Summary
우리는 그대로 마우스 골격 근육을 사용하여 작은 각도 X 선 회절 실험을 수행하기위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 인간 질병에 대한 형질전환 마우스 모델의 광범위한 가용성으로,이 실험 플랫폼은 유전 근육 질환의 구조적 기초를 해명하기위한 유용한 테스트 베드를 형성 할 수 있습니다
Abstract
형질전환 마우스 모형은 골격 근의 그들을 포함하여 인간적인 질병을 위한 표현형에 유전자형의 관계를 공부하기 위한 중요한 공구이었습니다. 마우스 골격 근은 3세대 싱크로트론 빔라인에 고품질 X선 회절 패턴을 생성하여 유전자형 수준에서 의 변화를 건강과 질병의 기능적 표현형과 연결하여 결정할 수 있는 기회를 제공하는 것으로 나타났습니다. 유전 적 변화의 구조적 결과. 우리는 표본의 준비를 위한 상세한 프로토콜을 제시하고, 엑스레이 패턴을 수집하고, 그 같은 실험을 스스로 수행하고자하는 실험자를 안내하는 데 도움이 될 수 있는 X 선 패턴에서 관련 구조적 파라미터를 추출합니다.
Introduction
싱크로트론 소형각 X선 회절은 생리적 조건 하에서 근육 제제를 능동적으로 수축시키는 nm 스케일 구조를 연구하기 위한 선택방법이다. 중요한 것은, 살아있는 또는 피부 근육 준비에서 구조적인 정보는 근육 힘 및 길이 변경과 같은 생리적인 데이터와 동기화에서 장악될 수 있습니다. 육종 단백질에 있는 점 돌연변이에 있는 그들의 기초가 있는 승계한 근육 질병의 구조적인 기초를 공부하기 위하여 이 기술을 적용에 있는 관심이 증가하고 있습니다. 근육 생물물리학 공동체는 구조 연구를 위한 이상적인 시험침대를 제공할 수 있는 이 인간적인 질병 조건에 대한 형질전환 마우스 모형 생성에 아주 적극적이었습니다. 우리 그룹 1,2,3 및 기타4,5의 최근 간행물은 마우스 신근 디지튜룸 롱러스 (EDL) 및 발바닥 근육에서 X 선 패턴이 모든 것을 제공 할 수 있음을 나타냈다. 개구리와 토끼 psoas 골격 근육과 같은 전통적인 모델 유기체에서 사용할 수있는 회절 정보. 마우스 골격 근육 제제의 장점은 해부 및 기본 막 손상, 전체 근육 생리 실험을 수행하는 용이성이다. 해부된 근육의 치수는 3세대 X선 빔라인에서 매우 짧은 X선 노출 시간(프레임당 밀리초)에서 매우 상세한 근육 패턴을 산출하기에 충분한 질량을 가지고 있습니다.
근육 X 선 회절 패턴은 적도 반사, 자오선 반사 뿐만 아니라 레이어 라인 반사로 구성됩니다. 적도 강도 비율 (1,1 및 1,0 적도 반사의 강도의 비율, I11/I10),마우스 골격 근육에서 생성 된 힘에 비례하는 부착 된 교차 브리지의 수와 밀접하게 상관됩니다. 2. 두께와 얇은 필라멘트 내에서 주기성을보고 자오선 반사는 필라멘트확장성을 추정하는 데 사용할 수 있습니다 1,3,6,7. 회절 은 자오선과 적도에없는 기능을 층 선이라고, 이는 두꺼운 필라멘트 백본의 표면에 약 helically 정렬 myosin 머리뿐만 아니라 약 helically 정렬 얇은 필라멘트에서 발생합니다. 미오신 층 선의 강도는 다양한 조건하에서 미오신 헤드의 주문 정도와 밀접한 관련이있다2,8. 이 모든 정보는 건강과 질병에 있는 situ에 있는 육종 단백질의 행동을 연구하는 것을 이용될 수 있습니다.
근육의 싱크로트론 X 선 회절은 역사적으로 고도로 전문화된 전문가 팀에 의해 수행되었지만 기술의 발전과 새로운 데이터 감소 도구의 가용성은 이것이 항상 그런 것은 아니라는 것을 나타냅니다. 고급 광자 소스에서 BioCAT 빔 라인 18ID, 아르곤 국립 연구소는 필드에 이민자가 이러한 기술을 사용하여 시작하는 데 도움이 될 수 있습니다 근육 X 선 회절 실험을 수행하기위한 전담 직원과 지원 시설을 보유하고 있습니다. 많은 사용자가 BioCAT 직원과 공식적으로 협력하기로 선택하지만 점점 더 많은 사용자가 실험을 수행하고 분석할 수 있다는 것을 알게 되면 beamline 직원의 부담을 줄일 수 있습니다. 이 백서의 주요 목표는 잠재적인 실험자에게 BioCAT 빔라인 또는 주변의 다른 높은 플럭스 빔라인에서 마우스 골격 근육 시스템에 대한 실험을 계획하고 실행하는 데 필요한 정보를 제공하는 교육을 제공하는 것입니다. 이러한 실험이 가능할 세계입니다.
Protocol
모든 동물 실험 프로토콜은 일리노이 공과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (프로토콜 2015-001, 승인 날짜: 3 11 월 2015)에 의해 승인되었으며 NIH "실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"9 .
1. 사전 실험 준비
- 링거 용액 500 mL(포함: 145 mM NaCl, 2.5 mM KCl,1.0 mM MgSO 4, 1.0 mM CaCl2,10.0 mM HEPES, 11 mM 포도당, pH 7.4)을 실험의 매일 신선하게 준비한다.
- 링거 용액 200 mL을 스프레이 병에 채우고 4 °C 냉장고에 보관하십시오. 링거 용액으로 페트리 접시(직경 10cm)를 채우고 산소 실린더에서 수족관 공기 석에 튜브를 연결하여 100% 산소를 주입합니다. 페트리 접시 ("해부 요리")는 이전에 해부 중에 핀을 삽입 할 수 있도록 탄성 중합체 화합물로 코팅되었습니다.
- 금속 장착 후크를 준비합니다. 직경 0.5mm의 스테인리스 스틸 와이어 두 개를 적절한 길이로 자르고 양쪽 끝에서 와이어를 구부려 후크를 형성합니다. 모든 해부 도구, 가위, 봉합 집게, 사용하기에 편리한 마이크로 가위를 정렬합니다.
참고: 후크 부분은 약 3mm 길이여야 합니다. 긴 와이어 (후크에서 끝나는)는 약 5cm 길이여야하며, 짧은 와이어 (또한 후크에서 끝나는)는 BioCAT에서 사용되는 사용자 정의 챔버에 맞게 약 1cm 길이여야하며 트랜스듀서 암에 대한 충분한 운동 범위를 허용해야합니다. -
모든 장비를 연결하고 켭니다. 여기에는 결합된 모터/힘 트랜스듀서, 모터/포스 트랜스듀서 컨트롤러, 고출력 이중 패시크 전류 자극기, 컴퓨터 제어 데이터 수집/제어 시스템이 포함됩니다.
- 실험10을시작하기 전에 데이터 수집 시스템을 켜고 보정합니다. 간단히 말해서, 알려진 가중치 세트를 추가하여 힘을 보정하고, 선형 진행에서 힘 변환기로 측정된 최대 힘의 최대 50%를 포스 트랜스듀서에 덮고, 출력 전압 변화를 기록합니다. 레버 암에 알려진 출력 전압 세트를 적용하여 길이를 보정하고 암의 길이 변화를 측정합니다.
- 시료 홀더의 열 블록에서 호스를 냉장 순환 욕조에 연결하고 챔버에서 원하는 온도를 10°C에서 40°C 사이로 유지하도록 온도를 설정합니다. 순환 욕조를 다양한 온도로 설정하고 열전대를 사용하여 챔버의 온도를 측정하여 미리 이 것을 결정합니다.
2. 근육 준비
-
마우스 안락사
- 자궁 경부 탈구 에 이어 이산화탄소 흡입에 의해 마우스를 안락사.
- 차가운 링거 용액으로 뒷다리에 피부를 뿌리면 모발이 준비중으로 불어오는 것을 방지합니다. 미세한 해부 가위를 사용하여 허벅지 주위를 절단하여 피부를 제거하고 근육을 노출하기 위해 #5 집게를 사용하여 피부를 빠르게 아래로 당깁니다.
- 뒷다리를 절단하고 산소 링거의 용액으로 채워진 해부 접시로 옮김을 옮김시킨 다음 쌍안경 해부 현미경 아래에 놓습니다.
-
발바닥 근육 준비
- 위절제술을 위쪽으로 향하여 해부하는 접시에 뒷다리를 고정합니다. 위장관/발바닥 근육 그룹의 말단 힘줄을 잘라 미세 가위를 사용하여 위장내 근육의 양쪽에 근막을 절단하여 부드럽고 천천히 근육을 들어 올립니다. 발바닥 근육의 근위 힘줄을 풀어 낸 후 사지에서 위장혈증 /발바닥 근육 그룹을 분리하십시오.
- 해부 접시에 위증 근육과 말단 힘줄을 포함하는 근육 그룹을 고정합니다. 근위 힘줄을 통해 발바닥 근육을 부드럽게 들어 올리고 가능한 한 발바닥 말단 힘줄을 그대로 남기는 위장혈에서 분리하십시오.
-
근근막디지오리움 롱러스(EDL) 근육 준비
- 경골 전방 근육이 위쪽을 향하여 해부 접시에 뒷다리를 고정합니다. 경골 전방 (TA) 근육을 따라 근막을 잘라 집게를 사용하여 명확하게 당깁니다. TA 근육의 말단 힘줄을 식별하고 잘라냅니다. TA 근육을 들어 올리고 EDL 근육을 당기지 않고 조심스럽게 잘라.
- 무릎의 측면을 열고 두 개의 힘줄을 노출 잘라. 근위 힘줄을 잘라, 가능한 한 많은 힘줄을 떠나 여전히 근육에 부착, 부드럽게 힘줄을 당겨 EDL 근육 (내측 근육)를 들어 올립니다. 원위 힘줄이 노출되면 잘라.
-
근육 장착
- 힘줄을 통해 근육을 아래로 고정, 모든 여분의 지방을 손질, 근막과 힘줄 멀리 가능한 한 많이. 하나의 힘줄을 미리 묶은 매듭에 넣고 봉합사를 묶는 집게로 단단히 묶습니다. 금속 후크 주위에 두 번째 매듭을 묶습니다.
- 힘줄의 다른 쪽 끝에 있는 긴 후크와 동일한 절차를 반복합니다. 근육의 몸이 봉합사에 의해 접촉되지 않았는지 확인하십시오. 이렇게 하면 준비가 손상됩니다.
- 짧은 후크를 실험 챔버 의 바닥에 부착하고 긴 후크를 듀얼 모드 힘 트랜스듀서 / 모터에 부착하십시오. 100 % 산소로 실험 챔버에서 용액을 거품.
-
자극 프로토콜 및 근육 길이 최적화
- 트랜스듀서/모터에 부착된 마이크로 매니퓰레이터를 조정하여 근육을 스트레칭하여 최상의 자극 파라미터를 찾기 전에 15~20mN 사이의 기준선 장력을 생성합니다. 자극 전압을 40V로 설정합니다. 자극 전류는 트위치 힘의 추가 증가가 없을 때까지 체계적으로 증가합니다. 발견된 가장 높은 전류는 최대 활성화를 보장하기 위해 약 50% 증가합니다.
- 최적의 길이를 찾아, L0,최대 트위치 힘을 주는 근육 길이로 정의, 근육 길이를 증가 하 고 활성 힘 (피크 힘 마이너스 기준선 힘) 증가 중지 될 때까지 단일 트 위치와 근육을 활성화 하 여.
- 짧은 파상풍 수축(1s 활성화)을 수행하여 마운팅을 테스트하고 필요한 경우 근육을 다시 최적의 기준선 힘으로 늘입니다. 디지털 캘리퍼로 근육 길이를 mm로 기록합니다.
3. 엑스레이 회절
참고: 다음 설명은 고급 광자 소스, 아르곤 국립 연구소에서 BioCAT 빔 라인 18ID에 작은 각도 X 선 회절 기기를 사용하여 수행 X 선 회절 실험에 대한 하지만 유사한 방법은 다른 빔 라인에 사용될 수있다 ESRF(프랑스)의 ID 02, SPring8(일본)의 BL40XU와 같은. 빔라인 18ID는 전체 빔에서 초당 ~10 광자 ~10광자의 입사 플럭스와 함께 12 keV (0.1033 nm 파장)의 고정 X 선 빔 에너지에서 작동된다.
- 검출기 거리(카메라 길이)까지 시편을 선택합니다. 2.7 nm 액틴 및 2.8 nm 자오선 반사와 같은 고차 미오신 반사를 검사하는 실험에 1.8m 카메라 길이를 사용합니다. 자오선과 레이어 라인의 세밀한 디테일에 주로 관심이 있는 다른 실험에는 4-6m 카메라를 사용합니다.
-
빔에서 샘플위치 최적화
- X선에 반응하여 어두운 지점을 생성하는 X선 민감한 용지("화상")를 사용하여 빔 위치를 결정합니다. 그런 다음 비디오 십자선 생성기를 사용하여 용지의 화상 표시에 정렬된 십자선을 만들거나 마커 펜으로 비디오 화면에 표시를 만듭니다.
- BioCAT이 제공된 그래픽 사용자 인터페이스를 샘플 포지셔너에 사용하여 빔 위치의 중심이 되는 근육을 이동합니다. 노출 동안 근육에 X 선 용량을 확산하기 위해 샘플 단계를 이동하여 ~ 10-20 mm /s에서 샘플 챔버를 진동. 근막의 큰 영역을 피하기 위해 이동시 샘플을 관찰 (회절 패턴을 오염 콜라겐을 포함) 그리고 그것의 여행의 전체 경로 동안 조명 유지 되도록.
참고: 3.3 및 3.4 절에서 빔라인이 제공하는 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 필요한 설정 및 작업을 만드는 데 필요한 정확한 단계는 빔라인 및 검출기별입니다. 이러한 작업을 수행하는 방법에 대해 beamline 직원에게 문의하십시오.
-
정의된 정적 상태(휴식 중 또는 등각 부호 조절 중)에서 근육의 고분해능 패턴에 대한 CCD(충전 결합 장치) 감지기 설정
- 제어 소프트웨어에 그래픽 사용자 인터페이스에서 노출 시간 및 노출 기간을 설정합니다. 노출을 하기 전에 어두운 배경 이미지를 가지고 2시간마다 또는 노출 시간을 변경한 후 이 절차를 반복하여 검출기 판독 전자 기기의 드리프트를 수정합니다.
- X선 빔을 노출에 대해 원하는 값으로 감쇠시합니다. 그런 다음 이미지를 가져 가라. 이 검출기로는 이미지 시퀀스를 볼 수 없습니다. CCD 검출기는 개별 이미지를 판독하는 데 몇 초가 필요합니다.
-
해결된 시간 실험을 위해 픽셀 배열 감지기 설정
- 그래픽 사용자 인터페이스에서 이미지 수, 노출 시간, 노출 기간을 설정합니다. 여기에 사용되는 픽셀 어레이 검출기는 판독에 최소 1ms가 필요합니다. 광자 계수 검출기의 최대 프레임 주파수는 500Hz입니다.
- 빔을 원하는 강도로 감쇠시합니다. 검출기를 무장시키고 데이터 수집 시스템에서 트리거를 기다립니다. 기계 및 X선 데이터를 동시에 트리거하여 동기화합니다. X선 패턴은 프로토콜 a 전체에 걸쳐 1 ms 노출 시간 및 2 ms 노출 기간을 통해 지속적으로 수집된다.
참고: 정확한 노출 시간 및 노출 기간은 빔내시료의 관찰수명과 원하는 정보에 대해 사례별로 결정되어야 한다. 선택한 노출 기간에 분석 가능한 데이터를 제공하는 데 필요한 것보다 더 이상 X선 빔을 사용하지 않기 위해 빔을 감쇠시합니다.
4. 실험 후 근육 치료
- 각 기계 및 X 선 실험 후 근육을 복구하고 계량하십시오. 1.06 g/mL 12의 근육 밀도를 가정하여 측정된 근육 길이 및 근육 질량(11)을 사용하여 근육의 단면적을 계산한다.
- 근육을 실험 길이로 스트레칭하고 10 분 동안 10 % 포르말린으로 근육을 고정시고 고정 된 근육을 전체 근육단면 3의 위치에서 선택한 일련의 섬유 묶음으로 분리합니다.
- 비디오 사르카망 길이 측정 시스템을 사용하여 사르카망 길이를 측정합니다.
Representative Results
등각 투영 파상풍 수축. 등위 또는 등위 권위 수축과 같은 모든 종류의 고전적인 근육 기계 실험은 X 선 패턴을 동시에 수집하여 수행 할 수 있습니다. 그림 1 A는 기계 및 X선 실험을 위한 실험 설정을 보여줍니다. 아이소메트릭 파탄성 수축에 대한 예시 힘 추적은 그림 1B에나와 있습니다. 근육은 1 s에 대 한 활성화 하기 전에 0.5 s에 대 한 휴식에 개최 했다. 기계적 기록은 자극 후 1s를 멈춥니다. X선 패턴은 500 Hz에서 1 ms 노출 시간에서 프로토콜 전반에 걸쳐 지속적으로 수집되었습니다.
X 선 회절 패턴. 근육 X선 회절 패턴은 사르메레 내부의 구조로부터 나노미터 분해능 구조 정보를 제공할 수 있다. 근육 X선 회절 패턴은 적도 및 자오선으로 나눈 4개의 등가 사분면으로 구성됩니다. 적도 패턴은 섬유 축에 수직으로 sarcomere 내의 근막 포장에서 발생, 자오선 패턴은 근육 축을 따라 근막에서 구조 정보를보고하는 동안. 적도 또는 자오선에 없는 나머지 반사를 레이어 선이라고 합니다. 층 선 (예를 들어, 도 2A에서MLL4 및 ALL6표지된 특징)은 두꺼운 필라멘트와 얇은 필라멘트를 함유하는 액틴을 함유하는 미오신 내의 분자 소단위의 대략적인 약 나리배열로부터 발생한다. 미오신 계층 라인은 휴식 근육에서 패턴이 강하고 날카롭고 (그림2A), 액틴 기반 층 라인은 수축 근육에서 패턴에서 더 두드러지며 (그림2B). 수축 패턴으로부터 휴식 패턴을 빼서 얻은 차이 패턴(도2C)은 건강하고 병들인 근육의 힘 발달 동안 구조적 변화에 빛을 비출 수 있다. 근육 수축 동안 분자 이벤트의 밀리초 시간 척도에서 이러한 구조적 변화를 따임으로써, X선 회절 패턴은 상당한 구조 정보를 나타낼 수 있다(도2D).
MuscleX를 사용한 데이터 분석. 다음은 MuscleX 패키지의 "적도" 루틴을 사용한 적도 반사 분석의 예입니다(그림 3). MuscleX는 BioCAT13에서개발된 오픈 소스 분석 소프트웨어 패키지입니다. 적도 비(I1,1/I1,0)는미오신이 휴식 근육에서 액틴에 근접한 지표(그림3A)이며, 계약에서 연결된 교차 교량의 수와 밀접하게 상관관계가 있습니다( 그림 3B)뮤린 골격2. 강도 비율, I1,1/I1,0, 약 0.47 휴식 근육과 약 1.2 수축 근육. 두 1,0 반사(2*S1,0)사이의 거리는 필라멘트 간 간격과 반비례합니다. MuscleX에 대한 자세한 설명서와 매뉴얼은 온라인13에서확인할 수 있습니다.
그림 1 : 기계식 및 X선 실험 설정 및 프로토콜. (A) 근육은 실험 챔버 내부의 후크에 한쪽 끝에 장착되고 다른 쪽 끝은 듀얼 모드 모터 / 힘 변환기로 장착됩니다. 그것은 X 선이 통과 할 수 있도록 두 개의 Kapton 필름 창 사이에 개최됩니다. 챔버는 실험 전반에 걸쳐 100 % 산소와 함께 주입 링거의 용액으로 채워져 있습니다. (B) 파상풍 수축 동안 근육에 대한 X 선 실험을위한 기계적 프로토콜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : EDL X선 회절 패턴. EDL 근육 X 선 회절 패턴에서휴식 (A) 및 수축 (B) 근육. (C) 휴식 패턴과 수축 패턴의 차이 패턴. 파란색 영역은 휴식 패턴의 고강도를 나타내고 노란색 영역은 수축 패턴에서 높은 강도를 나타냅니다. (D) EDL 근육을 가진 1 ms 노출에서 X 선 회절 패턴. MLL1 = 첫 번째 차묘신 층선; MLL4 = 4차 미오신 층선; ALL1 = 1차 액틴 층 라인 ALL6 = 6차 액틴 층 선; ALL7 = 7차 액틴 층선; Tm = 트로포미오신 반사(흰색 상자로 표시); M3 = 3차 자오선 반사; M6 = 6차 자오선 반사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : MuscleX를 이용한 적도 패턴의 데이터 분석. 배경 빼기 적도 강도 비율 프로파일 (동안 영역) 및 처음 다섯 주문 (녹색 선) 각 피크의 강도를 계산하는 적합했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
우리 그룹에서 최근 간행물은 마우스 골격 근육에서 엑스레이 패턴이 건강과 질병 1,2,3특히 근육에서 육종 구조 정보에 빛을 발산하는 데 사용할 수 있음을 보여 주었다 다양한 근병증에 대한 유전자 변형 마우스 모델의 가용성이 증가합니다. X선 회절과 결합된 단일 섬유 또는 작은 다이프에 대한 고해상도 기계 연구는 전문가가 수행하는 것이 가장 좋습니다. 그러나, 더 겸손한 기계 정보가 당신의 목적을 위해 충분하다면, 전체 근육 준비는 간단한 준비에서 상세한 엑스레이 패턴의 수집을 허용합니다.
깨끗한 해부는 성공적인 기계적 및 X선 실험의 핵심입니다. 이 근육의 일부를 찢어 감소 힘으로 이어질 수 있기 때문에 해부 하는 동안 발바닥 또는 EDL 근육과 관련 된 다른 근육 뿐만 아니라 대상 근육에 당기지 않는 것이 매우 중요 하다. 또한 X 선 패턴을 저하시키는 손상된 내부 구조로 이어질 수 있습니다. 모든 것이 X 선 빔에 흩어지기 때문에 다음 프로토콜을 수행하는 동안 여분의 지방, 근막의 콜라겐뿐만 아니라 머리카락이나 느슨한 조직의 조각을 청소하는 것이 중요합니다. 근육 준비에 추가 준수를 줄이기 위해, 그것은 또한 단단히 후크에 힘줄을 연결 하는 것이 중요 하다, 그것을 손상 하지 않고 근육 몸에 가능한 한 가까이.
다른 엑스레이 노출 시간은 동일한 근육에서 정보의 다른 종류를 제공할 수 있습니다. 18ID상에서 전체 빔을 사용하여, 분석 가능한 적도 패턴을 1 ms 노출에서 얻을 수 있다(도 2D참조). 분석 가능한 첫 번째 미오신 층 라인 반사의 경우 일반적으로 총 노출 시간이 10ms가 필요합니다. M15 (2.8 nm myosin 자오선 반사) 및 2.7 nm 액틴 자오선 반사와 같은 더 높은 차수의 자오선 반사를 수집하려면 일반적으로 적어도 1 s의 총 노출이 필요하지만 2 s 이상의 총 노출은 높은 정확도를 위해 권장됩니다. 측정.
실험을 위한 최적의 X선 검출기의 선택은 중요합니다. 가장 상세한 X선 패턴의 경우, 인광체의 40 μm 픽셀 및 ~65 μm 포인트 확산 기능을 갖춘 BioCAT의 CCD 검출기와 같은 맞춤형 CCD 검출기는 높은 동적 범위와 양호한 공간 해상도의 패턴을 제공할 수 있지만 한 번에 한 프레임만 걸릴 수 있습니다. 시간이 해결된 실험을 위해 BioCAT의 광자 계수 픽셀 배열 검출기는 500Hz에서 X선 패턴을 수집할 수 있습니다. 그러나 이 검출기가 있는 172 μm 픽셀 크기는 자오선 내부 부분에 대한 상세한 연구에 충분한 공간 해상도를 제공하지 는 않지만 대부분의 다른 용도에 적합합니다. BioCAT은 9,000Hz의 최대 프레임 속도로 75μm의 실제 분해능을 제공하는 고해상도 광자 계수 검출기를 획득했습니다.
3 세대 싱크로트론에서 X 선의 매우 높은 플럭스로 방사선 손상은 심각한 관심사입니다. 원하는 회절 피처를 관찰하는 데 필요한 것보다 더 많은 빔을 전달하기 위해 빔을 감쇠하는 것이 좋습니다. 감쇠된 빔에서 노출 시간을 연장하여 동일한 총 X선 노출을 달성할 수 있습니다. 광자 계수 픽셀 배열 검출기의 장점은 개별 프레임을 노이즈 페널티 없이 함께 합산할 수 있다는 것입니다. 그렇다 하더라도 방사선 손상이 가능합니다. 방사선 손상의 징후는 수축의 최대 힘의 하락, 층 선 반사의 번짐, 심지어 근육 색상의 변화를 포함합니다.
본래 마우스 골격 근 제제의 한계 중 하나는 실험 동안 손상되지 않은 근육으로부터 sarcomere 길이를 얻는 데 어려움이 있다는 것이다. 근육은 비디오 현미경 검사법 및 레이저 회절을 위해 너무 두껍습니다. 향후 개발과 함께 회절패턴(14)으로부터직접 sarcomere 길이를 추정할 수 있지만, 단기적으로 유일한 옵션은 여기에 설명된 바와 같이 실험 후 이를 측정하는 것이다.
Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 고급 광자 소스의 자원을 사용, 에너지의 미국 학과 (DOE) 과학 사용자 시설의 사무실은 계약 번호에 따라 아르곤 국립 연구소에 의해 과학의 DOE 사무실을 위해 운영. DE-AC02-06CH11357. 이 프로젝트는 건강의 국립 연구소의 일반 의학의 국립 연구소에서 부여 P41 GM103622에 의해 지원되었다. Pilatus 3 1M 검출기의 사용은 NIGMS로부터 부여 1S10OD018090-01에 의해 제공되었다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 일반 의학 연구소 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 반영하지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | WPI | 500342 | |
| 4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
| Aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
| Data acquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
| Elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
| High-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
| Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro scissor | WPI | 503365 | |
| Motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
| Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
| Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
| Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |
References
- Ma, W., et al. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
- Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
- Kiss, B., et al. Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).
- Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).
- Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q). Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).
- Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle. Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).
- Wakabayashi, K., et al. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction. Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).
- Anderson, R., et al. Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
- National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). , National Academies Press. (2011).
- Rand, C. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC. , Available from: https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/ (2017).
- Alexander, R. M. V. A. The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert. Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).
- Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb. Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).
- Jiratrakanvong, J., et al. MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).
- Reconditi, M., et al. Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).
