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Immunology and Infection

मानव एंटीजन-विशिष्ट CD4+ टी कोशिकाओं का परिमाणीकरण Carboxyfluorescein Succinimidyl एस्टर का उपयोग कर

doi: 10.3791/59545 Published: June 4, 2019

Summary

यहाँ प्रस्तुत करने के लिए एक प्रोटोकॉल है proliferating CD4+ टी कोशिकाओं antigenic प्रोटीन या पेप्टाइड्स डाई कमजोर पड़ने का उपयोग करने के जवाब में. यह परख विशेष रूप से दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के प्रति संवेदनशील है और एंटीजन-विशिष्ट कोशिकाओं की क्लोनिंग की सुविधा के लिए संशोधित किया जा सकता है।

Abstract

वर्णित एक सरल है, इन विट्रो में, मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) में प्रतिजन-विशिष्ट CD4+ टी सेल प्रसार को मापने के लिए डाई कमजोर पड़ने आधारित विधि। स्थिर, गैर विषैले, फ्लोरोसेंट रंगों जैसे कार्बोक्सीफ्लूओरेसिन सuccinimidyl एस्टर (CFSE) का विकास दुर्लभ, एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट धुंधला में कम मात्रा में, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया गया है। इस विधि में वैकल्पिक दृष्टिकोणों पर निम्नलिखित लाभ हैं: (i) यह कम आवृत्ति टी कोशिकाओं के प्रति बहुत संवेदनशील है, (ii) प्रतिजन या एपिटोप का कोई ज्ञान आवश्यक नहीं है, (iii) प्रत्युत्तर कोशिकाओं के फीनोटाइप का विश्लेषण किया जा सकता है, और (iv) व्यवहार्य, प्रत्युत्तर कोशिकाओं को हल किया जा सकता है और आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, जैसे टी सेल क्लोनिंग.

Introduction

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सेल-मध्यस्थ प्रतिरक्षा के अध्ययन में एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने और अध्ययन करने की क्षमता महत्वपूर्ण है। हालांकि, ऐसा करने के लिए विशेष रूप से autoantigen-विशिष्ट CD4+ टी सेल प्रतिक्रियाओं, जो बहुत कमजोर और पता लगाने के लिए मुश्किल कर रहे हैं के लिए चुनौतीपूर्ण है. प्रतिजन-विशिष्ट लिम्फोसाइट प्रसार का पता लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली एक आम विधि [3H]-थाइमिडीन है, जो एक रेडियोलेबल न्यूक्लिओटाइड है जिसे प्रसारी कोशिकाओं के डीएनए में शामिल किया गया है। हालांकि [3H]-थाइमिडीन परख डीएनए संश्लेषण का पता लगा सकते हैं, इस विधि कोशिका विभाजन का एक अप्रत्यक्ष उपाय है, क्योंकि डीएनए संश्लेषण mitosis से स्वतंत्र रूप से आरंभ कर सकते हैं (यानी, जीन दोहराव और apoptosis के दौरान1). इस मुद्दे को इस तथ्य से जटिल है कि कोशिकाओं के प्रतिजन-विशिष्ट प्रसार काफी apoptosis में परिणाम कर सकते हैं2,प्रतिजन-विशिष्ट प्रसार के संभावित overestimation के लिए अग्रणी. इसके अलावा, [3H]-थाइमिडीन विधि लिम्फोसाइटों को बढ़ाने के लिए फेनोटाइपिक जानकारी प्रदान नहीं करती है, जैसे CD4+ या PBMCs में वंश प्रसार एंटीजेनिक पेप्टाइड्स के साथ प्रेरित किया।

2003 में, हम CFSE का उपयोग कर पहली डाई कमजोर पड़ने परख प्रकाशित, CFSE आधारित प्रसार परख3,4कहा जाता है. सीएफएसई एक फ्लोरोसेंट डाई है जो इंट्रासेल्यूलर लाइसिन अवशेषों के लिए सहसंयोजक बंधन बनाकर इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन को स्थिर रूप से बांधता है। चूंकि CFSE लेबल प्रोटीन बेटी कोशिकाओंकेबीच समान रूप से विभाजित कर रहे हैं 3, कोशिकाओं है कि विभाजित है प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अविभाजित कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है, जो भी लिम्फोसाइट आबादी की मात्रात्मक phenotyping के लिए अनुमति देता है. वास्तव में, एक सेल के विभाजन की संख्या CFSE-स्टेनिंग के समय से आया है कुछ डिग्री5करने के लिए मापा जा सकता है. हाल ही में, ऐसे CellTrace वायलेट प्रसार डाई (VPD) और CytoTrack डाई के रूप में कई समान रंगों विकसित किया गया है, जो एक समान तरीके से काम6. इस प्रोटोकॉल CFSE पर केंद्रित है, लेकिन सिद्धांतों अन्य संबंधित रंगों के लिए समान रूप से लागू होते हैं।

पेप्टाइड-MHC tetramer धुंधला का पता लगाने और एंटीजन विशेष CD8+ टी कोशिकाओं क्लोनिंग के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है. यह एक सुस्थापित विधि7,8,9,10है ; तथापि, टेट्रामर-आधारित क्लोनिंग के लिए एपिटोप/एमएचसी प्रतिबंध के मौजूदा ज्ञान की आवश्यकता होती है और प्रत्येक एपिटोप के लिए अपने टेट्रामर11की आवश्यकता होती है, जो उपन्यास के विशेष-विशिष्ट टी कोशिकाओं की खोज और क्लोनिंग के दायरे को सीमित करता है। CFSE आधारित प्रसार पेप्टाइड्स, प्रोटीन, या सेल lysates के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सरल और मजबूत दोनों है, और प्रत्युत्तर सीडी 4+ टी कोशिकाओं को डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक और जैव रासायनिक विशेषता में उपयोग के लिए हल किया जा सकता है 12,13.

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Protocol

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सभी विषयों परिधीय रक्त के संग्रह से पहले सूचित सहमति दी. पीबीएमसी का उपयोग करने वाले प्रयोगों के लिए नैतिक अनुमोदन सेंट विंसेंट के होस्पटियल (एचआरईसी-ए 135/

1. अभिकर्मक तैयारी

  1. मानव टी सेल मीडिया
    1. पीबीएम की रचना के लिए आरपी-5 मीडिया तैयार करें, जिसमें आरपीएमआई 1640, 1x गैर-जरूरी अमीनो एसिड, एल-ऐलेनिल-एल-ग्लूटामाइन डिपेप्टाइड (2 एमएम), पेनिसिलिन (100 यू/एमएल) /स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.1 एमजी/एमएल) और 5% जमा मानव सीरम (पीएचएस) शामिल हैं।
  2. CFSE स्टॉक समाधान
    1. 5 एमएम की एकाग्रता के साथ एक अंतिम स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए DMSO के $9 एमएल में CFSE के 25 मिलीग्राम भंग करके एक मास्टर स्टॉक तैयार करें।
    2. पीबीएस में मास्टर स्टॉक को कम करके एक कार्य स्टॉक तैयार करें ताकि 10 डिग्री सेल्सियस की कार्य एकाग्रता प्राप्त की जा सके।

2. पूरे रक्त से मानव PBMCs की तैयारी

  1. मानव परिधीय रक्त के 0.5-1.5 x 106 पीबीएमसी/एमएल के बीच आम तौर पर होते हैं। इसलिए, आवश्यक रक्त की मात्रा PBMCs की वांछित संख्या पर निर्भर करता है. कम से कम 1:2 PBS के साथ मानव परिधीय रक्त पतला. पीबीएम को 50 एमएल ट्यूब में 15 एमएल घनत्व प्रवणता माध्यम जोड़कर अलग करें, फिर 35 एमएल पतला रक्त को ओवरले करें।
  2. कमरे के तापमान (आरटी) में मंदी के बिना 15 मिनट के लिए 850 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। यह तीन स्पष्ट परतों में परिणाम होगा: नीचे की परत लाल रक्त कोशिका गोली युक्त, सफेद रक्त कोशिकाओं के साथ घनत्व ढाल मध्यम की मध्यम परत अपने शीर्ष इंटरफ़ेस अस्तर, और शीर्ष प्लाज्मा परत14.
  3. शीर्ष प्लाज्मा परत के लगभग 20 एमएल निकालें. सफेद रक्त कोशिका परत ले लीजिए, लाल रक्त कोशिका गोली से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है. पीबीएस के साथ 3x धोएं और एक हेमोसाइटोमीटर पर ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। पीबीएस में 1 x 106 पीबीएमसी/
  4. गैर-CFSE-सना हुआ कोशिकाओं
    1. इन कोशिकाओं प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मुआवजा नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, unstained और CD4+ एकल सना हुआ कोशिकाओं के शामिल हैं. आरटी में 5 मिनट के लिए एक 10 एमएल ट्यूब, पीबीएस के साथ शीर्ष, और 550 x ग्राम पर अपकेंद्रण करने के लिए प्रत्येक नियंत्रण नमूना PBMC निलंबन के 300 $L जोड़ें।
    2. आरपी-5 मीडिया में 1 x 106 कक्षों/ CFSE-लेबल कोशिकाओं (चरण 2.6.1) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस सीओ2 इनक्यूबेटर में 7 दिनों के लिए इनलेबल किए गए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. सीएफएसई-सना हुआ कोशिकाओं
    1. कोशिकाओं को चरण 2.3 से 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब के पक्ष में सेल निलंबन के 1 एमएल प्रति CFSE कार्य स्टॉक समाधान (10 डिग्री सेल्सियस) के 1.0 $L जोड़ें। ट्यूब कई बार उलटा द्वारा जल्दी से मिक्स. सीएफएसई की अंतिम एकाग्रता 10 एनएम है।
    2. एक 37 डिग्री सेल्सियस /5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट। दाग को रोकने के लिए, आरपी-5 मीडिया के 5 एमएल जोड़ें, 5 550 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए centrifuging द्वारा कोशिकाओं गोली। आरपी-5 मीडिया में 1 x 106/mL पर PBMCs को पुन: निलंबित करें।
    3. एक 10 एमएल ट्यूब के लिए सेल निलंबन के 1.0 एमएल जोड़ें. प्रत्येक प्रतिजन के लिए एक ट्यूब का उपयोग करने के लिए परीक्षण किया जा.
  6. मानव PBMCs और सेल संस्कृति के antigenic उत्तेजना
    1. एक 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 7 दिनों के लिए आरपी-5 मीडिया में एंटीजन के साथ संस्कृति मानव CFSE-लेबल PBMCs। संस्कृति 1 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से (100 $L) एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में 100 डिग्री सेल्सियस के साथ /
      नोट: काम सांद्रता सहित इस्तेमाल किया Antigens, तालिका 1में संक्षेप कर रहे हैं.

3. विरोधी CD4 FACS विश्लेषण के लिए धुंधला

  1. FACS ट्यूबों में सुसंस्कृत कोशिकाओं के Pipette 200 $L, पीबीएस के 1.0 एमएल में 1x कोशिकाओं को धोने 0.1% FCS युक्त, और 5 550 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज .
  2. पीबीएस के 100 डिग्री एल में विरोधी मानव CD4 Alexa Fluor 647 (0.25 mg/mL) के साथ दाग / एक तरफ CFSE लेबल कोशिकाओं का एक नमूना रखें, किसी भी अन्य फ्लोरोफोर्स के साथ बेदाग, FACS CFSE मुआवजा स्थापित करने के लिए उपयोग करने के लिए. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जो 20 मिनट के लिए प्रकाश से सुरक्षित है।
  3. पीबीएस/0.1% एफसीएस के 1 एमएल, आरटी में 5 मिनट के लिए 550 x ग्राम पर अपकेंद्रण जोड़कर कोशिकाओं को धो लें, और पीबीएस/0.1% एफसीएस के 100 $L में फिर से तैयार करें। FACS विश्लेषण से ठीक पहले, सभी ट्यूबों में प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई, 0.1 मिलीग्राम/एमएल) का 1 $L जोड़ें ताकि मृत कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा बाहर रखा जा सके।

4. प्रवाह Cytometric विन्यास और गैटिंग रणनीति

नोट: चित्र 1 मुआवजा नियंत्रण और gating रणनीति सहित FACS विन्यास से पता चलता है.

  1. सभी लिम्फोसाइटों को शामिल करने के लिए आगे तितर बितर (FSC) बनाम साइड स्कैटर (SSC) (चित्र 1A) जनसंख्या को गेट करें।
  2. एपोटोटिक कोशिकाओं को बाहर करने के लिए पीआई नकारात्मक कोशिकाओं पर FSC बनाम PI (चित्र 1B) जनसंख्या को गेट करें।
  3. गैर-फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के लिए एक वोल्टेज आधार रेखा सेट करने के लिए गैर-स्नापित कोशिकाओं का उपयोग करें। CD4-A647 और CFSE के लिए voltages सेट इतना है कि फ्लोरोसेंट संकेत प्रत्येक के लिए 1,000 से नीचे है (चित्र 1C). एकल रंग नियंत्रण CFSE (चित्र 1D) और CD4-A647 (चित्र 1E) का उपयोग करें सकारात्मक फ्लोरोसेंट संकेतों की पुष्टि करने के लिए ($10,000) प्रत्येक रंग के लिए, unstained कोशिकाओं के साथ सेट voltages का उपयोग कर.
  4. CFSE और PI कुछ वर्णक्रमीय ओवरलैप है; CFSE केवल नमूने PI चैनल में कोई संकेत नहीं देता है जब तक कि CFSE फ्लोरेसिस से PI फ्लोरेसिस घटाना करने के लिए क्षतिपूर्ति समायोजित करें।
    नोट: इन फाटकों को यहां विश्लेषण किए गए सभी नमूनों पर लागू किया गया था।

5. एंटीजन-विशिष्ट CD4+ टी सेल प्रसार को एन्यूमरेट करने के लिए सेल डिवीजन इंडेक्स की गणना

नोट: सेल डिवीजन इंडेक्स (सीडीआई) विभाजित कोशिकाओं की संख्या को संदर्भित करता है (CD4+/ CFSEमंद) प्रति 5,000 अविभाजित कोशिकाओं (CD4+/ CFSEउज्ज्वल)। जब अविभाजित CD4+ कक्षों की संख्या बिल्कुल 5,000 नहीं है, तो विभाजित कक्षों की संख्या को प्रति 5,000 अविभाजित कक्षों में विभाजित कोशिकाओं की संख्या व्यक्त करने के लिए सही किया जाता है. उदाहरण के लिए, टेटनस toxoid-विशिष्ट प्रसार का उपयोग कर (चित्र 2D),वहाँ थे 4,930 अविभाजित कोशिकाओं (CFSEउज्ज्वल) और 3,268 विभाजित कोशिकाओं (CFSEमंद); इसलिए, विभाजित कोशिकाओं की सही संख्या है (5,000/4,930) x 3,268 ] 3,304.3.

  1. विभाजित कोशिकाओंकी संख्या को विभाजित कोशिकाओं/5,000 अविभाजित कोशिकाओं की संख्या को प्रतिजन-उत्तेजित समूह से विभाजित कोशिकाओं (प्रति 5,000 अविभाजित कोशिकाओं) की औसत संख्या द्वारा विभाजित कोशिकाओं (तालिका2) के बिना सुसंस्कृत कोशिकाओं से विभाजित की गणना करें ।

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Representative Results

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टेटनस toxoid प्रोटीन के साथ मानव PBMCs के इन विट्रो उत्तेजना में: PBMCs CFSE के साथ दाग और टेटनस toxoid की उपस्थिति में 7 दिनों के लिए प्रेरित किया गया. लगभग सभी दाताओं टेटनस toxoid के लिए एक मजबूत टी सेल प्रतिक्रिया दिखाया क्योंकि वे टीका लगाया गया था, जो टेटनस toxoid एक उपयोगी सकारात्मक नियंत्रण प्रतिजन बनाता है. चित्रा 2 triplicate में दर्शाता है, कि CD4 के CFSE प्रसार+ टी कोशिकाओं unstimulated PBMCs से कम से कम था ($ 12 CFSEमंद कोशिकाओं; चित्र 2A ,B,C),जबकि टेटनस toxoid के जवाब में CD4+ टी कोशिकाओं का एक उल्लेखनीय प्रसार किया गया था (gt; 3,000 CFSEमंद कोशिकाओं; चित्र 2D , ई, एफ).

एंटीजेनिक पेप्टाइड्स के साथ मानव पीबीएमसी की इन विट्रो उत्तेजना: पीबीएमसी को सीएफएसई के साथ दागदिया गया था और मानव प्रोइन्सुलिन सी-पेप्टाइड की उपस्थिति में 7 दिनों के लिए प्रेरित किया गया था। चित्रा 3 प्रकार के साथ एक व्यक्ति के परिधीय रक्त में proinsulin सी-पेप्टाइड-विशिष्ट CD4+ टी कोशिकाओं का पता लगाने को दर्शाता है 1 मधुमेह. प्रसार स्वस्थ दाता PBMC में नहीं मनाया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया). चित्रा 4 में, PBMCs इन्फ्लूएंजा ए वायरस (H1N1 PR8) मैट्रिक्स प्रोटीन प्रसार का प्रदर्शन के साथ प्रेरित; हालांकि, इस दाता के लिए टेटनस-विशिष्ट प्रतिक्रिया अपेक्षाकृत कमजोर थी, और प्रतिक्रियाएं आम तौर पर दाताओं के बीच चर रही हैं।

एक साथ लिया, इन परिणामों का प्रदर्शन है कि परख पूर्ण लंबाई प्रोटीन और लघु सिंथेटिक पेप्टाइड्स का उपयोग किया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1: मुआवजा नियंत्रण और CD4+ टी कोशिकाओं के CFSE आधारित प्रसार के लिए रणनीति gating. इन विट्रो सेल संस्कृति के 7 दिनों के बाद unstimulated PBMCs. लसीकाकोशिकाओं () को प्रोपिडियम आयोडाइड से दागा गया था , और मृत कोशिकाओं (बी) को बाहर करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड-नकारात्मक कोशिकाओं को गेट किया गया था । FACS मुआवजा नियंत्रण unstained कोशिकाओं (सी), अकेले CFSE (डी) के साथ दाग कोशिकाओं और अकेले CD4 के साथ दाग कोशिकाओं शामिल () . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सीएफएसई-सना हुआ टेटनस-विशिष्ट CD4+ टी कोशिकाओं का प्रसार। पीबीएमसी 145 एनजी/एमएल (166 एलएफयू/एमएल) टेटनस टाक्सॉइड की उपस्थिति में 7 दिनों के लिए सीएफएसई-सस्ने और सुसंस्कृत थे। कोशिकाओं CD4 के साथ दाग थे. सीएफएसई कमजोर पड़ने एंटीजन (ए -सी) के बिना दिखाया गया है और टेटनस टोक्सॉइड प्रोटीन (डी-एफ) के जवाब में है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: cfSE-सना हुआ मानव CD4+ टी कोशिकाओं का प्रसार प्रोइंसुलिन सी-पेप्टाइड के जवाब में। CFSE-सना हुआ PBMCs 10 डिग्री सेल्सियस प्रोइंसुलिन सी-पेप्टाइड की उपस्थिति में 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया। कोशिकाओं CD4 के साथ दाग थे. CFSE कमजोर पड़ने प्रकार के साथ एक दाता से PBMC का उपयोग कर दिखाया गया है 1 मधुमेह. सीएफएसई ने अउत्तेजित पीबीएमसी (), टेटनस टोक्सॉइड प्रोटीन प्रेरित (बी) और मानव प्रोविनिन सी-पेप्टाइड में कमजोर पड़ने से पीबीएमसी (सी) को प्रेरित किया । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: इन्फ्लूएंजा ए वायरस (H1N1 PR8) मैट्रिक्स प्रोटीन 1 के जवाब में CFSE-सना हुआ मानव CD4 + टी कोशिकाओं का प्रसार। पीबीएमसी को सीएफएसई से सना हुआ और 0.08 ग्राम/एमएल इन्फ्लूएंजा ए वायरस मैट्रिक्स प्रोटीन 1 की उपस्थिति में 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। कोशिकाओं CD4 के साथ दाग थे. सीएफएसई तनुता अउत्तेजित कोशिकाओं (), टेटनस टॉक्लॉयड प्रेरित कोशिकाओं (बी) और इन्फ्लूएंजा ए वायरस मैट्रिक्स प्रोटीन-उत्तेजित कोशिकाओं (सी) के लिए दिखाया गया है ।      कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Antigen कार्य एकाग्रता
टेटनस टोक्लॉयड प्रोटीन 145 एनजी/
इन्फ्लुएंजा ए एच1एन1 (पीआर 8) मैट्रिक्स प्रोटीन 1 0.08-10 ग्राम/
प्रोइंसुलिन सी-पेप्टाइड PI33-63 10 एनएम

तालिका 1: टेटनस-विशिष्ट CD4+ प्रसार की गणना। CDI गणना unstimulated और टेटनस उत्तेजित मानव PBMC से 5,000 दर्ज प्रवाह साइटोमेट्री घटनाओं का उपयोग कर।

नमूना अविभाजित कोशिकाओं CD4+CFSEउज्ज्वल विभाजित कोशिकाओं CD4+CFSEमंद विभाजित कोशिकाओं की संख्या CFSEमंद/ मतलब विभाजित कोशिकाओं CFSEमंद/
शून्य 1 5,004 11 11 12.3
शून्य 2 4,995 14 14
शून्य 3 5,006 12 12
नमूना अविभाजित कोशिकाओं CD4+CFSEउज्ज्वल विभाजित कोशिकाओं CD4+CFSEमंद विभाजित कोशिकाओं की संख्या CFSEमंद/ विभाजित कोशिकाओं की सीडीआई संख्या (टेटनस) माध्य विभाजित कोशिकाओं (शून्य) मतलब सीडीआई
टेटनस 1 4,930 3,258 3,304.3 268 263.7
टेटनस 2 4,928 3,205 3,251.8 263.7
टेटनस 3 4,910 3,142 3,199.6 259.5

तालिका 2: Antigens CD4+ प्रसार अनुकरण करने के लिए इस्तेमाल किया।

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Discussion

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CFSE-आधारित प्रसार प्रतिजन-विशिष्ट मानव CD4+ टी कोशिकाओं का पता लगाने और गणना करने के लिए एक सरल और मजबूत तरीका है। यह पहले से ही प्रदर्शित किया गया है कि सीएफएसई के इष्टतम एकाग्रता का उपयोग इष्टतम परिणामों के लिए आवश्यक है4. बहुत ज्यादा CFSE प्रसार को समाप्त करता है, जबकि बहुत कम विभाजित और अविभाजित कोशिकाओं को प्रतिष्ठित होने की अनुमति नहीं देता है। इसके विपरीत, सीएफएसई की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता (5.0 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग शुद्ध मरिन टी कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया जाताहै3। बैचों के बीच परिवर्तनशीलता के कारण, यह अनुशंसा की जाती है कि प्रत्येक बैच इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए titated हो. हम मूल प्रकाशन (200 nM)4की तुलना में एक बहुत कम एकाग्रता (10 nM) पर हमारे वर्तमान बैच का उपयोग करें.

इस विधि का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू प्रतिजन खुराक का अनुकूलन है. यह अच्छी तरह से स्थापित किया गया है कि टी कोशिकाओं कम प्रतिजन के साथ सुसंस्कृत और अधिक संवेदनशील हो सकता है और प्रदर्शन बढ़ाया समारोह. यह मूल रूप से एचआईवी पेप्टाइड्स15के संदर्भ में प्रदर्शित किया गया था . इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल टेटनस टोक्सॉइड की मात्रा को भी पहले4 अनुकूलित किया गया है ताकि अत्यधिक संवेदनशील और प्रोलाइज़ेटिव सीडी 4+ टी कोशिकाओं को प्राप्त किया जा सके। दिलचस्प है, यह पहले से पता चला है कि अतिरिक्त प्रतिजन प्रतिजन विशेष प्रसार15कम कर देता है. इसलिए, परिधीय रक्त में दुर्लभ टी सेल आबादी का पता लगाने और गणना करने के लिए, एंटीजन और सीएफएसई एकाग्रता दोनों को अनुकूलित करना अत्यंत महत्वपूर्ण है।

जब से हम पहले मानव डाई कमजोर पड़ने आधारित परख4प्रकाशित, कई इसी तरह के रंगों का विकास किया गया है. हमने पाया है कि CD4+ टी सेल प्रसार कम प्रभावी ढंग से पता चला था जब PKH-26, एक lipophilic डाई, CFSE (अप्रकाशित) की तुलना में इस्तेमाल किया गया था. हम व्यवस्थित बाजार पर अन्य रंगों का परीक्षण नहीं किया है, तो उनकी रिश्तेदार ताकत पर कोई टिप्पणी नहीं है. तथापि, टी सेल प्रसार की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल समान रूप से सभी डाई कमजोर पड़ने प्रसार परख के लिए लागू है.

एक सेल विभाजन सूचकांक (CDI) के रूप में प्रसार व्यक्त प्रतिक्रियाओं के परिमाण की गणना में पृष्ठभूमि प्रसार को शामिल किया गया. हमारे हाथों में, पृष्ठभूमि आमतौर पर कम है (उदा., और 15 घटनाओं/ पृष्ठभूमि प्रसार व्यक्तियों और प्रयोगों के बीच भिन्न होता है. एक अनुपात का उपयोग करना (इस मामले में, CDI) प्रसार की ताकत व्यक्त करने के लिए परिणामों पर इसके प्रभाव को कम करने में कुछ हद तक प्रभावी है. मीडिया में प्रोटीन के लिए पृष्ठभूमि प्रतिक्रियाओं समस्याग्रस्त हो सकता है. यह ऊतक संस्कृति मीडिया है कि मानव सीरम होते हैं का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, नहीं गोजातीय सीरम, के रूप में गोजातीय प्रोटीन एक कमजोर पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया है कि परख की संवेदनशीलता कम उत्तेजित कर सकते हैं. एक उच्च पृष्ठभूमि प्रसार लोग हैं, जो एक हल्के संक्रमण है में पाया गया है, शायद प्रसार है कि संक्रमण के जवाब में विवो में primed है के कारण. ऐसे मामलों में, परख को दोहराया जाना चाहिए एक बार दाता संक्रमण को मंजूरी दे दी है.

CFSE आधारित प्रसार परख कुशलतापूर्वक मानव प्रतिजन-विशिष्ट CD4+ टी कोशिकाओं PBMCs12से सीधे क्लोन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस प्रकिया का उपयोग इंसुलिन12के लिए विशिष्ट CD4+ T कोशिकाओं को क्लोन करने के लिए किया गया है। हाल ही में, प्रोइन्सुलिन सी-पेप्टाइड-विशिष्ट CD4+ टी कोशिकाओं के क्लोनिंग और कार्यात्मक विश्लेषण T1D के रोगजनन में उल्लेखनीय अंतर्दृष्टि प्रदान की है, विशेष रूप से हाल ही में शुरुआत T1D13के साथ रोगियों में .

अंत में, CFSE आधारित प्रसार परख दोनों संवेदनशील और मजबूत है. यह त्वरित और तकनीकी रूप से सरल है और ताजा या cryopreserved PBMC का उपयोग कर किया जा सकता है. बहुरंगा FACS विश्लेषण में CFSE को शामिल करने की क्षमता कई सेल प्रकार युक्त PBMC से टी कोशिकाओं को proliferating के इम्यूनोफेनोटाइप का एक मात्रात्मक उपाय प्रदान करता है, और विस्तार की इस डिग्री डीएनए निगमन का उपयोग परख के साथ संभव नहीं है जैसे [3H]-थाइमिडीन।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था: किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (एस एम). राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी GNT123586) (एस एम), मधुमेह ऑस्ट्रेलिया अनुसंधान ट्रस्ट मिलेनियम पुरस्कार (Y17M1-MANS) (एस एम), विक्टोरियन सरकार के परिचालन बुनियादी सुविधा सहायता कार्यक्रम (एस एम, ए डी, ई. टी., एम एस), और एनएचएमआरसी स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति APP1094337 और JDRF पीएचडी टॉप-अप छात्रवृत्ति (एम.एस.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-human CD4-AlexaFluor647 Biolegend 317422 RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ThermoFisher C1157
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 71-7167-00
Glutamax (1x) Gibco 35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 Sino Biological 40010-V07E
Non-essential amino acids (1x) Gibco 11140
Penicillin/Streptomycin (1x) Gibco 15070063
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Pooled human serum Australian Red Cross N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63 Purar Chemicals N/A Custom made synthetic peptide
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Tetanus Toxoid protein Statens Serum Intitut N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
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मानव एंटीजन-विशिष्ट CD4<sup>+</sup> टी कोशिकाओं का परिमाणीकरण Carboxyfluorescein Succinimidyl एस्टर का उपयोग कर
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Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).More

Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).

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