Summary
该方法为研究将来自复杂宿主来源的外源脂肪酸结合到细菌膜中提供了一个框架,特别是金黄色葡萄球菌。为此,介绍了从鸡蛋蛋黄中浓缩脂蛋白颗粒的方案,以及利用质谱法对细菌磷脂进行随后脂肪酸分析的介绍。
Abstract
金黄色葡萄球菌和其他革兰氏阳性病原体将环境中的脂肪酸结合到膜磷脂中。在感染期间,大多数外源脂肪酸存在于宿主脂蛋白颗粒中。宿主脂肪酸的储存库以及细菌从脂蛋白颗粒中提取脂肪酸的机制仍存在不确定性。在这项工作中,我们描述了从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白(LDL)颗粒的协议,并确定LD是否作为S.aureus的脂肪酸储存库。该方法利用无偏脂质学分析和鸡低密度脂蛋白,是探索低密度脂蛋白与细菌相互作用的有效经济模型。采用高分辨率/精确质谱法和串联质谱法对低密度脂蛋白中外源脂肪酸的S.氨基酸整合进行分析,从而对细菌的脂肪酸成分进行表征膜和无偏的鉴定在接触低密度脂蛋白时在细菌膜脂质中产生的脂肪酸的新组合。这些先进的质谱技术通过揭示并入磷脂中的特定外源脂肪酸,为脂肪酸的加入提供了无与伦比的视角。此处概述的方法适用于其他细菌病原体和复杂脂肪酸的替代来源的研究。
Introduction
耐甲氧西林(MRSA)是卫生保健相关感染的主要原因,相关的抗生素耐药性是一个相当大的临床挑战1,2,3。因此,制定新的治疗策略是重中之重。革兰氏阳性病原体的一个有前途的治疗策略是抑制脂肪酸合成,这是膜磷脂生产的要求,在S.aureus中,包括磷脂甘油(PG)、裂解-PG和心肌利平4。在细菌中,脂肪酸的产生通过脂肪酸合成II途径(FASII)5发生,这与真核对应物有很大不同,使得FASII成为抗生素开发5,6个有吸引力的靶点。.FASII抑制剂主要针对FabI,这是脂肪酸碳链伸长化所需的一种酶。FabI抑制剂三氯生被广泛用于消费品和医疗用品8,9。几家制药公司正在开发额外的FabI抑制剂,用于治疗10、11、12、13、14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26.然而,许多革兰氏阳性病原体,包括S.aureus,能够清除外源脂肪酸的磷脂合成,绕过FASII抑制27,28,29。因此,FASII抑制剂的临床潜力是辩论的,因为我们对宿主脂肪酸的来源和病原体从宿主27、28中提取脂肪酸的机制的认识存在相当大的差距。为了弥补这些差距,我们开发了一种无偏脂质学分析方法,以监测脂蛋白颗粒中外源脂肪酸与S.aureus膜磷脂的合并情况。
在败血症期间,宿主脂蛋白颗粒是血管内宿主衍生脂肪酸的潜在来源,因为大多数宿主脂肪酸都与颗粒30相关。脂蛋白由亲水外壳组成,由磷脂和蛋白质组成,这些蛋白质包裹着甘油三酯和胆固醇酯的疏水性核心31。四大类脂蛋白 - 奇洛美亚、极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白 (LDL) - 由宿主生产,并充当脂质运输工具,提供脂肪酸和胆固醇。通过血管的宿主细胞。低密度脂蛋白富含酯化脂肪酸,包括甘油三酯和胆固醇酯31。我们之前已经证明,高度纯化的人类低密度脂蛋白是PG合成的外源脂肪酸的可行来源,从而为FASII抑制剂旁路32提供了机制。纯化人体低密度脂蛋白在技术上可能具有挑战性且耗时,而纯化人类低密度脂蛋白的商业来源在日常使用或进行大规模细菌筛选时成本高昂。为了解决这些限制,我们修改了从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白的程序,鸡蛋蛋黄是脂蛋白颗粒33的丰富来源。我们已经成功地使用非目标,高分辨率/准确的质谱和串联质谱监测将人类LDL衍生脂肪酸结合到S.aureus32膜中。与先前报告的方法不同,这种方法可以量化三种主要葡萄球菌磷脂类型的单个脂肪酸异构体。油酸(18:1)是存在于所有宿主脂蛋白颗粒中的不饱和脂肪酸,很容易并入S.aureus磷脂29,30,32。金黄色葡萄球菌不能合成油酸29;因此,磷脂结合的油酸的数量建立在葡萄球菌膜29中存在宿主脂蛋白衍生脂肪酸。这些磷脂物种可以通过这里描述的最先进的质谱法来识别,在脂肪酸来源存在的情况下,为培养的S.aureus的膜组成提供了前所未有的分辨率。感染期间遭遇。
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Protocol
注:以下从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白颗粒的协议来自穆萨等人2002年33。
1. 制备鸡蛋黄以浓缩低密度脂蛋白颗粒
- 用70%乙醇溶液清洗壳,使两个大鸡蛋消毒,并晾干。
- 使用 70% 乙醇溶液对鸡蛋分离器进行消毒,并允许空气干燥。将鸡蛋分离器连接到中型烧杯的唇上。
- 将每个鸡蛋分别裂入鸡蛋分离器中,让白蛋白流入烧杯。完整的蛋黄将由分离器保留。
- 用30 mL的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗两次蛋黄,以去除残留的白蛋白。
- 轻轻地将蛋黄放在滤纸上。
- 用无菌移液器尖端刺穿玻璃膜,将膜内内容物排入无菌 50 mL 锥形离心管中。丢弃膜和滤纸。
2. 含低密度脂蛋白血浆从鸡蛋蛋黄中分馏
- 在pH 7.0时,将大约两卷0.17 M NaCl加入蛋黄,并大力混合。然后在4°C下混合此溶液60分钟。
- 在10°C下将蛋黄稀释在10°C下,在10,000 x g下,45分钟。将微粒状分数(颗粒)中的血浆分数(上清)去除至无菌的50 mL锥形管中。
- 重复步骤 2.2。
3. 从等离子体中分离低密度脂蛋白颗粒
- 在 4°C 下将等离子体馏分与 40% 硫酸铵 (w/v) 混合 60 分钟。
- 使用 420 mM NaOH 溶液将等离子馏分的 pH 值调整为 8.7。
- 在4°C下将蛋黄稀释在10,000 x g下,持续45分钟。将上半固体黄分,去除到7 kDa孔径透析管中。在管道中留出空间,使其膨胀。
- 在4°C的超纯水中过夜,去除硫酸铵。使用搅拌棒轻轻搅拌水。
- 将透析溶液转移到无菌的 50 mL 锥形离心管中。
- 在4°C下将溶液在10,000 x g下离心,持续45分钟。小心地将上半固体黄分液去除无菌管,并储存在4°C。
4. 评估鸡肉低密度脂蛋白作为脂肪酸的来源
- 亚培养S. aureus细胞进入 5 mL 的无脂肪酸 1% 胰子狼汤,并在 37°C 下孵育过夜,摇动(225 rpm)。对于脂肪酸辅助营养剂,补充培养物与脂肪酸的来源。
- 稀释过夜培养物至600nm(OD600)的光学密度(OD),为0.1%,1%的胰锥体汤。将50μL的细胞悬浮液放入圆底96孔板的每个孔中。
注:使用脂肪酸辅助营养剂时,在确定培养物的OD之前,将过夜培养物洗在两卷胰腺汤中,重新悬浮在5 mL的胰蛋白石汤中,以限制脂肪酸的结转。 - 对于含有未经处理的对照井,每口加50μL的1%的胰锥体汤。
- 在含有实验细胞悬浮液的孔中,加入50μL的1%的胰蛋白石汤,辅以10%蛋黄衍生LDL、2μM三氯生或10%蛋黄衍生LDL和2μM三氯生混合物。
注:此时,每口井将包含100μL,每口蛋黄衍生LDL和三氯生的最终浓度分别为5%和1μM。 - 随着时间的推移测量 OD600,使用 37°C 的微板读卡器,具有连续的线性晃动来监测生长。
5. 用低密度脂蛋白孵育S.金黄色葡萄球菌,用于膜脂质分析。
- 将分离的菌落培养成5 mL的无脂肪酸1%胰酮汤,并在37°C下孵育过夜,摇动(225 rpm)。
- 稀释过夜培养 1:100 到无菌 250 mL 迷糊瓶中,其中包含 50 mL 的 1% 胰锥体汤。在37°C下孵育至中日志阶段(约4小时),并摇动。
- 将25 mL培养被转移到无菌的50 mL离心管中,并颗粒细胞。去除上清液,在750 μL的1%胰蛋白石汤中重新悬浮细胞颗粒。
- 将再悬浮的细胞和电池悬浮液的等分300μL结合到无菌的1.5 mL离心管中。
- 将低密度脂蛋白添加到所需的最终浓度,并在 37°C 下孵育,摇动(225 rpm)4小时。
- 在4°C下将培养物在16,000 x g下离心2分钟,然后用两卷无菌PBS清洗细胞颗粒,然后重复。
- 记录每个湿细胞颗粒的重量。将细胞颗粒在干冰或液氮中冷冻,储存在-80°C或直接至第6节。
6.提取金黄色膜脂质
- 将冷冻的金黄色细胞颗粒放在干冰上。在每个细胞颗粒上添加 0.5 mm 氧化氧化铝珠,使用大约等于细胞颗粒体积的珠子体积。
注:作为这种脂质提取方法的替代方法,研究人员可以使用成熟的Bligh和Dyer或Folch方法从细菌细胞34中严格脂质。 - 将740μL的75%甲醇(HPLC级)直接加入电池颗粒,至-80°C。
- 每1mg细胞加入2μL的50μM二甲酰磷脂酰胆碱(以甲醇制备)作为内部标准。关闭试管,将包含每个样品的 1.5 mL 离心管放入子弹搅拌机组织均质器中的可用端口中。在低速上对质化样品,设置 2-3,3 分钟。
- 目视检查样品的均质性。如果细胞团可见,则继续在项目符号混合器中以 2 分钟为增量进行均质化。
- 从子弹搅拌机中取出样品,并转移到化学烟气罩。
- 在每个样品管中加入270μL的氯仿。大力涡流样品30分钟。
注意:氯仿是一种可能的致癌物质。 - 在台式离心机中将样品离心长达30分钟,至少2000 x g。更快的速度比兼容的离心管一起使用,离心的持续时间可以缩短到10分钟。
- 在化学烟气罩中,收集单相上清液并转移到新的试管中,同时小心避免提取管底部的蛋白质颗粒。
- 在蛋白质颗粒中加入 740 μL 的 75% 甲醇(HPLC 级)和 270 μL 氯仿,并重新提取上述步骤 6.6-6.8 中所述的每个样品。将第二次提取中的上清液与先前收集的每个样品的上清液相结合。
- 在惰性气体(如氮气或氧化铝)流下,或在真空下使用离心机浓缩器(材料表)蒸发萃取溶剂。
- 用1.0 mL的10 mM碳酸氢铵溶液清洗干脂提取物三次,并按照步骤6.10重新干燥样品。
- 将干脂质提取物重新悬浮在合适的非极性溶剂中,如异丙醇。使用步骤 5.7 中确定的每 1 mg 新细胞重量的 20 μL 重新悬浮样品,或者,如果细胞颗粒的重量未知,则将样品重新悬浮在 200 μL 异丙醇中,然后进入第 7 节。
7. 使用高分辨率/精确质谱分析S. aureus脂质曲线
- 在进行全脂质分析之前,从实验组中选择具有代表性的测试样本,并在一系列样品稀释因子中进行分析,以确定总脂质浓度在线性范围内的样品稀释范围质谱仪的探测器响应范围,如前所述35。
- 在惰性气体下或真空下干燥等分物,在离心机浓缩器(材料表)中,对每个样品脂质提取物的蒸发等分物进行脂质分析。
- 在液相色谱-质谱(LC-MS)级异丙醇:甲醇(2:1,v:v:v)中重新悬浮含有20 mM铵的脂质,使用相当于步骤7.1中确定的最佳样品稀释系数的体积。
- 对于非靶向脂质分析,样品可以直接引入高分辨率/精确的质谱平台,而无需通过流动注入或使用色谱或直接注入提取物35,36。将步骤 7.3 中制备的稀释脂质提取物转移到适当的自动进样小瓶或 96 孔板。
- 对于基于流量注入的分析,将自动进样小瓶放入 HPLC 系统的温度控制 (15°C) 自动进样器中,该系统具有毛细管/低流量应用,例如配备电子流量的 HPLC(材料表)比例和流量监测系统。
- 用LC-MS级异丙醇:甲醇(2:1,v:v:v)填充含有20 mM铵的HPLC溶剂储液罐。
- 使用安捷伦化学站软件,对HPLC自动采样器进行编程,以执行5μL样品注入。在"仪器"菜单中,选择"设置喷射器",并在"喷射音量"字段中键入5.0。单位以微升为单位。确保HPLC设置为以1μL/2:1(v:v)异丙醇:甲醇含有20 mM铵甲酸酯的1μL。
- 在"化学仪器"菜单中,选择"设置泵...",然后选择微流量模式切换开关。
- 在"时间表"字段中,输入:时间 0.00、100% B、流 1.0。通过输入时间 10.0、100% B、流 1.0,在"时间表"中输入并创建第二行。选择"设置泵"菜单底部的"确定"按钮。这些设置将启用 10 次分析运行,流速为每分钟 1.0 μL。
- 使用装有低流量 (34 G) 金属针的电喷雾电离源,将 Eluate 从 HPLC 输送线引入质谱仪。
- 使用热调谐加仪表控制软件,选择设置菜单并选择加热ESI源。通过将这些值键入对话框的相应字段中,将这些值设置为 4000 V,将护套气体设置为 5(任意单位)。同样,将毛细管温度设置为 150 °C,将 S 镜头设置为 50%。
注:这些值需要针对每个质谱平台进行优化。 - 对于非目标脂质分析,使用高分辨率/精确质量 MS 平台 (材料表) 作为检测器。
- 使用热调谐加软件,单击"定义扫描"按钮,并在"分析器"菜单中选择FTMS。将"质量范围"字段设置为"正常",并在"分辨率"字段中选择100,000。确保扫描类型设置为"已完全"。在"扫描范围"菜单下,在第一质量 (m/z)字段中输入200,并在"最后一个质量 (m/z)"字段中输入2000。
- 确保利用负极性来检测最丰富的金黄色脂质。
- 使用离子映射串联质谱法 (MS/MS) 对感兴趣的光谱区域内的所有脂质离子进行重复样品分析,以确认脂质结构和脂肪酸成分。或者,在第 8 节中分配了初始脂质鉴定后,可进行 MS/MS 分析。
8. 数据库搜索,以确定内源性S.金黄色葡萄球菌和外源性LDL衍生脂质
- 使用热Xcalibur软件进一步优化观察到的质量精度。在 Xcalibur 中,在"工具"菜单下,选择"脱机重新校准"。打开"重新校准脱机"窗口后,通过选择"文件"菜单并选择"打开"选项来加载要重新校准的质量频谱文件。
- 打开感兴趣的文件,切换视图窗口顶部的"插入行"按钮,以查看 MS 运行的总电子色谱图。通过左键单击总电离度图中观测信号峰值的一个边缘的计算机鼠标,并将鼠标拖动到峰值的最宽部分,从而对获取的 MS 信号进行平均。
- 在"扫描筛选器"菜单下,选择与完全扫描 MS 数据对应的筛选器。通过选择"加载参考"按钮并选择参考文件,加载包含至少三个已知S. aures内源脂质的理论单同位素质量的参考文件。选中每个脂质单同位素质量旁边的"使用"框。
- 单击查看窗口底部的"搜索"按钮。如前所述,在总电子色谱图中重新对信号峰值的 MS 信号进行平均。
- 单击查看窗口底部附近的"转换"按钮。当"转换对话"框打开时,单击"确定"。如果从热科学以外的供应商的质谱平台上收集数据,请省略此步骤。
- 使用 Xcalibur 软件,将每个未经处理或 LDL 处理的样本重新校准的准确质量峰值列表导出到 Excel 文件的单独的工作表。选择"质量浏览器"图标。通过选择"文件"菜单并选择"打开..."选项,打开重新校准的感兴趣文件。
- 在总电子色谱图中跨宽峰值的平均值,如步骤 8.2 中所述。
- 右键单击质量频谱查看窗口中的图钉图标,然后选择"查看|频谱列表.在同一菜单中,选择"显示选项",然后在"显示"菜单中选择"所有峰值"切换框。单击"确定"按钮可关闭查看窗口。
- 再次右键单击质量频谱查看窗口中的图钉图标,然后选择"导出" |剪贴板(精确质量).将第一个工作表的导出数据单元格 A1 粘贴到新的 Excel 电子表格中。
- 删除导出数据文件中的前 8 行文本,以便 Excel 电子表格的单元格 A1 包含来自质量频谱的第一个质量数据点。对每个重新校准的 MS 文件重复导出,为每个导出的峰值列表使用 Excel 文件中的新工作表。
- 使用脂质光谱分析 (LIMSA) 软件37外接 Excel,构建一个数据库,其中包含 Hewelt-Belka 等人描述的已知S. aureus 脂质物种的分子公式,以及 Hewelt-Belka 等人 201438中描述的分子公式。代表脂质物种的公式,这些品种可能假设存在于 LDL 中。
注:此外,还应注意在数据库中包括潜在的分子配方,以说明其中存在主要LDL脂肪酸的假设细菌脂质,如油油(18:1)和亚油(18:2)脂肪酸32。 - 要构造数据库,打开一个空白的 Excel 电子表格。在第一个工作表的单元 A1 中,键入要添加到数据库中的脂质物种的理论/计算单同位素质量,与质谱仪中观察到的离子状态中的脂质物种的质量相对应。在单元格 B1 中,输入脂质物种的名称,如 PG(34:0)。
- 在细胞C1中,输入脂质种类的分子公式,对应于质谱仪中观察到的脂质的离子状态。在细胞D1中,输入质谱仪中观察到的脂质物种的电荷。移动到单元格 A2,开始为在可搜索数据库中输入的下一个脂质物种的新条目。
- 重复步骤 8.12 和 8.13,直到所有所需的脂质物种都输入数据库。保存数据库文件,并在 Excel 中保持打开状态。
- 在 Excel 中,选择"外接程序"菜单。选择LIMSA以启动 LIMSA 软件。从主菜单中,单击"复合库..."按钮。在显示的新窗口中,单击"导入化合物"。这将上载复合数据库供 LIMSA 软件使用。
- 根据供应商的说明35,使用 LIMSA 软件 Excel 外接程序对所有 MS 光谱执行基于质量的准确质量脂质识别。从 LIMSA 主菜单中,在频谱类型菜单下选择峰值列表。选择"正模式"或"负"模式以与获取 MS 数据的极性相对应。
- 在峰值 fwhm (m/z)窗口中,输入所需的质量搜索窗口以查找峰值。对于高分辨率/准确的质量 MS 数据,建议使用 0.003-0.005 m/z 的质量容差搜索窗口。
- 在"灵敏度"窗口中,输入所需的基线截止点(例如,0.01% 相对丰度)。在同位素校正菜单中,选择线性拟合或减法算法,其中任一算法可与峰值列表数据一起使用。
- 通过单击"可用化合物"窗口中所需的脂质物种,突出显示包含在数据库搜索中的脂质化合物。单击"添加"按钮将突出显示的脂质物种添加到搜索组中。
- 通过单击添加的化合物定义内部标准,然后将"浓度"窗口更改为所选内部标准的相应浓度。
- 通过选择每个添加的脂质种类和内部标准,并在类字段中键入类名(如 PG 或脂质),确保要量化的内部标准和所选脂质种类属于同一类名称。
- 要保存可搜索的脂质化合物组以供将来使用,请单击"分组"菜单旁边的"保存"按钮。
- 确保包含所有导出的 MS 峰值列表的 Excel 文件对对应于第一个S. aureus MS 运行的工作表打开,然后单击 LIMSA 主菜单中的"搜索"按钮。
注:LIMSA 数据库搜索的输出将包括与步骤 8.12-8.13 中构建的数据库中存在的脂质相匹配的质量光谱特征列表,以及每个匹配要素在规范化到一个或多个选定要素之后的浓度内部标准。 - 使用 Xcalibur 软件检查与感兴趣的脂离子对应的 m/z 的准确质量 MS/MS 光谱,以确认每个已识别的脂质分子物种中存在的脂肪酸成分。选择"质量浏览器"图标。通过选择"文件"下拉菜单并选择"打开..."选项,打开感兴趣的 MS/MS 文件。
- 通过右键单击质量谱查看窗口中的图钉图标,选择与感兴趣的脂质 m/z 的 MS/MS 分析对应的扫描过滤器,然后从菜单中选择"范围"。在显示的新窗口中,选择"筛选器"菜单以选择扫描。
- 如步骤 8.2 中所述,在总电子色谱图中平均信号。使用 MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) 软件执行适当的统计测试。通过比较未经处理和LDL处理条件的标准化脂质丰度,评估S.aureus脂质成分的统计显著性差异。
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Representative Results
图1说明了从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白的协议。这个过程首先用盐水稀释整个蛋黄,并将蛋黄固体从含有LDL的可溶性或血浆部分中分离出,称为颗粒(图1)33。血浆馏分的LDL含量通过+30-40 kDaβ-活蛋白的沉淀进一步丰富(图2)33。蛋白质带在140、80、65、60和15 kDa的存在与低密度脂蛋白的蛋白(图2)33、39相关。用三氯生治疗可抑制无脂肪酸培养基中S.aureus的生长32。我们之前已经证明,用蛋黄血浆或纯化的人类LD作为外源脂肪酸来源补充培养物可以克服三氯生引起的生长抑制(图3)32。同样,用丰富的蛋黄LDL补充三氯生处理的培养物可以恢复生长(图3)。此外,加入蛋黄LDL支持以前特征为S.尿酸辅助营养剂的生长(图4)32。对于最准确的基于质谱法的外源脂肪酸的S.aureus结合分析,限制生长培养基中游离脂肪酸的存在非常重要。1%胰蛋白石汤和鸡蛋蛋黄LD在胰蛋白石汤中稀释的游离脂肪酸组成,采用流动注射高分辨率/精确质谱法测定,发现游离脂肪酸量最小(图5)。同样的非靶向质谱分析,以确定在接触鸡蛋蛋黄醇后S.aureus磷脂的脂肪酸组成。丰富的A.aureus膜磷脂显示了未经处理和鸡蛋黄LDL处理条件的明确类分离,如OPLS-DA评分图所示(图6A)。OPLS-DA加载图表明,在PLS-DA模型中,许多磷脂酰甘油物种是重要的变量。值得注意的是,含有不饱和脂肪酸的磷脂,外源性脂肪酸结合的分子标记,在低密度脂蛋白补充培养物中与在没有低密度脂蛋白的情况下孵育的细胞相比富集(图6B)。先前的研究发现,鸡蛋蛋黄是不饱和脂肪酸的丰富来源,其中油酸(18:1)是最丰富的41,42。根据这些观察结果,我们发现油酸是最常见的不饱和脂肪酸,当S.aureus培养物补充鸡蛋蛋黄LKL(图6C)时,油酸是最常见的不饱和脂肪酸。表1进一步说明,当在蛋黄LDL的存在下生长S.aureus时,膜磷脂的脂肪酸谱会发生变化。
图1:利用离心和硫酸氨沉淀,从鸡蛋蛋黄中富化低密度脂蛋白的例证。(A) 从鸡蛋蛋黄中浓缩低密度脂蛋白所需的试剂。(B) 流程图描述了低密度脂蛋白浓缩过程的重要步骤。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:低密度脂蛋白浓缩前后鸡蛋黄的蛋白质分布。使用RIPA缓冲液制备蛋白质裂液。蛋白质赖糖(15μg)被加载到8%的丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶中。凝胶在一夜之间被生物Rad蛋白试剂弄脏了。LDL相关蛋白的kDa中的分子量沿图像右侧表示。M:蛋白质标记,Y:鸡蛋蛋黄,和LDL:鸡蛋蛋黄LDL富集请点击这里查看这个数字的较大版本。
图3:蛋黄衍生的LDL保护S.金黄色葡萄球菌免受三氯生引起的FASII抑制。在以下条件下,通过测量 1% 胰蛋白石汤中的 OD 600、1% 胰蛋白石汤(TB)、1 μM 三氯生 (TCS)、1 μM 三氯生(含有 1% 蛋黄血浆 (TCS + EYP)、5% 蛋黄 LDL (LDL) 或 1 μM)来监测S. aureus的生长情况三氯生与5%蛋黄LDL(TCS + LDL)。显示了三个独立实验的平均值。误差柱表示平均值的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:S的增长。黄酸辅助营养由蛋黄衍生LDL支持。脂肪酸辅助营养素在1%胰腺汤(TB)与或没有5%蛋黄LDL(LDL)补充的生长监测随着时间的推移通过OD600测量。显示了三个独立实验的平均值。误差柱表示平均值的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:游离脂肪酸含量,以1%的胰蛋白石汤或鸡蛋蛋黄醇酸。通过流动注入高分辨率/精确质谱法和串联质谱法检测出游离脂肪酸。每毫克蛋白质的离子正常数量被确定为1%的胰蛋白石汤和1%的胰蛋白石汤,辅以5%的鸡蛋蛋黄LDL。请点击此处查看这个数字的较大版本。
图6:鸡蛋黄低密度脂蛋白是合成S.氨基磷脂醇的外源脂肪酸的储层。(A) 使用高分辨率/精确质谱法鉴定的鸡蛋黄醇和未经处理的S.氨基膜磷脂的正交部分最小二分之一分分分析的评分图。(B) 不饱和磷脂甘油 (UPG) 与在没有 (WT) 或存在 (WT + LDL) 的鸡蛋蛋黄低密度脂蛋白 (WT + LDL)下生长的S. aureus的总膜 PG 的百分比。没有(WT)或(WT + LDL)鸡蛋蛋黄LDL生长的金黄色葡萄球菌以总PG脂肪酸的百分比进行绘制。请点击此处查看此图的较大版本。
| WT 培养在锥体汤中 | WT 培养在锥体汤中,辅以低密度脂蛋白 | |||||
| 磷脂酰甘油(TC:TDB)a | 蛋白质的标准化离子丰度/mg | Sd | 脂肪酸c | 蛋白质的标准化离子丰度/mg | Sd | 脂肪酸c |
| 24:0 | 0 | 0 | NDb | 0.052031116 | 0.02677 | ND |
| 26:0 | 0 | 0 | ND | 0.009539117 | 0.00362 | ND |
| 28:0 | 0.127937113 | 0.04528 | 15:0~13:0 | 0.167643281 | 0.02392 | 15:0~13:0 |
| 28:1 | 0.006765427 | 0.00157 | ND | 0.002776821 | 0.00372 | 15:0+13:1 |
| 30:0 | 8.680180809 | 2.68375 | 15:0~15:0 | 14.04873592 | 2.4531 | 15:0~15:0 |
| 30:1 | 0 | 0 | ND | 0.010152161 | 0.00449 | 15:1=15:0, 13:1=17:0 |
| 31:0 | 4.150511117 | 1.31658 | 16:0~15:0,14:0~17:0 | 10.17590926 | 1.88431 | 16:0~15:0、14:0+17:0、18:0~13:0 |
| 31:1 | 0.016156004 | 0.01216 | 13:1=15:0, 12:1=19:0 | 0.473478683 | 0.09063 | 13:1=15:0, 18:1=13:0, 12:1=19:0 |
| 32:0 | 29.29259262 | 8.82993 | 15:0~17:0 | 48.24342037 | 8.95664 | 15:0~17:0,16:0~16:0 |
| 32:1 | 0.02074815 | 0.00941 | ND | 0.307044942 | 0.07305 | 18:1=14:0, 16:1=16:0 |
| 33:0 | 9.000460122 | 2.78194 | 18:0~15:0,16:0~17:0 | 15.4531776 | 2.98171 | 18:0~15:0,16:0~17:0 |
| 33:1 | 0.162934812 | 0.04796 | ND | 2.921832928 | 0.30851 | 18:1=15:0 |
| 33:2 | 0 | 0 | ND | 0.167492702 | 0.03211 | 18:1=15:1, 18:2=15:0 |
| 34:0 | 12.3064043 | 3.70242 | 19:0~15:0,17:0~17:0 | 18.40129157 | 3.21385 | 19:0~15:0,17:0~17:0 |
| 34:1 | 0 | 0 | ND | 1.423605186 | 0.20066 | 18:1=16:0 |
| 34:2 | 0.000470922 | 0.00082 | ND | 0.156133734 | 0.03929 | 18:2~16:0 |
| 35:0 | 5.727462455 | 1.74583 | 20:0=15:0,18:0~17:0 | 7.771538992 | 1.28515 | 20:0=15:0、 16:0+19:0, 18:0+17:0 |
| 35:1 | 0.17337586 | 0.05727 | 20:1=15:0 | 0.772202525 | 0.08526 | 20:1=15:0, 18:1=17:0 |
| 35:2 | 0 | 0 | ND | 0.038758757 | 0.01481 | 18:2=17:0, 18:1=17:1 |
| 36:0 | 0.671004303 | 0.2116 | 21:0=15:0,19:0=17:0 | 0.967295024 | 0.2572 | 21:0~15:0、20:0~16:0、19:0~17:0、22:0~14:0 |
| 36:2 | 0 | 0 | ND | 0.495485065 | 0.04473 | 18:1=18:1, 18:2=18:0 |
| 36:3 | 0 | 0 | ND | 0.059268233 | 0.02291 | 18:2+18:1, 20:3+16:0, 20:2+16:1 |
| 37:0 | 0.060466411 | 0.01961 | 22:0=15:0,20:0=17:0 | 0.114526894 | 0.01852 | 22:0=15:0、 20:0+17:0, 18:0+19:0 |
| 38:2 | 0 | 0 | ND | 0.079469521 | 0.02872 | 18:2+20:0, 16:1+20:1 |
| a检测到 [M-H]-离子。TC,总链长;TDB,双债券总数。 | ||||||
| bND,未确定 | ||||||
| c脂肪酸按等分量排列。脂肪酸指定之间的下划线表明,每个脂肪酸可能存在于SN1或SN2位置,因为仅串联质谱法不能排除脂质物种作为位置等构体混合物存在的可能性。 | ||||||
表1:在存在鸡蛋蛋黄LKL的情况下培养的S.aureus的脂肪酸分布。我们使用使用高分辨率/精确 MS 和 MS/MS/MS 的无偏脂质学分析来确定在存在或不存在鸡蛋蛋黄 LKL 的情况下孵育的 S. aureus PG. S. aureus的脂肪酸分布,以及这些的 PG 轮廓细胞与培养1%胰锥体汤的细胞进行比较。
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Discussion
Aureus将外源脂肪酸加入其膜磷脂27,32,43。使用外源性脂肪酸的磷脂合成绕过了FASII抑制,但也改变了膜27、32、44的生物物理特性。虽然将外源性脂肪酸纳入革兰氏阳性病原体磷脂是有据可查的,但在宿主脂肪酸储存库的身份和三种主要葡萄球菌磷脂类型的结构变化方面仍然存在差距由外源脂肪酸结合的结果。在这里,我们描述了可用于:i) 丰富来自鸡蛋蛋黄的 LDL 颗粒(脂肪酸来源),ii) 确定外源脂肪酸对S. 动脉瘤生长的影响,以及 iii) 利用无偏脂质学分析监测外源性脂肪酸结合到S.aureus膜磷脂中。本研究提供的先进的质谱法为在外源脂肪酸存在的情况下生长的S.aureus的膜组成提供了非凡的视角。
几个革兰氏阳性病原体利用外源脂肪酸进行膜合成,与S.aureus一样,感染期间外源脂肪酸的可能来源缺乏了解27,43。如果考虑每种病原体的生长动力学,可以修改此处描述的生长分析,以评估在脂蛋白存在的情况下其他革兰氏阳性病原体的增殖。此外,如果控制脂肪酸源对背景光学密度的潜在影响,则可以使用该协议测试外源脂肪酸的其他复杂宿主来源。此外,所述用于分析细菌脂质的质谱法非常灵活,几乎可以对任何细菌物种进行脂质评估。由于脂质准确的质量数据是在"完全扫描"MS 模式下收集的,因此不需要事先了解感兴趣的细菌物种的脂质含量,这与基于特定脂质已知碎片模式的靶向分析方法不同32,45,46.在我们描述的"非目标"分析工作流中,下游数据分析,特别是针对脂质数据库搜索准确的质量峰值列表,是高度适应性的关键步骤,可能支持广泛的细菌物种和实验性治疗。在构建或选择可搜索的数据库以识别脂质物种时,研究人员必须考虑各种假设的内源脂质物种,同时允许检测衍生的新型或不可预见的外源脂质从实验治疗。
在本研究中,由于具有超高分辨率/精确质量能力,采用了高分辨率/精确质谱仪(材料表)。或者,可以成功地实现许多其他高分辨率/准确的质谱平台,以执行非目标脂质分析。同样,可以使用广泛的样品引入方法,包括直接输注、解吸气电喷雾电化或基质辅助激光解吸电化,以便直接分析脂质提取物,以便快速收集非目标脂质组数据。在引入样品之前,在与高分辨率/精确质谱学结合使用之前,包括液相色谱,可在全扫描MS数据收集期间解决某些等值脂质物种。然而,纳入色谱学需要确保选择的色谱方法足够通用,以便能够分离和检测实验治疗后可能存在的意外或新型脂质物种。数据库搜索以识别数据集中存在的脂质可以使用任何公开可用的可搜索数据库执行。虽然 LIMSA 软件能够方便地开发数以万计的假设脂质物种的用户定义数据库,但还有许多其他选项可用于从高分辨率/精确质量 MS 峰值列表中识别脂质。LIPID MAPS 联合体 (www.lipidmaps.org) 提供工具,用于在用户定义的质量容差范围内使用高分辨率/准确的 MS 生成峰值列表搜索假设脂质的计算和实验数据库,以及许多软件供应商提供自己的解决方案来分析脂质学数据。
成功的生长曲线和外源脂肪酸分析取决于几个因素,包括低密度脂蛋白纯度和限制背景脂肪酸水平。正确识别含低密度脂蛋白的馏分至关重要。上述协议和图1说明了浓缩过程每个步骤要保留的正确分数。我们成功地使用了40%的硫酸铵(纯度+99.5%)用于沉淀和随后去除β-活蛋白。然而,其他人报告说,加入蛋黄血浆中的硫酸氨的纯度和浓度可以显著影响这一步骤47。限制低密度脂蛋白富集中的硫酸铵污染对于用于细菌测定的LDL制剂非常重要,因为高浓度硫酸铵会限制生长48。在透析过程中,必须在透析管中提供充足的可用空间,以便扩散和去除硫酸铵。透析过程的进一步优化可能包括在过夜孵育期间进一步改变水分。我们发现通宵透析可以提供最好的结果,尽管穆萨等人报告透析6小时就足够了。生长曲线中细胞的起始浓度在试验之间保持一致至关重要。对于S. aureus,将细胞稀释到初始 OD600 0.05 提供了最一致的结果。此外,高浓度的FASII抑制剂可对细菌细胞产生非特异性影响。例如,超过7μM的三氯生浓度会诱发S.氨基尿道的细胞质膜损伤,因此,这种化合物的浓度必须保持在49以下。我们发现最终三氯生浓度为1μM可发生可重复的生长测定。在评价细菌磷脂合成的外源脂肪酸的潜在来源时,尽量减少培养基的脂肪酸贡献非常重要。在上述测定中,1%胰锥体的培养基培养基支持S.aureus的充分生长,且脂肪酸污染最小29,32。
限制背景脂肪酸水平对于下游质谱基脂肪酸分析尤为重要。其他人已经报告鸡蛋蛋黄中的游离脂肪酸数量自然低41,我们的分析支持这一结论(图5)。在孵育后使用胰锥体汤和彻底洗涤带PBS的细胞至关重要。此外,重要的是考虑细胞的生长阶段。我们选择了中日志相细胞,以确保充足的细菌磷脂合成。其他潜在的污染源的外源脂肪酸可能引入后细菌生长,如在脂质提取步骤或随后样品制备之前质谱分析50。在质谱分析过程中,在样品制备的任何步骤中引入的外源脂肪酸都可以检测为游离脂肪酸。在高温烤箱(至少180°C)内烘烤实验室玻璃器皿,过夜后可去除用于脂质提取和脂质储存的试管中的外源脂肪酸。此外,实验室用品,包括塑料可以冲洗甲醇,以减少脂肪酸背景50。先前分析中的残余脂肪酸也可能污染质谱仪本身的内部表面。因此,强烈建议在质谱分析过程中纳入分析空白,以测定游离脂肪酸的背景水平。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
我们感谢哈默实验室的成员对手稿的批判性评价和对这项工作的支持。科罗拉多大学医学院的亚历克斯·霍斯威尔博士亲切地提供了AH1263。密歇根州立大学的克里斯·沃特斯博士实验室提供了试剂。这项工作得到了美国心脏协会16SDG30170026的资助和密歇根州立大学提供的启动基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium sulfate | Fisher | BP212R-1 | ≥99.5% pure |
| Cell culture incubator | Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE |
| Costar assay plate | Corning | 3788 | 96 well |
| Filter paper | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Large chicken egg | N/A | N/A | Common store bought egg |
| Microplate spectrophotometer | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus strain AH1263 | N/A | N/A | Provided by Alex Horswill of the University of Colorado |
| Dialysis tubing | Pierce | 68700 | 7,000 MWCO |
| Tryptone | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A4561 | |
| Chloroform (reagent grade) | Fisher | MCX10559 | |
| Isopropanol (LC-MS grade) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850345C-25mg | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | ≥99.5% pure |
| Ammonium formate | Sigma | 70221-25G-F | |
| Xcalibur software | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Scientific | high resolution/accurate mass MS | |
| Agilent 1260 capillary HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac Vacuum Concentrators | Thermo Scientific |
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