolarizantes y despolarizantes(Figura 2A).
NOTA: Este protocolo se utilizará para determinar las propiedades intrínsecas activas y pasivas de la celda. Las rutinas MATLAB personalizadas se utilizan para el análisis fuera de línea10,16. - Registro en respuestas postsinápticas de abrazadera de corriente o voltaje a la estimulación LED de campo completo de 475 nm de fibras aferentes que expresan Chronos. Estimular con trenes de 10 estimulaciones de 2 ms de duración a 20 Hz(Figura 2B,C). La intensidad de la luz puede variar de 0,1–2 mW.
NOTA: La intensidad de la luz se midió con una consola eléctrica óptica portátil digital equipada con un sensor de fotodiodo, posicionada bajo el objetivo. Las latencias de respuesta de 2-4 ms son características para una conexión monosináptica. - Para investigar la naturaleza de la transmisión sináptica entre los afferents de largo alcance y la neurona registrada, se pueden utilizar diferentes agentes farmacológicos. Para distinguir farmacológicamente las respuestas directas y monosinápticas de las respuestas indirectas a través de la activación de la red, añada 1 M TTX y 100 M 4-AP al ACSF.
NOTA: Aplicación de baño de bloqueadores de receptores de glutamato permite determinar la naturaleza del neurotransmisor que se libera y la identidad de los receptores postsinápticos. Por ejemplo, los receptores de glutamato de tipo AMPA serán bloqueados por los receptores NBQX (10 M) y NMDA por APV (100 oM). Dependiendo del objetivo del estudio, los protocolos pueden ser concebidos para investigar la dependencia de voltaje de las respuestas sinápticas o dinámicas de respuesta a lo largo del tiempo. - Lavar con la solución original de ACSF para parchear otra célula, o transferir la rebanada que contiene una neurona llena de biocitina en un vial pequeño lleno de 4% PFA.
- Después de la fijación durante la noche en 4% PFA, lavar la rebanada en 0,1 M PBS (2x para 5 min, 1x para 20 min).
- Conservar en 30% de sacarosa a 4oC.
6. Revelación de biocitotina
- Transfiera las rodajas fijas que contienen neuronas llenas de biocitina a una hoja de vidrio en una gota de sacarosa del 30% y realice tres ciclos de congelación-descongelación: coloque la hoja sobre hielo seco desechado en una caja de espuma de poliestireno durante 1 min hasta que las gotas de sacarosa estén completamente congeladas, luego presione la cuchilla contra la palma de la mano para descongelar.
- Lavar la rebanada 3x en 0.1 M PBS (2x durante 5 min, 1x para 1 h y 50 min), suavemente agitado. No exceda las 2 h para el último lavado.
- Preincubar la rodaja a RT durante 2 h en solución tampón agitada que contenga 2% de leche en polvo (0,4 g en 20 ml) para saturar sitios no específicos y 0,5% de Tritón X100 (0,1 ml en 20 ml) para permeabilizar las membranas en 0,1 M PBS.
- Incubar durante la noche a 4 oC en una solución que contenga 2% de leche en polvo, 1% Triton X100, conjugado de esptavidina-Cy5 (1/500) y DAPI (1/1000) en 0,1 M PBS, suavemente agitado.
- Lavar la rebanada tres veces en 0,1 M PBS (2x para 5 min, 1x para 2 h). El último lavado puede durar más tiempo, hasta 4 h, para reducir la tinción de fondo.
- Antes de montar la rebanada, utilice un microscopio de epifluorescencia a 10x de aumento configurado para observar marcadores fluorescentes Cy5 con el fin de identificar el lado de la rebanada que contiene la celda marcada en una cámara llena de PBS.
- Transfiera la rebanada a una cuchilla, de la celda hacia arriba, séquela con un pañuelo de papel y móntela con un medio de montaje de alta resistencia.
- Utilice un microscopio de epifluorescencia con aumento de 10x en la configuración Cy5 y DAPI para examinar la ubicación del cuerpo celular, y en la configuración de GFP para observar los afferents marcados, o un microscopio confocal de alta resolución a 20x para una somática detallada, axonal y morfología dendrítica(Figura 2D,E). La configuración del filtro se detalla en la Tabla de materiales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El procedimiento presentado aquí se utilizó para expresar una canalización sensible a la luz azul (Chronos) fusionada a la GFP en el núcleo antero-dorsal del tálamo (ADN), por inyección estereotaxc de virus asociado al adeno anterogrado. Las coordenadas estereoofócicas se determinaron de acuerdo con un atlas cerebral de ratón y se probaron inyectando 200 nL de fluorador fluorescente fluoro-ruby. El animal fue sacrificado 10 minutos después de la inyección, y el cerebro fue extraído y fijado durante la noche. Se prepararon secciones del cerebro coronal para examinar el lugar de inyección, que se colocó correctamente y se limitó a ADN(Figura 1A,B).
Con el fin de expresar Chronos-GFP en neuronas de ADN, inyectamos 300 nL de AAV5. Tres semanas después de la inyección, se prepararon rebanadas cerebrales horizontales agudas. Figura 1 C muestra una rebanada cerebral que contiene el sitio de inyección talámica en el hemisferio derecho, con expresión de GFP en verde. Tras la inspección con un microscopio de epifluorescencia equipado con un objetivo 4x, se observaron axónes talámicos etiquetados con GFP en el presubiculo(Figura 1C,D). Se observó que los axónicos talámicos inertidos densamente las capas superficiales I y III del presubiculo(Figura 1D).
La actividad de las neuronas presubiculares en la capa III se registró en la configuración de abrazadera de parche de células enteras. Se aplicaron pasos de corriente hiperpolarizantes y despolarizantes durante el registro de las variaciones potenciales de membrana(Figura 2A). Los datos se almacenaron en un ordenador para un análisis posterior fuera de línea de las propiedades de membrana activas y pasivas. Las células principales de capa presubicular III típicamente poseían un potencial de reposo negativo cerca de -63 mV y requerían inyecciones de corriente despolarizante para impulsar el potencial de membrana al umbral de disparo. Se ha publicado una descripción completa de sus propiedades intrínsecas11.
Estimular los terminales de axón ADN que expresan Chronos-GFP elicitaron potenciales excitatorios post-sinápticos (EpsP) en células principales de capa presubicular III en modo de abrazadera actual(Figura 2B). Dependiendo de la intensidad de la luz, los EpsP podrían alcanzar el umbral potencial de acción. También se observaron respuestas postsinápticas en el modo de abrazadera de voltaje, ya que se introdujeron corrientes possinápticas excitatorias (EEPS)(Figura 2C). Las latencias de inicio de las EPSC evocadas por estimulaciones luticulares fueron cortas (mediana, 1,4 ms10),lo que indica un contacto sináptico directo entre los axones talámicos y las neuronas presuiculares de capa III. Los EECEP persistentes en la condición TTX-4AP confirmaron esta activación monosináptica. Cabe destacar que estas células respondieron de forma fiable a las estimulaciones de luz de los axónicos aferentes con un patrón de disparo regular.
Figura 1 : Inyección estereotaxica en el núcleo talámico anterodorsal (ADN). (A) Representación esquemática de la inyección. (B) Confirmación del lugar de inyección con fluororubí en una sección coronal. El ajuste indica el nivel antero-dorsal y la distancia desde bregma. (C) Rebanada horizontal después de la inyección AAV-Chronos-GFP en el tálamo. Se deben observar las proyecciones axonales al presubiculo ipsilateral. Una incisión en el lado izquierdo de la rebanada (indicada por un triángulo negro) marca el hemisferio contralateral. (B, C) Barra de escala 1 mm. (D) Vista ampliada de recuadro en(C) con proyecciones ADN a las capas superficiales presubiculares. Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Neurona presubicular de capa III: propiedades intrínsecas, respuesta a la estimulación lumímica de aferentos talámicos, y revelación post-hoc de morfología celular. (A) Patrón de disparo y variaciones potenciales de membrana de la neurona de capa III para hiperpolarizar y despolarizar los pasos de corriente. (B, C) Respuestas de la neurona de capa III a 2 ms de estimulaciones de luz (barras azules) de axón estalámicos registradas en (B) fijación de corriente y (C) modos de abrazadera de voltaje. (D, E) Neurona piramidal de capa III (blanca, indicada por triángulo amarillo relleno) rodeada de axónes talámicos que expresan Chronos-GFP (verde) en capas superficiales presubiculares con tinción DAPI (azul) en rodaja horizontal con un microscopio de epifluorescencia ( D, barra de escamas a 100 m) y microscopio confocal con un alto aumento(E, barra de escala a 50 m). La celda en (A) se indica con triángulos amarillos rellenos. Una segunda neurona parcialmente llena está presente en esta rebanada indicada con triángulos amarillos vacíos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La inyección viral in vivo para expresar opsins sensibles a la luz en un área cerebral definida es un método de elección para el análisis optogenético de conectividad funcional de largo alcance10,11,17,18. Las inyecciones estereootaxias ofrecen la posibilidad de apuntar con precisión a un área específica del cerebro. La coexpresión de una opsin con un reportero fluorescente permite convenientemente la evaluación de la expresión exitosa y la confirmación del sitio de inyección preciso. El uso del serotipo AAV 2/5 normalmente restringe la expresión a la región cerebral objetivo. De esta manera, una población restringida de neuronas se transinfecta, expresando canales ióniones sensibles a la luz en sus cuerpos celulares y terminales de axón. En los experimentos posteriores de corte ex vivo, es posible estimular estos terminales de axón con pulsos de luz directamente en su área objetivo, mientras se lee la transmisión sináptica exitosa a través de la grabación de abrazadera de parche de una neurona possinánicamente conectada. El protocolo anterior es robusto y conveniente, y algunas notas adicionales pueden ayudar al rendimiento de experimentos exitosos.
Se pueden utilizar diferentes tipos de anestesia. Aquí se describe la inyección intraperitoneal de una combinación de ketamina-xilazina como una anestesia fácil de usar y a corto plazo con conveniente analgesia19. La profundidad y duración de la anestesia pueden variar en cierta medida. En algunos casos, puede ser necesario inyectar otra media dosis de ketamina-xilazina durante el protocolo. La anestesia de isoflurano puede ser una buena alternativa para inducir más rápidamente y controlar mejor la profundidad de la anestesia. Las coordenadas de los sitios de inyección se pueden determinar con la ayuda de un atlas cerebral de ratón. En la práctica, las coordenadas deben probarse y ajustarse, si es necesario.
Las condiciones de trabajo limpias también son clave. Se recomienda utilizar equipo de protección desechable, incluyendo guantes, una gorra de la turba, y una capa de laboratorio. Al colocar el animal en el marco estereotaxico, se debe prestar especial atención a la comodidad del animal, lo que mejorará en gran medida la eficiencia de la anestesia. El cuerpo del animal debe estar alineado con la cabeza y el cuello. El paso más crítico en la colocación del animal y antes de la craneotomía es el ajuste del eje bregma-lambda. Especialmente cuando se apuntan a estructuras cerebrales profundas, incluso una pequeña desviación generará errores al bajar la aguja de inyección en el cerebro. En algunos casos, se puede elegir deliberadamente y calcular una trayectoria de aguja oblicua.
El volumen de inyección es un factor determinante para obtener una expresión de opsinlocalizada localizada con precisión. Un pequeño volumen es ideal para privilegiar una zona de transfección estrechamente restringida. Los volúmenes más altos pueden ser útiles para cubrir toda la extensión de un área objetivo grande. Si es necesario cubrir un área grande, como el tabique18,puede ser útil colocar varias inyecciones pequeñas con un rango de coordenadas vecinas. El intervalo hasta el registro electrofisiológico ex vivo también es crítico. Se hace un tiempo mínimo para la expresión completa. Mientras que 3 semanas parecen ser un retraso óptimo para estos experimentos11, el retraso necesario puede variar dependiendo del virus, su serotipo, y la distancia a la región del cerebro postsináptico.
El enfoque descrito aquí es aún más potente cuando se combina con inyecciones en animales transgénicos. Trabajos anteriores han explotado diferentes líneas de ratón para subtipos de neuronas GABAérgicas, con el fin de apuntar específicamente a las interneuronas fotovoltaicas o sst para las grabaciones de abrazaderas de parche20. El doble registro simultáneo de las neuronas fotovoltaicas y piramidales vecinas o SST y las neuronas piramidales permite la comparación de las fuerzas de las entradas de largo alcance entre dos tipos de neuronas11. Esto produce resultados que están estandarizados con respecto a un tipo de neurona. Esta estandarización es particularmente importante en los casos en que los niveles de expresión de las opsins varían entre diferentes animales o diferentes rodajas.
La salud de las rebanadas es esencial para las grabaciones de abrazaderas de parche de alta calidad. La oxigenación constante de las rodajas es crucial, y una velocidad de corte lenta mejora significativamente la calidad de la superficie de la rebanada. Un espesor de rebanada de 300 m preserva, en cierta medida, la integridad del microcircuito en secciones presubiculares horizontales, incluidas las neuronas piramidales con sus cuerpos celulares, ramificaciones axonales dendríticas y locales, y conexiones sinápticas locales. El tipo de canales bloqueados por la luz elegidos para inducir la activación de fibras aferentes influirá en gran medida en los parámetros de estimulación (duración, intensidad de la luz). Chronos es un canal mirodopsina sensible a la luz azul, y se puede utilizar una amplia gama de longitudes de onda de iluminación para la activación (sensibilidad máxima alrededor de 500 nm, incluso con una intensidad de luz mínima de 0,05 mW/mm2,también activada a 405 nm, y hasta 530 nm21 ). Además, Chronos tiene propiedades cinéticas rápidas en comparación con el Clásico Clásico, que permite estimulaciones de alta frecuencia y activación confiable de proyecciones de largo alcance22. En combinación con la expresión de Chrimson, una variante de opsin de cambio rojo, la excitación óptica independiente de distintas poblaciones neuronales se hace factible.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang y Jean Simonnet por su ayuda en el desarrollo de versiones anteriores del protocolo de inyección estereotaxia y Marin Manuel y Patrice Jegouzo por su ayuda técnica. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio francés de Educación e Investigación (L. R., L. S.), el Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) y agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN - 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 - 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
References
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic. New York. (2013).
- Huang, L. -W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
