Summary
여기에 제시된 것은 염료 희석을 이용한 항원 단백질 또는 펩티드에 반응하여 증식CD4+ T 세포를 측정하기 위한 프로토콜이다. 이러한 분석종은 희귀 항원 특이적 T 세포에 특히 민감하며 항원 특이적 세포의 복제를 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다.
Abstract
기재된 것은 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 항원 특이적 CD4+ T 세포 증식을 측정하기 위한 간단한, 시험관내, 염료 희석-기반 방법이다. 카르복시플루오레세인 슈치니미딜 에스테르(CFSE)와 같은 안정적이고 무독성형 형광 염료의 발달은 유세포분석으로 검출된 바와 같이 형광 염색의 감소에 의해 방관자로부터 구별되는 희귀한 항원 특이적 T 세포를 허용한다. 이 방법은 대체 접근법에 비해 다음과 같은 장점을 갖는다: (i) 저주파 T 세포에 매우 민감하며, (ii) 항원 또는 에피토프에 대한 지식이 필요하지 않으며, (iii) 반응 하는 세포의 표현형을 분석할 수 있고, (iv) 실행 가능하고 반응한다. 셀을 정렬하고 T 세포 복제와 같은 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
항원 특이적 T 세포를 검출하고 연구하는 능력은 세포 매개 면역의 연구에서 중요하다. 그러나, 이렇게 하는 것은 매우 약하고 검출하기 어려운 자기 항원 특정 CD4+ T 세포 반응을 위해 특히 도전적입니다. 항원 특이적 림프구 증식의 검출에 사용되는 일반적인 방법은 [3H]-티미딘이며, 이는 증식 세포의 DNA에 통합된 방사성 표지된 뉴클레오티드이다. [3H]-티미딘 분석법은 DNA 합성을 검출할 수 있지만, 이 방법은 DNA 합성이 유사분열과 독립적으로 개시될 수 있기 때문에 세포 분열을 간접적으로 측정한다(즉, 유전자 복제 및 세포자멸 1). 이 문제는 세포의 항원 특이적 증식이 상당한 세포 자멸 2를초래할 수 있다는 사실에 의해 복합되어 항원 특이적 증식의 잠재적 인 과대 평가로 이어진다. 더욱이, [3H]-티미딘 방법은 항원 펩티드로 자극된 PBMC에서 CD4+ 또는 CD8+ 계보 증식과 같은 림프구증증을 위한 자형질 정보를 제공하지 않는다.
2003년에는 CFSE 기반 증식 분석3,4라고불리는 CFSE를 이용한 최초의 염료 희석 분석법을 발표했다. CFSE는 세포내 리신 잔류물과 공유 결합을 형성하여 세포내 단백질에 안정적으로 결합하는 형광 염료입니다. CFSE 표지된 단백질은 딸 세포3사이에서 동등하게 분할되기 때문에, 분할된 세포는 또한 림프구 집단의 양적 자형질에 허용하는 유세포 측정에 의해 분할되지 않은 세포에서 구별될 수 있습니다. 실제로, CFSE 염색 의 시간에서 세포가 겪은 분열의 수는 어느정도 5까지 측정될 수 있습니다. 최근에는 셀트레이스 바이올렛 증식 염료(VPD) 및 CytoTrack 염료와 같은 유사한 염료가 많이 개발되어 유사한 방식으로 작용하고있습니다6. 이 프로토콜은 CFSE에 중점을 두지만 원칙은 다른 관련 염료에도 동일하게 적용됩니다.
펩타이드-MHC 테트라머 염색은 항원 특이적 CD8+ T 세포를 검출및 복제하는 데 널리 사용되는 방법이다. 이것은 잘 확립 된방법 7,8,9,10; 그러나, tetramer 기지를 둔 복제는 에피토프/MHC 제한의 기존 지식을 요구하고 각 에피토프는 새로운 에피토프 특이적 T 세포의 발견 그리고 복제의 범위를 제한하는 그것의 자신의 tetramer11를요구합니다. CFSE 기반 증식은 펩티드, 단백질 또는 세포 용해와 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 프로토콜은 간단하고 견고하며, 반응하는 CD4+ T 세포는 다운스트림 기능성 및 생화학적 특성 분석기12,13에사용하기 위해 정렬될 수 있다.
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Protocol
모든 피험자는 말초 혈액을 수집하기 전에 정보에 입각한 동의를 했습니다. PBMC를 사용 하 여 실험에 대 한 윤리적 승인 세인트 빈센트의 hosptial에 의해 주어졌다 (HREC-A 135/08, 그리고 HREC-A 161/15).
1. 시약 준비
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휴먼 T 세포 매체
- RPMI 1640, 1x 비필수 아미노산, L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드(2 mM), 페니실린(100 U/mL)/스트렙토미신(0.1 mg/mL), 그리고 5% 풀링된 인간 혈청(PHS)으로 구성된 RP-5 미디어를 준비합니다.
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CFSE 재고 솔루션
- 5 mM의 농도로 최종 재고 솔루션을 달성하기 위해 DMSO의 ~ 9 mL에 25 mg의 CFSE를 용해시킴으로써 마스터 스톡을 준비합니다.
- PBS의 마스터 스톡을 희석하여 작업 재고를 준비하여 10 μM의 작업 농도를 달성합니다.
2. 전혈에서 인간 PBMC의 준비
- 인간 말초 혈액의 0.5-1.5 x 106 PBMC/mL 사이 일반적으로 있습니다. 따라서 필요한 혈액의 양은 원하는 PBMC 수에 따라 달라집니다. 적어도 1:2 PBS로 인간 말초 혈액을 희석. PBMC를 50 mL 튜브에 15 mL의 밀도 구배 배지를 추가한 다음 희석된 전혈 35 mL를 오버레이합니다.
- 실온(RT)에서 감속 없이 15분 동안 850 x g의 원심분리기. 이것은 3개의 명확한 층 귀착될 것입니다: 적혈구 펠릿을 포함하는 하단 층, 그것의 상단 인터페이스를 일렬로 세우는 백혈구를 가진 조밀도 구배 매체의 중간 층, 및 상부 혈장 층14.
- 상부 플라즈마 층의 약 20 mL를 제거합니다. 적혈구 펠릿을 피하기 위해주의, 백혈구 층을 수집합니다. PBS로 3x를 씻고 혈세포계에서 trypan 파란색 제외를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산하십시오. PBS에서 1 x 106 PBMC /mL로 희석하십시오.
-
비 CFSE 염색 세포
- 이들 세포는 유세포측정을 위한 보상 대조군으로서 사용되며, 무스테인 및 CD4+ 단일 염색 된 세포로 구성된다. 각 대조군 샘플 PBMC 현탁액의 300 μL을 10 mL 튜브에 추가하고, PBS가 있는 상단, RT에서 5분 동안 550 x g의 원심분리기를 넣습니다.
- RP-5 미디어에서 1 x 106 셀/mL을 다시 일시 중단합니다. 이러한 표지되지 않은 세포를 CFSE 표지 된 세포와 함께 37 °C / 5 % CO2 인큐베이터에서 7 일 동안 배양하십시오 (단계 2.6.1).
-
CFSE 염색 된 세포
- 2.3단계에서 세포를 50 mL 튜브로 옮김. 튜브 측면에 셀 현탁액 1mL당 CFSE 작업 스톡 솔루션(10 μM)을 1.0 μL 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 빠르게 섞어 보냅니다. CFSE의 최종 농도는 10 nM입니다.
- 37°C/5% CO2 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다. 염색을 중지하려면 RP-5 매질 5 mL을 추가하고 550 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛하십시오. RP-5 미디어에서 1 x 10 6/mL에서 PBMC를 다시 일시 중단합니다.
- 10 mL 튜브에 1.0 mL의 셀 현탁액을 추가하십시오. 각 항원마다 하나의 튜브를 사용하여 검사합니다.
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인간 PBMC 및 세포 배양의 항원 자극
- 배양 인간 CFSE-37°C/5%CO2 인큐베이터에서 7일 동안 RP-5 배지에서 항원을 가진 PBMC를 표지하였다. 배양 1 x 105 세포 / 웰 (100 μL) 희석 된 항원을 함유하는 RP-5 배지의 100 μL / 웰을 가진 96 웰 플레이트.
참고: 작업 농도를 포함하여 사용되는 항원들은 표1에 요약되어 있습니다.
- 배양 인간 CFSE-37°C/5%CO2 인큐베이터에서 7일 동안 RP-5 배지에서 항원을 가진 PBMC를 표지하였다. 배양 1 x 105 세포 / 웰 (100 μL) 희석 된 항원을 함유하는 RP-5 배지의 100 μL / 웰을 가진 96 웰 플레이트.
3. FACS 분석을 위한 반대로 CD4 염색
- 배양된 세포의 피펫 200 μL을 FACS 튜브내로, 0.1% FCS를 함유하는 PBS의 1.0 mL에서 1x, 550 x g에서 5분 동안 원심분리기를 세척한다.
- 반인간 CD4 알렉사 플루어 647 (0.25 mg/mL)의 100 μL의 PBS/0.1% FCS로 얼룩. FACS CFSE 보정을 설정하는 데 사용할 다른 형광단과 함께 얼룩이 없는 CFSE 라벨이 부착된 세포의 샘플을 제쳐두십시오. 4 °C에서 세포를 20 분 동안 빛으로부터 보호하여 배양하십시오.
- 1 mL의 PBS/0.1% FCS를 추가하여 세포를 세척하고, RT에서 5분 동안 550 x g의 원심분리기를 추가하고, 100 μL의 PBS/0.1% FCS로 다시 정지합니다. FACS 분석 직전에, 모든 튜브에 프로피듐 요오드화물 1 μL(PI, 0.1 mg/mL)을 추가하여 죽은 세포가 유세포 분석에 의해 배제될 수 있도록 합니다.
4. 유량 세포 측정 구성 및 게이팅 전략
참고: 도 1은 보정 제어 및 게이팅 전략을 포함하는 FACS 구성을 보여 군요.
- 게이트 전방 산란(FSC) 대 측면 산란(SSC) (그림1A)모든 림프구를 포함하는 집단.
- Pi 음성 세포에 대한 FSC 대 PI(그림1B)모집단을 게이트하여 세포 사멸 세포를 배제한다.
- 얼룩지지 않은 셀을 사용하여 비형광 전지에 대한 전압 기준을 설정합니다. 형광 신호가 각각 1,000 미만이되도록 CD4-A647 및 CFSE의 전압을설정합니다(그림 1C). 단일 색상 컨트롤 CFSE(그림1D)및 CD4-A647(그림1E)을사용하여 스테인이 없는 셀로 설정된 전압을 사용하여 각 색상에 대해 양수 형광 신호(~10,000)를 확인합니다.
- CFSE 및 PI에는 약간의 스펙트럼 이첩이 있습니다. CFSE 전용 샘플이 PI 채널에서 신호를 생성하지 않을 때까지 CFSE 형광에서 PI 형광을 빼기 위해 보정을 조정합니다.
참고: 이들 게이트는 본명세서에서 분석된 모든 샘플에 적용되었다.
5. 항원 특이적 CD4+ T 세포 증식을 열거하는 세포 분열 지수 계산
참고: 세포 분열 지수(CDI)는 5,000개의분할되지 않은 셀당 분할된 셀(CD4+ /CFSE dim)의 수를 의미한다(CD4+/CFSE밝은). 분할되지 않은 CD4+ 세포의 수가 정확히 5,000이 아닌 경우, 분할된 셀의 수는 5,000개의 분할되지 않은 세포당 분할된 세포의 수를 발현하도록 보정된다. 예를 들어, 파상풍 독소 특이적 증식(도2D)을사용하여, 4,930개의 분할되지 않은 세포(CFSEbright)및 3,268개의 분할 된 세포(CFSE dim)가 있었다; 따라서 분할된 셀의 수정된 수는 (5,000/4,930) x 3,268 = 3,304.3입니다.
- CDI(표1)를 계산하여 항원 자극군으로부터 분할된 세포/5,000개의 분할된 세포의 수를 항원 없이 배양된 세포로부터의 평균 분할 된 세포 수(5,000개의 분할되지 않은 세포당)로 나눈 값(표 2).
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Representative Results
파상풍 독소 단백질을 가진 인간 PBMC의 시험관 내 자극: PBMC는 CFSE로 염색하고 파상풍 독소의 존재에서 7일 동안 자극하였다. 거의 모든 기증자는 파상풍 독소가 유용한 긍정적 인 대조군 항원을 만드는 예방 접종을 받았기 때문에 파상풍 독소에 강한 T 세포 반응을 보였다. 도 2는 비자극된 PBMC로부터의 CD4+ T 세포의 CFSE 증식이 미미하였다는 것을 3중으로 입증한다(~12 CFSE희미한 세포; 그림 2A , B,C)파상풍 독소에 반응하여 CD4+ T 세포의 현저한 증식이 있었는 반면 (>3,000 CFSE희미한 세포; 그림 2D , E,F).
항원 펩티드로 인간 PBMC의 시험관 내 자극: PBMC는 CFSE로 염색하고 인간 프로인슐린 C-펩티드의 존재 에서 7일 동안 자극되었다. 도 3은 제1형 당뇨병을 가진 개인의 말초 혈액에서 프로인슐린 C-펩티드 특이적 CD4+ T 세포의 검출을 나타낸다. 건강한 공여체의 PBMC에서 증식은 관찰되지 않았다(데이터는 도시되지 않음). 도4에서, 인플루엔자 A 바이러스(H1N1 PR8)로 자극된 PBMC는 매트릭스 단백질증식을 입증하였다; 그러나, 이 기증자에 대한 파상풍 특정 반응은 상대적으로 약했고, 반응은 일반적으로 기증자 사이에서 가변적입니다.
종합하면, 이러한 결과는 전체 길이 단백질 및 짧은 합성 펩타이드를 사용하여 분석이 수행될 수 있음을 입증한다.
도 1: CD4+ T 세포의 CFSE 기반 증식에 대한 보상 제어 및 게이팅 전략. 비자극된 PBMC는 7일간의 시험관내 세포 배양 후. 림프구(A)는프로피듐 요오드화물로 염색되었고, 프로피듐 요오드화 음성 세포는 죽은 세포(B)를 배제하기 위해 게이트되었다. FACS 보상 대조군으로는 염색되지 않은 세포(C), CFSE 단독(D)으로 염색된 세포, CD4 단독으로 염색된 세포(E)가 포함되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: CFSE 염색파상형 특이적 CD4+ T 세포의 증식. PBMC는 CFSE 염색및 145 ng/mL(166 LfU/mL) 파상풍 독소의 존재 에서 7일 동안 배양하였다. 세포를 CD4로 염색하였다. CFSE 희석은 항원(A-C)과 파상풍 톡소이드 단백질(D-F)에 반응하여 나타내고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 프로인슐린 C-펩티드에 반응하여 CFSE 염색인간 CD4+ T 세포의 증식. CFSE 염색된 PBMC는 10 μM 프로인슐린 C-펩티드의 존재에서 7일 동안 배양되었다. 세포를 CD4로 염색하였다. CFSE 희석은 타입-1 당뇨병을 가진 기증자에게서 PBMC를 사용하여 표시됩니다. 자극되지 않은 PBMC (A), 파상풍 독소 단백질 자극 (B),및 인간 프로인슐린 C-펩티드에서 CFSE 희석은 PBMC (C)를 자극하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 인플루엔자 A 바이러스(H1N1 PR8) 매트릭스 단백질 1에 반응하여 CFSE 염색인간 CD4+ T 세포의 증식. PBMC는 0.08 μg/mL 인플루엔자 A 바이러스 매트릭스 단백질 1의 존재에서 7일 동안 CFSE 염색 및 배양하였다. 세포를 CD4로 염색하였다. CFSE 희석은 자극되지 않은 세포(A), 파상풍 독소 자극 세포(B), 및 인플루엔자 A 바이러스 매트릭스 단백질 자극 세포(C)에 대해 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Antigen | 작업 집중력 |
| 파상풍 독소 단백질 | 145 ng/mL |
| 인플루엔자 A H1N1 (PR8) 매트릭스 단백질 1 | 0.08-10 μg/mL |
| 프로인슐린 C-펩타이드 PI33-63 | 10 nM |
표 1: 파상풍 특이적 CD4+ 증식의 열거. 자극되지 않은 파상풍 자극 인간 PBMC로부터 5,000개의 기록된 유동 세포측정 이벤트를 사용한 CDI 계산.
| 샘플 | 분할되지 않은 셀 CD4+밝은 CFSE | 분할 셀 CD4+CFSE어둡게 | 분할 셀 CFSE희미한/5,000 CFSE밝은의 수 | 평균 분할 셀 CFSE어둡게/5,000 CFSE밝은 | |
| 닐 1 | 5,004 | 11세 | 11세 | 12.3 | |
| 닐 2 | 4,995 | 14세 | 14세 | ||
| 닐 3 | 5,006 | 12세 | 12세 | ||
| 샘플 | 분할되지 않은 셀 CD4+밝은 CFSE | 분할 셀 CD4+CFSE어둡게 | 분할 된 셀 CFSE희미한/ 5000 CFSE밝은의 수 | CDI 분할 된 세포의 수 (파상풍) 분할 된 세포를 평균 (전무) | 평균 CDI |
| 파상풍 1 | 4,930명 | 3,258 | 3,304.3 | 268 | 263.7 |
| 파상풍 2 | 4,928 | 3,205 | 3,251.8 | 263.7 | |
| 파상풍 3 | 4,910 | 3,142 | 3,199.6 | 259.5 |
표 2: CD4+ 증식을 시뮬레이션하는 데 사용되는 항원.
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Discussion
CFSE-기반 증식은 항원 특이적 인간 CD4+ T 세포를 검출하고 열거하는 간단하고 강력한 방법이다. 이전에는 최적의 결과 4에 대해 CFSE의 최적농도를 사용하는 것이 필수적이라는 것이 입증되었습니다. 너무 많은 CFSE는 증식을 폐지하는 반면, 너무 적게는 분할된 세포와 분할되지 않은 세포가 구별되는 것을 허용하지 않습니다. 대조적으로, CFSE의 상대적으로 높은 농도 (5.0 μM)는 정제 된뮤린 T 세포를 라벨에 사용된다 3. 배치 간의 가변성으로 인해 각 배치를 적정하여 최적의 농도를 결정하는 것이 좋습니다. 우리는 원래 간행물 (200 nM)에서보다 훨씬 낮은 농도 (10 nM)에서 현재 배치를 사용4.
이 방법의 또 다른 중요한 양상은 항원 용량의 최적화입니다. 적은 항원으로 배양된 T 세포가 더 민감하고 향상된 기능을 나타낼 수 있다는 것이 잘 확립되었다. 이것은 원래 HIV 펩티드15의맥락에서 입증되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 파상풍 독소의 양은 또한 고과민성 및 증식성 CD4+ T 세포를 유도하기 위하여 이전에4를 낙관했습니다. 흥미롭게도, 과량의 항원이 항원 특이적 증식을 감소시킨다는 것을 이전에 입증되었다15. 따라서 말초 혈액에서 희귀 한 T 세포 집단을 감지하고 열거하기 위해 항원 및 CFSE 농도를 최적화하는 것이 가장 중요합니다.
인간 염료 희석계 분석법을 최초로 공표한 이래, 유사한 염료가 많이 개발되었다. 우리는 CD4+ T 세포 증식이 PKH-26, 친유성 염료, CFSE (미공)에 비해 사용되었을 때 덜 효과적으로 검출되었다는 것을 발견했습니다. 우리는 체계적으로 시장에서 다른 염료를 테스트하지 않은, 그래서 그들의 상대적 강점에 대한 코멘트가 없습니다. 그러나, T 세포 증식을 정량화하기 위한 프로토콜은 모든 염료 희석 증식 분석에 동등하게 적용가능하다.
세포 분할 지수(CDI)로 증식을 표현하는 것은 백그라운드 증식을 응답의 크기 계산에 통합합니다. 우리의 손에, 배경은 일반적으로 낮은 (예를 들어, <15 이벤트 / 5,000 CD4+ CFSE 밝은). 배경 확산은 개인과 실험마다 다릅니다. 비율(이 경우, CDI)을 사용하여 증식의 강도를 표현하는 것은 결과에 미치는 영향을 감소시키는 데 다소 효과적이다. 매체에 있는 단백질에 대한 배경 반응은 문제가 될 수 있습니다. 소 단백질이 분석의 민감도를 감소약한 배경 반응을 자극 할 수 있기 때문에, 소 혈청이 아닌 인간의 혈청을 포함하는 조직 배양 매체를 사용하는 것이 좋습니다. 높은 배경 증식은 온화한 감염이 있는 사람들에서, 아마도 감염에 응하여 생체내에서 프라이밍되는 증식 때문에 발견되었습니다. 이러한 경우에, 분석은 기증자가 감염을 삭제한 후에 반복될 필요가 있습니다.
CFSE 계 증식 분석은 PBMC12로부터직접 인간 항원 특이적 CD4+ T 세포를 효율적으로 복제하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 이 접근법은 인슐린12에특이적인 CD4+ T 세포를 복제하는 데 사용되어 왔다. 최근에는, 프로인슐린 C-펩티드 특이적 CD4+ T 세포의 복제 및 기능 분석은 T1D의 발병기전에 대한 놀라운 통찰력을 제공했으며, 특히 최근 발병한 T1D13환자에서 더욱 그렇습니다.
결론적으로, CFSE 기반 증식 분석은 민감하고 견고하다. 빠르고 기술적으로 간단하며 신선하거나 냉동 보존된 PBMC를 사용하여 수행할 수 있습니다. 다색 FACS 분석에 CFSE를 통합하는 능력은 많은 세포 모형을 포함하는 PBMC에서 증식T 세포의 면역 표현형의 정량적인 측정을 제공하고, 이 정도의 세부적인 것은 DNA 혼입을 이용한 분석실험으로 는 불가능합니다 [3H]-티미딘과 같은
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품에 의해 지원되었다: 청소년 당뇨병 연구 재단 [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). 국립 보건 의료 연구 위원회 (NHMRC GNT123586) (S.M.), 당뇨병 호주 연구 신탁 밀레니엄 상 (Y17M1-MANS) (S.M.), 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램 (S. M., A.D., E.T., M.S.), 및 NHMRC 대학원 장학금 APP1094337 및 JDRF 박사 학위 업 장학금 (M. S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
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