मानव एंटीजन-विशिष्ट CD4+ टी कोशिकाओं का परिमाणीकरण Carboxyfluorescein Succinimidyl एस्टर का उपयोग कर
Summary
यहाँ प्रस्तुत करने के लिए एक प्रोटोकॉल है proliferating CD4+ टी कोशिकाओं antigenic प्रोटीन या पेप्टाइड्स डाई कमजोर पड़ने का उपयोग करने के जवाब में. यह परख विशेष रूप से दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के प्रति संवेदनशील है और एंटीजन-विशिष्ट कोशिकाओं की क्लोनिंग की सुविधा के लिए संशोधित किया जा सकता है।
Abstract
वर्णित एक सरल है, इन विट्रो में, मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) में प्रतिजन-विशिष्ट CD4+ टी सेल प्रसार को मापने के लिए डाई कमजोर पड़ने आधारित विधि। स्थिर, गैर विषैले, फ्लोरोसेंट रंगों जैसे कार्बोक्सीफ्लूओरेसिन सuccinimidyl एस्टर (CFSE) का विकास दुर्लभ, एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट धुंधला में कम मात्रा में, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया गया है। इस विधि में वैकल्पिक दृष्टिकोणों पर निम्नलिखित लाभ हैं: (i) यह कम आवृत्ति टी कोशिकाओं के प्रति बहुत संवेदनशील है, (ii) प्रतिजन या एपिटोप का कोई ज्ञान आवश्यक नहीं है, (iii) प्रत्युत्तर कोशिकाओं के फीनोटाइप का विश्लेषण किया जा सकता है, और (iv) व्यवहार्य, प्रत्युत्तर कोशिकाओं को हल किया जा सकता है और आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, जैसे टी सेल क्लोनिंग.
Introduction
सेल-मध्यस्थ प्रतिरक्षा के अध्ययन में एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने और अध्ययन करने की क्षमता महत्वपूर्ण है। हालांकि, ऐसा करने के लिए विशेष रूप से autoantigen-विशिष्ट CD4+ टी सेल प्रतिक्रियाओं, जो बहुत कमजोर और पता लगाने के लिए मुश्किल कर रहे हैं के लिए चुनौतीपूर्ण है. प्रतिजन-विशिष्ट लिम्फोसाइट प्रसार का पता लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली एक आम विधि [3H]-थाइमिडीन है, जो एक रेडियोलेबल न्यूक्लिओटाइड है जिसे प्रसारी कोशिकाओं के डीएनए में शामिल किया गया है। हालांकि [3H]-थाइमिडीन परख डीएनए संश्लेषण का पता लगा सकते हैं, इस विधि कोशिका विभाजन का एक अप्रत्यक्ष उपाय है, क्योंकि डीएनए संश्लेषण mitosis से स्वतंत्र रूप से आरंभ कर सकते हैं (यानी, जीन दोहराव और apoptosis के दौरान1). इस मुद्दे को इस तथ्य से जटिल है कि कोशिकाओं के प्रतिजन-विशिष्ट प्रसार काफी apoptosis में परिणाम कर सकते हैं2,प्रतिजन-विशिष्ट प्रसार के संभावित overestimation के लिए अग्रणी. इसके अलावा, [3H]-थाइमिडीन विधि लिम्फोसाइटों को बढ़ाने के लिए फेनोटाइपिक जानकारी प्रदान नहीं करती है, जैसे CD4+ या PBMCs में वंश प्रसार एंटीजेनिक पेप्टाइड्स के साथ प्रेरित किया।
2003 में, हम CFSE का उपयोग कर पहली डाई कमजोर पड़ने परख प्रकाशित, CFSE आधारित प्रसार परख3,4कहा जाता है. सीएफएसई एक फ्लोरोसेंट डाई है जो इंट्रासेल्यूलर लाइसिन अवशेषों के लिए सहसंयोजक बंधन बनाकर इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन को स्थिर रूप से बांधता है। चूंकि CFSE लेबल प्रोटीन बेटी कोशिकाओंकेबीच समान रूप से विभाजित कर रहे हैं 3, कोशिकाओं है कि विभाजित है प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अविभाजित कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है, जो भी लिम्फोसाइट आबादी की मात्रात्मक phenotyping के लिए अनुमति देता है. वास्तव में, एक सेल के विभाजन की संख्या CFSE-स्टेनिंग के समय से आया है कुछ डिग्री5करने के लिए मापा जा सकता है. हाल ही में, ऐसे CellTrace वायलेट प्रसार डाई (VPD) और CytoTrack डाई के रूप में कई समान रंगों विकसित किया गया है, जो एक समान तरीके से काम6. इस प्रोटोकॉल CFSE पर केंद्रित है, लेकिन सिद्धांतों अन्य संबंधित रंगों के लिए समान रूप से लागू होते हैं।
पेप्टाइड-MHC tetramer धुंधला का पता लगाने और एंटीजन विशेष CD8+ टी कोशिकाओं क्लोनिंग के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है. यह एक सुस्थापित विधि7,8,9,10है ; तथापि, टेट्रामर-आधारित क्लोनिंग के लिए एपिटोप/एमएचसी प्रतिबंध के मौजूदा ज्ञान की आवश्यकता होती है और प्रत्येक एपिटोप के लिए अपने टेट्रामर11की आवश्यकता होती है, जो उपन्यास के विशेष-विशिष्ट टी कोशिकाओं की खोज और क्लोनिंग के दायरे को सीमित करता है। CFSE आधारित प्रसार पेप्टाइड्स, प्रोटीन, या सेल lysates के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सरल और मजबूत दोनों है, और प्रत्युत्तर सीडी 4+ टी कोशिकाओं को डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक और जैव रासायनिक विशेषता में उपयोग के लिए हल किया जा सकता है 12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
CFSE-आधारित प्रसार प्रतिजन-विशिष्ट मानव CD4+ टी कोशिकाओं का पता लगाने और गणना करने के लिए एक सरल और मजबूत तरीका है। यह पहले से ही प्रदर्शित किया गया है कि सीएफएसई के इष्टतम एकाग्रता का उपयोग इष्टतम परिणा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था: किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (एस एम). राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी GNT123586) (एस एम), मधुमेह ऑस्ट्रेलिया अनुसंधान ट्रस्ट मिलेनियम पुरस्कार (Y17M1-MANS) (एस एम), विक्टोरियन सरकार के परिचालन बुनियादी सुविधा सहायता कार्यक्रम (एस एम, ए डी, ई. टी., एम एस), और एनएचएमआरसी स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति APP1094337 और JDRF पीएचडी टॉप-अप छात्रवृत्ति (एम.एस.)
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
