Summary

增殖人类抗原特异性CD4+ T细胞使用卡博曲莱辛苏奇尼米酯的定量

Published: June 04, 2019
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Summary

这里介绍的是一个协议,用于测量增殖CD4+ T细胞,以响应抗原蛋白或肽使用染料稀释。这种测定对稀有抗原特异性T细胞特别敏感,可以进行改性,以利于抗原特异性细胞的克隆。

Abstract

所述是一种简单的体外染料稀释方法,用于测量人类外周血单核细胞(PBMC)中抗原特异性CD4+T细胞增殖。稳定、无毒的荧光染料(如卡博基氟辛苏奇尼酰基酯(CFSE)的开发,通过减少荧光染色(通过流式细胞测定)来区分稀有的抗原特异性T细胞。与替代方法不同,此方法具有以下优点:(i) 对低频 T 细胞非常敏感,(ii) 不需要抗原或表位的知识,(iii) 可以分析响应细胞的表型,以及 (iv) 可行、有反应的细胞可以排序,并用于进一步分析,如T细胞克隆。

Introduction

检测和研究抗原特异性T细胞的能力在细胞介导免疫研究中非常重要。然而,这样做对于自身抗原特异性CD4和T细胞反应尤其具有挑战性,后者非常弱,难以检测。用于检测抗原特异性淋巴细胞增殖的常用方法是[3H]-胸腺素,这是一种放射性标记的核苷酸,并结合在增殖细胞的DNA中。虽然[3H]-胸腺酰胺测定可以检测DNA合成,但这种方法是细胞分裂的间接测量,因为DNA合成可以独立于线粒体分裂(即,在基因复制和凋亡1期间)启动。由于细胞抗原特异性增殖可导致大量细胞凋亡,导致抗原特异性增殖的潜在高估,使这一问题更加复杂。此外,[3H]-胸腺素法不为扩散淋巴细胞提供花样信息,如CD4+或CD8+在受抗原肽刺激的PBMC中系生增殖。

2003年,我们发布了第一个使用CFSE的染料稀释测定,称为CFSE增殖测定3,4。CFSE 是一种荧光染料,通过与细胞内溶酶残留物形成共价键,与细胞内蛋白质形成稳稳结合。由于CFSE标记的蛋白质在子细胞3之间平均分配,分裂细胞可以通过流动细胞测定来区分未分割的细胞,这也允许淋巴细胞群的定量型型。事实上,细胞从CFSE染色时开始经历的分裂数量可以测量到一定程度5。最近,许多类似的染料,如细胞跟踪紫罗兰增殖染料(VPD)和细胞跟踪染料已经开发出来,它们的工作方式相似6。该协议侧重于 CFSE,但这些原则同样适用于其他相关染料。

肽-MHC四聚体染色是检测和克隆抗原特异性CD8+T细胞的广泛使用的方法。这是一个公认的方法7,8,9,10;然而,基于四元体的克隆需要现有的表位/MHC限制知识,每个表位都需要自己的四元体11,这限制了发现和克隆新型表位特异性T细胞的范围。基于CFSE的增殖可用于肽、蛋白质或细胞裂物。本文所述的协议既简单又坚固,响应CD4+T细胞可分类,用于下游功能和生化表征测定12,13。

Protocol

所有受试者在采集外周血之前都给予知情同意。圣文森特霍斯普蒂亚尔(HREC-A 135/08和HREC-A 161/15)对使用PBMC的实验给予伦理批准。 1. 试剂制备 人类T细胞培养基 准备RP-5培养PBMC,包括RPMI 1640、1x非必需氨基酸、L-丙烯-谷肽(2 mM)、青霉素(100 U/mL)/链霉素(0.1毫克/mL)和5%的人类血清(PHS)。 CFSE 库存解决方案 通过在+9 mL DMSO?…

Representative Results

用破伤风类毒素蛋白对人PBMC进行体外刺激:在破伤风类毒素存在的情况下,PBMC被染色,并在破伤风类毒素下被刺激7天。几乎所有的捐赠者都表现出强烈的T细胞对破伤风类毒素的反应,因为他们已经接种了疫苗,这使得破伤风类毒素是一种有用的阳性控制抗原。图2在三联中显示,CD4+ T细胞从未刺激的PBMC中增殖最小(±12 CFSE暗细胞;<strong class="x…

Discussion

基于CFSE的增殖是检测和枚举抗原特异性人类CD4+T细胞的简单而可靠的方法。此前已经证明,使用CFSE的最佳浓度对于最佳结果4至关重要。过多的CFSE会废除增殖,而太少不允许分离和未分割的细胞被区分。相比之下,相对较高的CFSE浓度(5.0μM)用于标记纯化的鼠T细胞3。由于批次之间的变异性,建议对每批进行定位,以确定最佳浓度。我们使用当前批次的浓度(10 nM)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了:青少年糖尿病研究基金会的支持[JDRF 5-CDA-2014-210-A-N](S.M.)。国家健康和医学研究委员会(NHMRC GNT123586)(S.M.),糖尿病澳大利亚研究信托千年奖(Y17M1-MANS)(S.M.),维多利亚州政府运营基础设施支助计划(S.M.,A.D.,E.T.,M.S.)和NHMRC研究生奖学金APP1094337和JDRF博士补发奖学金(硕士)。

Materials

Anti-human CD4-AlexaFluor647 Biolegend 317422 RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ThermoFisher C1157
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 71-7167-00
Glutamax (1x) Gibco 35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 Sino Biological 40010-V07E
Non-Essential amino acids (1x) Gibco 11140
Penicillin/ Streptomycin (1x) Gibco 15070063
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Pooled human serum Australian Red Cross N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63 Purar Chemicals N/A Custom made synthetic peptide
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Tetanus Toxoid protein Statens Serum Intitut N/A

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Cite This Article
Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).

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