इस प्रोटोकॉल पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में optogenetic उत्तेजनाओं का उपयोग कर दूर मस्तिष्क क्षेत्रों से लंबी दूरी की आदानों की सेल प्रकार विशिष्ट कार्यात्मक कनेक्टिविटी की पहचान करने के लिए तरीकों का एक सेट का वर्णन करता है.
सेल प्रकार विशिष्ट synaptic कनेक्टिविटी का ज्ञान मस्तिष्क चौड़ा न्यूरॉन सर्किट को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है. लंबी दूरी के कनेक्शन के कार्यात्मक जांच की पहचान दूर आदानों की विशिष्ट उत्तेजना के साथ संयुक्त एकल न्यूरॉन्स के लक्षित रिकॉर्डिंग की आवश्यकता है. यह अक्सर पारंपरिक और विद्युत उत्तेजना तकनीकों के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, क्योंकि अपस्ट्रीम मस्तिष्क क्षेत्रों converging से axons लक्ष्य क्षेत्र में intermingle हो सकता है. प्रकाश के प्रति संवेदनशील आयन चैनलों के वायरस-मध्यस्थ अभिव्यक्ति के लिए एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र के स्टीरियोटैक्सिक लक्ष्यीकरण प्रकाश के साथ उस क्षेत्र से उत्पन्न axons के चयनात्मक उत्तेजना की अनुमति देता है. इंट्रासेरेब्रल स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का उपयोग अच्छी तरह से सीमांकित संरचनाओं में किया जा सकता है, जैसे कि मस्तिष्क में अन्य subcortical या cortical क्षेत्रों के अलावा, पूर्वकाल थैलेमिक नाभिक।
यहाँ वर्णित वायरल वैक्टर के सटीक stereotaxic इंजेक्शन के लिए तकनीक का एक सेट है माउस मस्तिष्क में channelrhodopsin व्यक्त, मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में एक्सॉन टर्मिनलों के photostimulation द्वारा पीछा किया. इन प्रोटोकॉल सरल और व्यापक रूप से लागू कर रहे हैं. एक postsynaptically जुड़े न्यूरॉन से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन में, axons के photostimulation कार्यात्मक synaptic कनेक्शन का पता लगाने की अनुमति देता है, औषधीय लक्षणीकरण, और उनकी ताकत का मूल्यांकन. इसके अलावा, दर्ज न्यूरॉन के biocytin भरने postynaptic न्यूरॉन के पोस्ट-हॉक रूपात्मक पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
तंत्रिका परिपथों को समझने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच संपर्क को परिभाषित करना आवश्यक है। शास्त्रीय शारीरिक अनुरेखण विधियों से अंतरक्षेत्रीय संपर्क स्थापित करने की अनुमति मिलजाती है, और घाव अध्ययन सूचना प्रवाह के पदानुक्रमिक संगठन को समझने में मदद करते हैं। उदाहरण के लिए, स्थानिक अभिविन्यास और सिर दिशा संकेतन के लिए मस्तिष्क सर्किट presubiculum करने के लिए thalamus से जानकारी के दिशात्मक प्रवाह शामिल है. यह एन्टेरो-डोर्सल थैलेमिक नाभिक (एडीएन) के घाव अध्ययनों द्वारा प्रदर्शित किया गया है जो डाउनस्ट्रीम पृष्ठीय पूर्वउपिकुलम में सिर की दिशा संकेत को नीचा दिखाते हैं, साथ ही पैराहिप्पोकैम्पल ग्रिड सेल संकेत1,2.
मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी एक सेलुलर और subcellular स्तर पर स्थापित करने के लिए और अधिक कठिन है. हिप्पोकैम्पस में, एक अत्यधिक संगठित शरीर रचना विज्ञान टुकड़ा तैयारी में बिजली के अनुकरण का उपयोग कर पथ-विशिष्ट synaptic कनेक्शन की जांच करने के लिए अनुमति देता है। उत्तेजना इलेक्ट्रोड CA1 के स्तर radiatum में रखा विशेष रूप से CA33से Schaffer संपार्श्विक इनपुट को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. CA1 के स्तर lacunosum आणविक में रखा इलेक्ट्रोड उत्तेजक CA14के लिए छिद्रक पथ इनपुट सक्रिय हो जाएगा,5. विद्युत उत्तेजना एक्सॉन टर्मिनलों से न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज को सक्रिय करता है; हालांकि, यह उत्तेजना साइट के पास somata के साथ न्यूरॉन्स के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पारित होने के axons सक्रिय करता है. यह इसलिए परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्रों से afferents का अध्ययन करने के लिए सीमित उपयोग की है जब मूल के विभिन्न क्षेत्रों के फाइबर लक्ष्य संरचना में intermingle, के रूप में आम तौर पर neocortex में मामला है.
न्यूरॉन्स भी प्रकाश के साथ प्रेरित किया जा सकता है. ऑप्टिकल तरीकों में बंदी ग्लूटामेट की फोटो सक्रियण शामिल है, जिसे एक या दो-फोटोन लेजर स्कैनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। एकाधिक बारीकी से अंतरिक्ष साइटों क्रमिक रूप से प्रेरित किया जा सकता है, ऊतक के लिए कोई यांत्रिक क्षति के साथ6. यह सफलतापूर्वक synaptic रिसेप्टर्स नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और साथ ही व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को सक्रिय7. जबकि ग्लूटामेट uncaging स्थानीय सर्किट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह लंबी दूरी की आदानों के विशिष्ट सक्रियण के लिए अनुमति नहीं है.
न्यूरोनल सर्किट में लंबी दूरी की कनेक्टिविटी की जांच के लिए पसंद की एक विधि वायरस मध्यस्थता चैनलहोडोप्सिन अभिव्यक्ति का उपयोग है। यहाँ वर्णित के रूप में विवो stereotaxic इंजेक्शन में प्रयोग, प्रकाश gated आयन चैनलों की अभिव्यक्ति को लक्षित किया जा सकता है और स्थानिक रूप से एक वांछित मस्तिष्क क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित. इस तरह, चैनलहोडोप्सिन एक क्षेत्र से अपने लक्ष्य के लिए उत्तेजक या निरोधात्मक कनेक्टिविटी मानचित्रण के लिए प्रभावी रहे हैं। Transfected axons टर्मिनलों एक मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में प्रकाश के साथ प्रेरित किया जा सकता है, और पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग के रूप में एक पढ़ने के बाहर कार्यों और मस्तिष्क में विशिष्ट सर्किट घटकों की ताकत की परीक्षा की अनुमति8. किसी विषाणु के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन के साथ संयोजित ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण अभूतपूर्व विशिष्टता और आनुवंशिक नियंत्रण 9 प्रदान करताहै. इसके अतिरिक्त प्रकाश के साथ उत्तेजक दोनों उच्च लौकिक और स्थानिक परिशुद्धता के लिए अनुमति देता है10,11.
पूर्वाश्म हिप्पोकैम्पस के संक्रमण पर एक छह परतदार कॉर्टिकल संरचना है और पैरा-हिप्पोकैम्पस गठन12,13. यह ADN11 से महत्वपूर्ण synaptic इनपुट प्राप्त करता है लेकिन यह भी कई अन्य cortical और subcortical क्षेत्रों से14. इस प्रकार, एक presubicular टुकड़ा के भीतर thalamic एक्सॉन टर्मिनलों के चयनात्मक उत्तेजना बिजली की उत्तेजना और न ही ग्लूटामेट uncaging के साथ संभव नहीं है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रकाश gated चैनलों को व्यक्त वायरल वैक्टर इंजेक्शन के सटीक स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का उपयोग कर मस्तिष्क क्षेत्रों (एडीएन और presubiculum) के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी निर्धारित करने के लिए तरीके हैं। इसके अलावा वर्णित अपने लक्ष्य क्षेत्र में न्यूरॉन्स पेश करने के axons टर्मिनलों के photostimulation है, मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में पोस्ट synaptic न्यूरॉन्स के पूरे सेल पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग के साथ युग्मित.
एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र में प्रकाश के प्रति संवेदनशील opsins व्यक्त करने के लिए विवो वायरल इंजेक्शन में लंबी दूरी के कार्यात्मक कनेक्टिविटी10,11,17,18के opt…
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी मदद के लिए स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन प्रोटोकॉल और मारिन मैनुअल और Patrice Jegouzo के पिछले संस्करणों के विकास में उनकी मदद के लिए बर्ट्रेंड मैथन, एमजेडी नासर, ली-वेन हुआंग, और जीन साइमननेट को धन्यवाद देते हैं। यह काम शिक्षा और अनुसंधान के लिए फ्रांसीसी मंत्रालय (एल आर, एल एस), केंद्र राष्ट्रीय des Etudes Spatiales (एम. बी.), और Agence Nationale डे ला Recherche अनुदान ANR-18-CE92-0051-01 (डी एफ) द्वारा समर्थित किया गया था.
0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
All chemicals | Sigma | ||
Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
CCD Camera | Andor | DL-604M | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
curved forceps | FST | 11011-17 | |
CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
Filter paper | Whatman | ||
Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
Internal solution compounds : | |||
Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
Ketamine 1000 | Virbac | ||
Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
Milk powder | Carnation | ||
MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
small scissors | FST | 14060-09 | |
Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |