Vi præsenterer detaljerede protokoller for udførelse af små-vinkel røntgen diffraktion eksperimenter ved hjælp af intakt mus skeletmuskulatur. Med den brede tilgængelighed af transgene musemodeller for menneskelige sygdomme, kan denne eksperimentelle platform danne en nyttig test seng til belysning af det strukturelle grundlag for genetiske muskelsygdomme
Transgene musemodeller har været vigtige værktøjer til at studere forholdet mellem genotype til fænotype for menneskelige sygdomme, herunder dem af skeletmuskulatur. Mus skeletmuskulatur har vist sig at producere høj kvalitet røntgen diffraktion mønstre på tredje generation Synchrotron beamlines giver mulighed for at knytte ændringer på niveauet af genotype til funktionelle fænotyper i sundhed og sygdom ved at bestemme de strukturelle konsekvenser af genetiske ændringer. Vi præsenterer detaljerede protokoller for forberedelse af prøver, indsamling af røntgen mønstre og udvinding relevante strukturelle parametre fra røntgen mønstre, der kan hjælpe guide eksperimenterer ønsker at udføre sådanne eksperimenter for sig selv.
Synchrotron lille vinkel røntgen diffraktion er den foretrukne metode til at studere nm-skala struktur aktivt kontraherende muskel præparater under fysiologiske forhold. Det er vigtigt, at strukturelle oplysninger fra levende eller flået muskel præparater kan opnås i synkry med fysiologiske data, såsom muskelkraft og længde ændringer. Der har været stigende interesse i at anvende denne teknik til at studere det strukturelle grundlag af nedarvede muskelsygdomme, der har deres grundlag i punktmutationer i sarcomeric proteiner. Den muskel Biofysik samfund har været meget aktiv i at generere transgene musemodeller for disse sygdomme hos mennesker, der kunne give ideelle test senge til strukturelle undersøgelser. Nylige publikationer fra vores gruppe1,2,3 og andre4,5 har indikeret, at røntgen mønstrene fra muse extensor digitorum longus (EDL) og soleus musklerne kan give alle de diffraktion information tilgængelig fra mere traditionelle model organismer såsom frø og kanin psoas skeletmuskulatur. En fordel ved mus skeletmuskulatur forberedelse er den lethed af dissektion og udfører grundlæggende membran-intakt, hele muskler fysiologiske eksperimenter. Dimensionerne af dissekeret muskel har tilstrækkelig masse til at give meget detaljerede muskel mønstre i meget korte røntgen eksponering gange (~ millisekund pr ramme) på tredje generation X-ray beamlines.
Muskel X-ray diffraktion mønstre består af de ækvatoriale refleksioner, Meridional refleksioner samt lag linje refleksioner. Den ækvatoriale intensitet ratio (forholdet mellem intensiteten af 1, 1 og 1,0 ækvatoriale refleksioner, I11/i10), er tæt korreleret til antallet af vedlagte Cross-broer, som er proportional med kraften genereret i mus skeletmuskulatur 2. de meridionale refleksioner, der rapporterer periodiciteter inden for de tykke og tynde filamenter, kan anvendes til at anslå glødetrådens udvidelsesmuligheder1,3,6,7. Diffraktion-funktioner, der ikke er på meridianen og ækvator kaldes laglinjer, som opstår fra de omtrent spiralformede myosin hoveder på overfladen af tyk filament rygraden samt de omtrent spiralformede tynde filamenter. Intensiteten af myosin lag linjer er nært beslægtet med graden af bestilling af myosin hoveder under forskellige betingelser2,8. Alle disse oplysninger kan bruges studere adfærd sarcomeric proteiner in situ i sundhed og sygdom.
Synchrotron røntgen diffraktion af muskler er historisk set udført af hold af højt specialiserede eksperter, men fremskridt inden for teknologi og tilgængeligheden af nye data reduktions værktøjer indikerer, at dette ikke altid behøver at være tilfældet. BioCAT Beamline 18ID på den avancerede photon source, Argonne National Laboratory har dedikeret personale og støttefaciliteter til at udføre muskel X-ray diffraktion eksperimenter, der kan hjælpe nybegyndere til feltet komme i gang med at bruge disse teknikker. Mange brugere vælger formelt at samarbejde med biocat-medarbejdere, men et stigende antal brugere finder, at de kan udføre eksperimenterne og analyserne selv, hvilket reducerer byrden på strålinger-medarbejderne. Det primære mål med dette papir er at give uddannelse, der giver potentielle eksperimenterer med de oplysninger, de har brug for at planlægge og udføre eksperimenter på mus skeletmuskulatur system enten på biocat strålinger eller på andre høje flux beamlines omkring verden, hvor disse eksperimenter ville være mulige.
Nylige publikationer fra vores gruppe viste, at røntgen mønstre fra mus skeletmuskulatur kan bruges til at kaste lys over sarcomeric strukturelle oplysninger fra muskel i sundhed og sygdom1,2,3 især med den øgede tilgængelighed af genetisk modificerede musemodeller for forskellige myopatier. Høj opløsning mekaniske undersøgelser på enkelte fibre eller små bundter kombineret med X-ray diffraktion er bedst udført af eksperter. Men hvis, mere beskedne mekaniske oplysninger vil være tilstrækkeligt til dine formål, hele musklen forberedelse tillader indsamling af detaljerede røntgen mønstre fra en simpel forberedelse.
En ren dissektion er nøglen til et vellykket kombineret mekanisk og røntgen eksperiment. Det er meget vigtigt ikke at trække på målet musklen samt andre muskler forbundet med soleus eller EDL muskler under dissektion, da dette kunne rive dele af musklen og føre til reduceret kraft. Det kan også føre til beskadigede indre struktur, der vil forringe røntgen mønstre. Da alt vil sprede sig i Røntgenstrålen, er det vigtigt at rense væk ekstra fedt, kollagen i fascia samt eventuelle hår eller løse stumper af væv, mens du gør følgende protokol. For at reducere yderligere overholdelse i musklen forberedelse, det er også vigtigt at sikkert binde sener til kroge, så tæt som muligt på muskel legemet uden at beskadige den.
Forskellige X-ray eksponeringstider kan give forskellige former for information fra den samme muskel. Ved hjælp af den fulde stråle på 18ID, kan et analyserbart ækvatoriale mønster opnås i en 1 MS eksponering (Se figur 2D). For en analyserbar første myosin Layer line refleksion, en 10 MS total eksponeringstid er typisk påkrævet. At indsamle højere orden Meridional refleksioner såsom M15 (2,8 nm myosin Meridional refleksion) og 2,7 nm actin Meridional refleksion, typisk mindst 1 s samlede eksponering er påkrævet, men mere end 2 s samlede eksponering anbefales til høj nøjagtighed Målinger.
Valget af den optimale røntgen detektor til eksperimentet er vigtigt. For de mest detaljerede røntgen mønstre en tilpasset CCD-detektor, såsom den på BioCAT med ca. 40 μm pixels og ~ 65 μm punkt Spread funktioner i phosphor, kan give mønstre med høj dynamikområde og god rumlig opløsning, men kan kun tage en ramme ad gangen. For tids løste eksperimenter kan photon Counting pixel array-detektoren ved BioCAT indsamle røntgen mønstre ved 500 Hz. Størrelsen på 172 μm pixel med denne detektor giver dog ikke tilstrækkelig rumlig opløsning til detaljerede undersøgelser af den inderste del af meridianen, men er tilstrækkelig til de fleste andre formål. BioCAT erhvervede en foton-tælle detektor med høj opløsning, der giver 75 μm reel opløsning ved maksimal billedhastighed på 9.000 Hz. lignende detektorer af denne type forventes at erstatte de nuværende detektorer til muskel studier i løbet af de næste par år.
Med de meget høje strømme af røntgenstråler på tredje generation synchrotrons, stråling skader er en alvorlig bekymring. Det er altid et godt valg at dæmpe strålen for at levere ikke mere stråle end nødvendigt for at observere de ønskede diffraktions funktioner. Den samme totale røntgen eksponering kan opnås ved at forlænge eksponeringstid fra en svækket stråle. En fordel ved foton optælling pixel array detektorer er, at individuelle rammer kan opsummeres sammen uden støj straf. Selv da, stråling skader er muligt. Tegn på stråling skader omfatter dråbe af maksimal kraft af sammentrækning, udtværing af lag linje refleksioner, selv ændring af muskel farve.
En af begrænsningerne ved den intakte mus skeletmuskulatur forberedelse er vanskeligheden med at opnå sarcomere længde fra den intakte muskel under forsøgene. Musklerne er for tykke til video mikroskopi og laser diffraktion. Mens det med den fremtidige udvikling kan være muligt at anslå sarcomere længde direkte fra diffraktions mønstrene14, er den eneste mulighed på nær sigt at måle den efter eksperimentet som beskrevet her.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning brugt ressourcer af Advanced photon source, en U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science bruger facilitet drives for DOE Office of Science af Argonne National Laboratory under kontrakt nr. DE-AC02-06CH11357. Dette projekt blev støttet af Grant P41 GM103622 fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health. Brugen af Pilatus 3 1M detektor blev leveret af Grant 1S10OD018090-01 fra NIGMS. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis afspejler de officielle synspunkter af National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health.
#5 forceps | WPI | 500342 | |
4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
data accquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
high-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
micro scissor | WPI | 503365 | |
motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |