Kvantificering af prolifererende humane antigen-specifikke CD4+ T-celler ved hjælp af Carboxyfluorescein Succinimidyl ester
Summary
Præsenteret her er en protokol til måling af prolifererende CD4+ T- celler som reaktion på antigene proteiner eller peptider ved hjælp af Dye fortynding. Denne analyse er særligt følsom over for sjældne antigen-specifikke T-celler og kan modificeres for at lette kloning af antigen-specifikke celler.
Abstract
Beskrevet er en simpel, in vitro, farve fortyndingsbaseret metode til måling af antigen-specifik CD4+ T- celle proliferation i humant perifert blod mononukleære celler (PBMCs). Udviklingen af stabile, ikke-giftige, fluorescerende farvestoffer såsom carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) gør det muligt at skelne sjældne, antigen specifikke T-celler fra tilskuere ved formindskelse i fluorescerende farvning, som detekteres af flowcytometri. Denne metode har følgende fordele i forhold til alternative tilgange: (i) det er meget følsomt over for lavfrekvente T-celler, (II) ingen viden om antigen eller epitop er påkrævet, (III) Fænotypen af de responderende celler kan analyseres, og (IV) levedygtige, reagerer celler kan sorteres og bruges til yderligere analyse, såsom T-celle kloning.
Introduction
Evnen til at detektere og studere antigen specifikke T-celler er vigtig i undersøgelser af cellemedieret immunitet. Det er dog særligt udfordrende for auto antigen-specifikke CD4+ T-celle-respons, som er meget svage og svære at detektere. En fælles metode til påvisning af antigen-specifik lymfocyt proliferation er [3H]-thymidin, som er en radioaktivt mærket nukleotid indarbejdet i DNA af prolifererende celler. Selv om [3H]-thymidinanalysen kan detektere DNA-syntese, er denne metode en indirekte måling af celledeling, fordi DNA-syntesen kan initiere uafhængigt af mitose (dvs. under genduplikering og apoptose1). Dette problem forværres af, at antigen specifik spredning af celler kan resultere i betydelig apoptose2, hvilket fører til potentiel overvurdering af antigen specifik spredning. Desuden giver [3H]-thymidinmetoden ikke fænotypiske oplysninger til prolifererende lymfocytter, såsom CD4+ eller CD8+ Lineage proliferation i pbmcs stimuleret med antigene peptider.
I 2003 udgav vi den første farve fortyndingsanalyse ved hjælp af cfse, kaldet cfse-baseret proliferation assay3,4. CFSE er et fluorescerende farvestof, der binder stabilt til intracellulære proteiner ved at danne en kovalent binding til intracellulære lysin rester. Da CFSE-mærkede proteiner er fordelt ligeligt blandt datter celler3, kan celler, der har delt, skelnes fra ikke-opdelte celler ved flow cytometri, hvilket også giver mulighed for kvantitativ fænotype af lymfocyt populationer. Faktisk kan antallet af divisioner, en celle har gennemgået fra tidspunktet for CFSE-farvning, måles til en vis grad5. For nylig, mange lignende farvestoffer såsom CellTrace violet spredning farvestof (VPD) og CytoTrack farvestof er blevet udviklet, som arbejder på en lignende måde6. Denne protokol fokuserer på CFSE, men principperne gælder også for andre relaterede farvestoffer.
Peptid-MHC transthyretin farvning er en almindeligt anvendt metode til påvisning og kloning antigen-specifikke CD8+ T-celler. Dette er en veletableret metode7,8,9,10; imidlertid kræver transthyretin-baseret kloning eksisterende viden om epitop/MHC-begrænsningen, og hver epitop kræver sin egen transthyretin11, hvilket begrænser omfanget af opdagelsen og kloning af nye epitop-specifikke T-celler. Den CFSE-baserede spredning kan anvendes med peptider, proteiner eller celle lysates. Den protokol, der er beskrevet heri, er både enkel og robust, og de responderende CD4+ T- celler kan sorteres til brug i downstream funktionelle og biokemiske karakterisering assays12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
CFSE-baseret spredning er en enkel og robust metode til påvisning og optælling af antigen-specifikke humane CD4+ T-celler. Det er tidligere blevet påvist, at anvendelse af den optimale koncentration af CFSE er afgørende for optimale resultater4. For meget CFSE ophæver spredningen, hvorimod alt for lidt ikke giver mulighed for at skelne mellem opdelte og uddelte celler. I modsætning hertil anvendes relativt høje koncentrationer (5,0 μM) af CFSE til mærkning af renset murine T-ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af: juvenil diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Det nationale sundheds-og medicinsk Forskningsråd (NHMRC GNT123586) (S. M.), diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), operationel infrastruktur støtte program for den victorianske regering (S. M., A. D., E. T., M. S.), og NHMRC Postgraduate Scholarship APP1094337 og JDRF PhD top-up Scholarship (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
