Summary
我们提出了使用完整的小鼠骨骼肌肉进行小角度X射线衍射实验的详细方案。该实验平台具有广泛的人类疾病转基因小鼠模型,可形成一个有用的试验台,用于阐明遗传性肌肉疾病的结构基础。
Abstract
转基因小鼠模型是研究基因型与表型对人类疾病(包括骨骼肌)的表型关系的重要工具。小鼠骨骼肌已被证明能在第三代同步辐射束线上产生高质量的X射线衍射模式,通过确定基因型水平的变化与健康和疾病的功能表型联系起来提供了机会基因变化的结构后果。 我们提出了制备标本的详细方案,收集了X射线模式,并从X射线模式中提取相关的结构参数,这些可能帮助指导希望自己进行此类实验的实验者。
Introduction
同步加速器小角度X射线衍射是研究生理条件下主动收缩肌肉制剂的纳米尺度结构的首选方法。重要的是,从活或皮肤肌肉制剂的结构信息可以与生理数据同步获得,如肌肉力和长度变化。人们越来越关注应用这项技术来研究遗传性肌肉疾病的结构基础,这些疾病在肉瘤蛋白的点突变中具有基础。肌肉生物物理学界一直非常积极地为这些人类疾病条件生成转基因小鼠模型,为结构研究提供理想的试验台。我们组1、2、3和其他4、5的近期出版物表明,来自小鼠扩展器(EDL)和底板肌肉的X射线模式可以提供所有衍射信息可从更传统的模型生物,如青蛙和兔子骨骼肌。小鼠骨骼肌制剂的一个优点是易于解剖,并进行基本的膜保存,整个肌肉生理实验。解剖肌肉的尺寸有足够的质量,在第三代X射线光束线上非常短的X射线暴露时间(每帧+毫秒)产生非常详细的肌肉模式。
肌肉X射线衍射模式由赤道反射、经线反射以及图层线反射组成。赤道强度比(1,1 和 1,0 赤道反射的强度比,I11/I10)与附加交叉桥的数量密切相关,这与小鼠骨骼肌产生的力成正比2.在厚细细丝内报告周期性的经络反射可用于估计细丝扩展性 1、3、6、7。不在子午线和赤道上的衍射特征称为层线,其产生于厚细丝骨干表面的近似有序肌苷头以及近似有序的细细细细丝。肌苷层线的强度与肌苷头在各种条件下的排序程度密切相关2、8。所有这些信息都可以用来研究肉瘤蛋白在原位在健康和疾病中的行为。
同步加速器 X 射线肌肉衍射历来由高度专业化的专家团队完成,但技术的进步和新的数据缩减工具的可用性表明,这种情况并不总是如此。在阿贡国家实验室高级光子源的 BioCAT Beamline 18ID 上,有专门的工作人员和支持设施,用于执行肌肉 X 射线衍射实验,帮助新来者开始使用这些技术。许多用户选择与 BioCAT 员工正式协作,但越来越多的用户发现他们可以自行进行实验和分析,以减轻梁线员工的负担。本文的主要目标是提供培训,为潜在的实验者提供所需的信息,以在 BioCAT 光束线或围绕世界,这些实验将是可能的。
Protocol
所有动物实验协议均获得伊利诺斯州理工学院动物护理和使用委员会的批准(协议 2015-001,批准日期:2015 年 11 月 3 日),并遵循 NIH 的《实验室动物护理和使用指南》9.
1. 实验前准备
- 每天为实验新鲜制备 500 mL 的林格溶液(包含:145 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.0 mM MgSO 4、1.0 mM CaCl2、10.0mM HEPES、11 mM 葡萄糖、pH 7.4)。
- 将 200 mL 的林格溶液装在喷雾瓶中,储存在 4°C 的冰箱中。用林格溶液填充培养皿(直径10厘米),通过将管子从氧气瓶连接到水族馆空气石,注入100%氧气。培养皿("解剖菜肴")以前涂有弹性体化合物,以便在解剖过程中插入销。
- 准备金属安装钩。将两条直径为 0.5 mm 的不锈钢丝切割到适当的长度,并在两端弯曲导线以形成挂钩。安排所有的解剖工具,剪刀,缝合绑钳,微剪刀方便使用。
注:挂钩部分应长约 3 mm。较长的导线(以钩结束)应长约 5 厘米, 较短的导线(也以挂钩结束)应长约 1 厘米,以便适合 BioCAT 中使用的定制腔室,并允许传感器臂有足够的运动范围。 -
连接并打开所有设备。这包括组合电机/力传感器、电机/力传感器控制器、大功率双相电流刺激器以及计算机控制的数据采集/控制系统。
- 在开始实验10之前,打开数据采集系统并对其进行校准。简而言之,通过在力传感器上添加一组已知权重(覆盖力传感器在线性级数中测量的最大力的 50%)来校准力,并记录输出电压变化。通过将一组已知输出电压施加到操纵臂上,并测量臂的长度变化,校准长度。
- 将样品架上的热块中的软管连接到冷藏循环槽,并将温度设置为将造型室所需的温度保持在 10°C 和 40°C 之间。通过将循环槽设置为一系列温度,并通过热电偶测量腔室中的温度,提前确定这一点。
2. 肌肉准备
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使鼠标安乐死
- 通过吸入二氧化碳,然后宫颈脱位,使小鼠安乐死。
- 用冷环的溶液喷洒后肢的皮肤,以防止头发吹入制剂中。使用精细的解剖剪刀将皮肤切离大腿周围,然后用#5钳子快速拉下皮肤,露出肌肉,从而去除皮肤。
- 截肢后肢,将其转移到一个解剖盘中,里面装满了含氧环的溶液,然后放在双目解剖显微镜下。
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准备单底肌
- 将后肢固定在解剖盘中,将胃肠肌肉朝上。切下胃内膜/单肌群的远端肌腱,用精细剪刀切开胃内膜肌肉两侧的筋膜,轻轻、缓慢地抬起肌肉。释放独身肌的近肌腱后,从肢体分离出胃内肌/单体肌群。
- 将包含胃肠肌和远端肌腱的肌肉组固定在解剖盘中。通过近端肌腱轻轻抬起底肌,并将其与胃肠肌分离,使尽可能完整地保持底性远端肌腱。
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准备扩展器长龙 (EDL) 肌肉
- 将后肢固定在解剖盘中,将前肌朝上。沿着 tibialis 前部 (TA) 肌肉切开筋膜,并用钳子将其拉清楚。识别并切割 TA 肌肉的远端肌腱。提起 TA 肌肉,小心地切掉它,而不拉 EDL 肌肉。
- 切开膝盖的侧侧,露出两个肌腱。切近肌腱,留下尽可能多的肌腱仍然连接到肌肉,并通过轻轻地拉肌腱提升EDL肌肉(中肌)。一旦暴露,切开远端肌腱。
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安装肌肉
- 通过肌腱固定肌肉,并尽可能修剪所有多余的脂肪,筋膜和肌腱。将一个肌腱插入预绑结中,将缝合线与缝合绑紧。把第二个结系在金属钩周围。
- 在肌腱的另一端使用长钩重复相同的步骤。确保缝合线没有接触肌肉的身体。这将损坏准备。
- 将短钩连接到实验室底部,将长钩连接到双模力传感器/电机。在实验室中用100%氧气泡溶液。
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优化刺激方案和肌肉长度
- 在找到最佳刺激参数之前,通过调整连接到传感器/电机的微操作器来拉伸肌肉,以产生 15 到 20 mN 之间的基线张力。将刺激电压设置为 40 V。刺激电流有计划地增加,直到抽搐力没有增加。发现的最高电流增加约 50%,以确保超大激活。
- 找到最佳长度,L0,定义为给予最大抽搐力的肌肉长度,通过增加肌肉长度和激活肌肉与一个单一的抽搐,直到主动力(峰值力减去基线力)停止增加。
- 执行短破伤风收缩(1 s 激活),以测试安装,并在必要时将肌肉拉伸回最佳基线力。使用数字卡钳记录以毫米为单位的肌肉长度。
3. X射线衍射
注:以下描述适用于使用位于阿贡国家实验室高级光子源的 BioCAT 光束线 18ID 上的小角度 X 射线衍射仪器进行的 X 射线衍射实验,但类似的方法可用于其他光束线如 ESRF(法国)的 ID 02 和 SPring8(日本)的 BL40XU。光束线18ID在12 keV(0.1033 nm波长)的固定X射线光束能量下工作,整光束的射动量为±1013光子/秒。
- 选择一个样本以检测器距离(摄像机长度)。使用 1.8 m 相机长度进行实验,检查 2.7 nm 肌苷和高阶肌苷反射,如 2.8 nm 经线反射。使用4-6米的摄像头进行其他实验,其中人们主要对子午线和图层线的精细细节感兴趣
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优化样品在光束中的位置
- 使用一块 X 射线敏感纸确定光束位置,该纸张可产生一个暗点以响应 X 射线("烧伤")。然后,使用视频十字发发生器创建与纸张上的烧伤标记对齐的十字线,或者只需使用记号笔在视频屏幕上做标记即可。
- 使用 BioCAT 提供的图形用户界面到样本定位器移动肌肉以以光束位置为中心。通过移动样品级以±10-20 mm/s振荡样品室,以便在暴露期间将X射线剂量分散到肌肉上。观察样品,因为它移动,以避免大面积的筋膜(含有胶原蛋白,这将污染衍射模式),并确保它保持其整个路径的照明。
注:第 3.3 和 3.4 节中使用光束线提供的图形用户界面进行所需的设置和操作所需的具体步骤将特定于光束线和探测器。询问横梁工作人员如何执行这些操作。
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设置 CCD(电荷耦合装置)探测器,用于在定义的静态状态(静止或等轴测收缩期间)从肌肉获得高分辨率模式
- 在控制软件的图形用户界面中设置曝光时间和曝光期。在拍摄曝光前拍摄深色背景图像,每 2 小时或更改曝光时间后重复此过程,以纠正探测器读出电子装置中的任何漂移。
- 将 X 射线光束衰减到曝光所需的值。然后拍摄图像。无法使用此探测器拍摄图像序列。CCD 探测器还需要几秒钟才能读出单个图像。
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设置像素阵列检测器一段时间已解决的实验
- 在图形用户界面中设置图像数量、曝光时间、曝光周期。此处使用的像素阵列检测器至少需要 1 毫秒才能读出。光子计数探测器的最大帧频率为500赫兹。使用光子计数检测器输出信号控制X射线快门。
- 将光束衰减到所需的强度。臂上探测器并等待数据采集系统中的触发器。通过同时触发机械和 X 射线数据来同步它们。X射线模式在整个协议A中连续收集,曝光时间为1毫秒,曝光期为2毫秒。
注:确切的暴露时间和暴露期应根据所需信息和观察光束中样品的寿命逐案确定。衰减光束,以便使用不超过在所选曝光期间提供可分析数据的 X 射线光束。
4. 实验后肌肉治疗
- 每次机械和X光实验后,恢复并称量肌肉。计算肌肉的横截面面积使用测量的肌肉长度和肌肉质量11假设肌肉密度为1.06 g/mL12。
- 伸展肌肉到实验长度,并将肌肉固定在10%的正因10分钟。 分离固定肌肉成一系列纤维束选择从位置整个肌肉横截面3。
- 使用视频沙科米长度测量系统测量沙科美尔长度。
Representative Results
等轴测破伤风收缩。任何类型的经典肌肉机械实验,如等轴测或等向收缩,都可以同时采集X射线模式。图 1A显示了机械和 X 射线实验的实验设置。等轴测破伤风收缩的力跟踪示例如图1B所示。肌肉在休息时保持0.5s,然后激活1s。刺激后,机械记录停止 1 s。X射线模式在500 Hz的1ms曝光时间下在整个协议中连续收集。
X 射线衍射模式。肌肉X射线衍射模式可以从沙科雷内部的结构中提供纳米分辨率的结构信息。肌肉X射线衍射模式由四个等效的象限组成,由赤道和子午线分开。赤道模式产生于垂直于纤维轴的丝线内肌丝包装,而经络模式则报告沿肌肉轴的肌丝结构信息。不包括在赤道或子午线上的剩余反射称为图层线。层线(例如,图2A中标有MLL4和ALL6的特征)产生于含有厚丝和含有细丝的肌苷内的分子亚单位的近似螺旋排列。基于肌苷的层线在休息肌肉的图案中是强而锋利的(图2A),而基于肌苷的层线在收缩肌肉的图案中更为突出(图2B)。从收缩模式中减去休息模式获得的差异模式(图2C)可以揭示健康肌肉和病变肌肉在力量发育过程中的结构变化。通过在肌肉收缩期间分子事件的毫秒时间尺度上跟踪这些结构变化,X射线衍射模式可以揭示大量的结构信息(图2D)。
使用 MuscleX 进行数据分析。下面是使用 MuscleX 包中的"赤道"例程进行赤道反射分析的示例(图 3)。MuscleX是生物分阴抗第13开发的开放源码分析软件包。赤道强度比 (I1,1/I1,0) 是肌苷在静息肌肉中活动强度的接近度(图 3A),而它与收缩中附加的跨桥数量密切相关(图3B) 鼠骨骼肌2。强度比,I1,1/I1,0,在休息肌肉中约为0.47,收缩肌肉约为1.2。两个 1,0 反射 (2+S1,0) 之间的距离与灯丝间距成反比。肌肉X的详细文档和手册可在线13。
图 1:机械和X射线实验设置和协议。(A) 肌肉一端安装在实验室内的挂钩上,另一端安装在双模电机/力传感器上。它位于两个 Kapton 胶片窗口之间,以便 X 射线通过。整个实验过程中,腔室都充满了 Ringer 溶液,并注入 100% 的氧气。(B) 破伤风收缩期间对肌肉进行X射线实验的机械方案。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:EDL X射线衍射模式。EDL肌肉X射线衍射模式从休息 (A) 和收缩 (B) 肌肉.(C) 休息模式和收缩模式之间的差异模式.蓝色区域表示休息模式的高强度,而黄色区域表示收缩模式中的高强度。(D) X射线衍射模式从 1 ms 接触 EDL 肌肉.MLL1 = 一阶肌苷层线;MLL4 = 四阶肌苷层线;ALL1 = 第一顺序行为层线 ALL6 = 第六阶行为执行层线;ALL7 = 第七阶行为层线;Tm = 对肌肽反射(用白色框表示);M3 = 三阶经线反射;M6 = 第六阶经线反射。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:使用 MuscleX 的赤道模式数据分析。背景减去赤道强度比剖面(而面积)和前五个阶(绿线)适合计算每个峰值的强度。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
我们小组最近的出版物显示,小鼠骨骼肌的X射线模式可以用来揭示肌肉在健康和疾病1,2,3的肉质结构信息,特别是各种月经的转基因小鼠模型的可得性增加。专家最好对单纤维或小束与 X 射线衍射进行高分辨率机械研究。然而,如果更温和的机械信息足以满足您的目的,整个肌肉准备允许从简单的准备收集详细的X射线模式。
清洁解剖是成功进行机械和X射线联合实验的关键。在解剖过程中,不要拉目标肌肉以及与底部或 EDL 肌肉相关的其他肌肉,这是非常重要的,因为这会撕裂部分肌肉并导致力量减少。它还可能导致内部结构损坏,从而降低 X 射线模式。由于一切都会分散在X射线束中,因此在做以下方案时,清除任何多余的脂肪、筋膜中的胶原蛋白以及任何毛发或松散的组织位非常重要。为了减少肌肉准备的额外依从性,还必须将肌腱牢固地绑在钩子上,尽可能靠近肌肉体,而不会损坏肌腱。
不同的X射线暴露时间可以提供不同类型的信息从相同的肌肉。使用18ID上的全光束,可以在1毫秒的曝光中获得可分析的赤道模式(见图2D)。 对于可分析的第一个肌苷层线反射,通常需要 10 毫秒的总曝光时间。要收集更高阶的经线反射,如 M15(2.8 nm 肌苷经反射)和 2.7 nm 行为内经反射,通常需要至少 1 s 的总曝光,但建议超过 2 s 的总曝光,以获得高精度测量。
为实验选择最佳X射线探测器非常重要。对于最详细的 X 射线模式,定制的 CCD 探测器(如 BioCAT 中具有约 40 μm 像素和荧光粉中 ±65 μm 点扩散功能的探测器)可提供具有高动态范围和良好空间分辨率的模式,但一次只能拍摄一帧。 对于时间解析的实验,BioCAT 的光子计数像素阵列探测器可以收集 500 Hz 的 X 射线模式。然而,该探测器的172 μm像素大小不足以为子午线内部部分的详细研究提供足够的空间分辨率,但足以用于大多数其他目的。BioCAT获得了一个高分辨率光子计数探测器,最大帧速率为9,000 Hz,提供75μm的实际分辨率。 类似的此类探测器有望在未来几年内取代目前用于肌肉研究的探测器。
由于第三代同步加速器的X射线通量很高,辐射损伤是一个严重的问题。衰减光束始终是一个不错的选择,以便不提供比观察所需衍射特性所需的光束更多的光束。通过延长衰减光束的曝光时间,可以实现相同的 X 射线总曝光。光子计数像素阵列检测器的一个优点是,单个帧可以一起求和,无需干扰。即便如此,辐射损伤也是可能的。辐射损伤的迹象包括收缩最大力的下降,层线反射的涂抹,甚至肌肉颜色的变化。
完整的小鼠骨骼肌制剂的局限性之一是难以在实验中从完整肌肉获得沙科雷长度。肌肉太厚,无法进行视频显微镜和激光衍射。虽然随着未来的发展,有可能直接从衍射模式14中估计沙科梅长度,但在短期内,唯一的选择就是在实验后测量它,如下所述。
Disclosures
提交人宣称,他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究利用了美国能源部(DOE)科学用户设施办公室"高级光子源"的资源,该办公室由阿贡国家实验室根据合同号为能源能源科学办公室运营。DE-AC02-06CH11357。该项目得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所P41 GM103622的资助。来自NIGMS的授予1S10OD018090-01提供了Pilatus 3 1M探测器的使用。内容完全由作者负责,不一定反映国家普通医学研究所或国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | WPI | 500342 | |
| 4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
| Aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
| Data acquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
| Elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
| High-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
| Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro scissor | WPI | 503365 | |
| Motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
| Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
| Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
| Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |
References
- Ma, W., et al. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
- Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
- Kiss, B., et al. Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).
- Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).
- Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q). Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).
- Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle. Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).
- Wakabayashi, K., et al. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction. Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).
- Anderson, R., et al. Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
- National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). , National Academies Press. (2011).
- Rand, C. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC. , Available from: https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/ (2017).
- Alexander, R. M. V. A. The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert. Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).
- Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb. Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).
- Jiratrakanvong, J., et al. MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).
- Reconditi, M., et al. Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).
