Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

צילום רנטגן של שריר השלד Murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים

Published: July 18, 2019 doi: 10.3791/59559
Automatic Translation
1, 1
1BioCAT, Dept. of Biological Sciences, Illinois Institute of Technology

Summary

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לביצוע ניסויים קטנים בזווית רנטגן באמצעות שרירי השלד בעכבר ללא שינוי. בעזרת הזמינות הרחבה של דגמי העכבר הטרנסגניים למחלות אנושיות, פלטפורמה ניסיונית זו יכולה ליצור מיטת בדיקה שימושית להסבר בסיס מבני של מחלות שרירים גנטיות

Abstract

מודלים העכבר הטרנסגניים היו כלים חשובים ללימוד הקשר של גנוטיפ כדי פניטיפים עבור מחלות האדם כולל אלה של שריר השלד. שריר השלד העכבר הוכח לייצר באיכות גבוהה X-ray עקיפה דפוסי על הדור השלישי סינכרוטרון beamlines מתן הזדמנות לקשר שינויים ברמה של גנוטיפ לפנוטיפים פונקציונליים בבריאות ומחלה על ידי קביעת ההשלכות המבבניות של שינויים גנטיים. אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להכנת דגימות, איסוף דפוסי רנטגן ומיצוי פרמטרים רלוונטיים מבניים מדפוסי רנטגן שעשויים לסייע להנחות ניסויים לבצע ניסויים כאלה לעצמם.

Introduction

סינכרוטרון קטן זווית X-ray עקיפה היא שיטת הבחירה עבור לימוד מבנה ננומטר בקנה מידה של הכנות באופן פעיל ההכנות שרירים בתנאים פיסיולוגיים. חשוב מכך, מידע מבני מהחיים או ההכנות לשרירי העור ניתן להשיג בסנכרון עם נתונים פיזיולוגיים, כגון כוח השריר ושינויי אורך. יש כבר עניין גובר על יישום טכניקה זו כדי ללמוד את הבסיס המבני של מחלות שרירים תורשתית כי יש בסיס שלהם מוטציות נקודה בחלבונים sarcomeric. הקהילה ביופיזיקה שרירים היתה פעילה מאוד ביצירת מודלים העכבר הטרנסגניים עבור מצבים אלה המחלה האנושית שיכול לספק מיטות בדיקה אידיאלית למחקרים מבניים. הפרסומים האחרונים של הקבוצה שלנו1,2,3 ואחרים4,5 הראו כי דפוסי רנטגן של העכבר פושט השרירים הארוך (אדי) ושרירי הסוליה יכולים לספק את כל ה מידע עקיפה זמין אורגניזמים מסורתיים יותר מודל כגון צפרדע וארנבת psoas שריר השלד. יתרון של הכנה השלד שריר העכבר הוא הקלות של הניתוח וביצוע ממברנה בסיסית-שלמים, ניסויים פיזיולוגיים שרירים שלמים. הממדים של השריר גזור יש מספיק מסה כדי להניב דפוסי שריר מפורטים מאוד בזמני חשיפה קצרים מאוד רנטגן (~ אלפית שניה לכל מסגרת) על הדור השלישי רנטגן beamlines.

דפוסי עקיפה של רנטגן שרירים מורכבים של הרהורים המשוונית, השתקפויות meridional, כמו גם את השתקפות קו השכבה. יחס האינטנסיביות המשוונית (יחס של האינטנסיביות של 1, 1 ו-1, 0 הרהורים המשוונית, אני11/i10), הוא מתואם באופן צמוד למספר הגשרים המצורפים, אשר פרופורציונאלית לכוח שנוצר בשריר השלד העכבר 2. הרהורים meridional המדווחים על פרידיערים בתוך חוטים עבים ודקים יכולים לשמש להערכת הרחבה פילמנט1,3,6,7. תכונות עקיפה לא על המרידיאן ואת קו המשווה נקראים קווי שכבה, אשר נובעים רירן ראשים המסודרת בקירוב על פני השטח של חוט השדרה עבה, כמו גם חוטים דקים בקירוב המסודרת. העוצמה של קווי רירן שכבה קשורה קשר הדוק לדרגת ההזמנה של ראשי רירן בתנאים שונים2,8. כל מידע זה ניתן להשתמש במחקר התנהגויות של חלבונים sarcomeric באתרו בריאות ומחלות.

סינכרוטרון X-ray עקיפה של השריר כבר נעשה היסטורית על ידי צוותי מומחים מאוד מיוחדים אך התקדמות בטכנולוגיה וזמינות של כלי הפחתת נתונים חדשים מצביעים על כך לא צריך תמיד להיות במקרה. BioCAT Beamline 18 ID במקור פוטון מתקדם, המעבדה הלאומית ארגוננה הקדיש צוות ותמיכה מתקנים לביצוע ניסויים שרירים לעקיפה רנטגן שיכולים לעזור למצטרפים חדשים לשדה להתחיל באמצעות טכניקות אלה. משתמשים רבים בוחרים לשתף פעולה באופן רשמי עם צוות BioCAT, אבל מספר גדל והולך של משתמשים למצוא שהם יכולים לעשות את הניסויים וניתוח עצמם להפחית את הנטל על צוות beamline. המטרה העיקרית של הנייר הזה היא לספק הכשרה המספקת ניסויים פוטנציאליים עם המידע שהם צריכים לתכנן ולבצע ניסיונות על מערכת שריר השלד של העכבר או ב biocat beamline או ב השטף הגבוה אחרים beamline ברחבי ה עולם שבו. הניסויים האלה יהיו אפשריים

Protocol

כל הפרוטוקולים ניסויים בעלי חיים אושרו על ידי מכון אילינוי לטיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש (פרוטוקול 2015-001, תאריך אישור: 3 נובמבר 2015) ואחריו NIH "מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה"9 .

1. הכנה לפני ניסויים

  1. הכינו 500 mL של הפתרון של המצלצל (מכיל: 145 מ"מ הנאל, 2.5 מ"מ KCl, 1.0 mM MgSO4, 1.0 Mm cacl2, 10.0 mm hepes, 11 מ"מ גלוקוז, pH 7.4) טרי עבור כל יום של הניסוי.
  2. מילוי 200 mL של התמיסה של המצלצל בבקבוק ספריי וחנות במקרר 4 ° c. ממלאים צלחת פטרי (בקוטר 10 ס מ) עם התמיסה של הצלצול ומבשם עם 100% חמצן על ידי חיבור הצינור מצילינדר חמצן לאבן האוויר באקווריום. מנות פטרי ("לבתר צלחות") היו מצופות בעבר במתחם אלסטומר כדי לאפשר החדרת פינים במהלך הניתוח.
  3. הכינו ווים הרכבה מתכת. חותכים שתי חתיכות של חוט נירוסטה, 0.5 מ"מ קוטר, לאורך המתאים ולכופף את החוט בשני הקצוות לטופס קרסים. לסדר את כל הכלים הבתר, מספריים, תפרים קשירת מלקחיים, מיקרו מספריים שימושי לשימוש.
    הערה: חלק הקרס אמור להיות. בערך 3 מ"מ החוט הארוך (המסתיים בקרס) צריך להיות כ -5 ס מ, והחוט הקצר יותר (המסתיים גם בקרס) צריך להיות בערך 1 ס מ בכדי להתאים את התאים המותאמים אישית המשמשים ב BioCAT ולאפשר מגוון מספיק של תנועה לזרוע מתמר.
  4. התחבר והפעל את כל הציוד. זה כולל מנוע משולב/כוח מתמר, מנוע/כוח מתמר בקר הכוח גבוהה bi-phasic מגירוי הנוכחי, ואת מערכת מבוקרת נתונים לרכישה/בקרה של המחשב.
    1. הפעל את מערכת רכישת הנתונים וכיול אותה לפני תחילת הניסוי10. בקצרה, כיול הכוח על ידי הוספת קבוצה של משקולות ידועות, כיסוי עד 50% מהכוח המקסימלי הנמדד על ידי מתמר הכוח בהתקדמות ליניארית, על מתמר הכוח להקליט את שינויי מתח הפלט. כיול את האורך על-ידי החלת מערכת של מתח פלט ידוע על זרוע המנוף ולמדוד את שינוי האורך של הזרוע.
    2. חבר את הזרנוקים מהבלוק התרמי על מחזיק הדגימה לאמבט מחזורי בקירור והגדר את הטמפרטורה כדי לשמור על הטמפרטורה הרצויה בחדר בין 10 ° c ו-40 ° c. לקבוע את התקופה הזאת לפני הזמן על ידי הגדרת אמבט המחזור למגוון טמפרטורות ומדידת הטמפרטורה בחדר עם זוג תרמותרמי.

2. הכנה לשריר

  1. המתת חסד של העכבר
    1. המתת החסד של העכבר על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ואחריו פריקה צוואר הרחם.
    2. רסס את העור על הגפיים האחוריות עם הפתרון של הצלצול הקרה כדי למנוע מהשיער לנשוף לתוך התכשיר. להסיר את העור על ידי חיתוך אותו סביב הירך באמצעות מספריים חיתוך משובח במהירות למשוך את העור למטה באמצעות מלקחיים5 כדי לחשוף את השרירים.
    3. לקטוע את הגפיים האחוריות ולהעביר אותו למנה מחולקת שהיתה מלאה בתמיסה של מתחזה, ולאחר מכן מניחים מתחת למיקרוסקופ מבתר.
  2. הכנת שריר הסוליה
    1. הצמד את הגפיים האחוריות למטה בצלוחית הבתר כאשר השריר הגקצ'מיוס פונה כלפי מעלה. חותכים את הגיד המרוחק של קבוצת השריר הגסולמיאוס/סוליה ומרימים את השרירים בעדינות ובאיטיות על ידי חיתוך הfascia משני צדי השריר הגקטמיאוס באמצעות מספריים עדינים. בודד את קבוצת השריר הגקטמיוס/סוליה מהגפיים לאחר שחרור הגיד האבובי של שריר הסוליה.
    2. הצמד את קבוצת השרירים המכילה את השריר הגקטנמיוס ואת הגיד המרוחק למטה בצלחת הבתר. הרימו את שריר הסוליה בעדינות דרך הגיד האבובי והפרידו אותו מן השריר הגקטמיאוס, והשאירו כמה שיותר מגיד הסוליה המרוחק.
  3. הכנת שריר פושט השריר (אדי)
    1. הצמד את הגפיים האחוריות למטה בתוך הצלחת הבתר עם השריר הקדמי החישורי הפונה כלפי מעלה. חותכים את הfascia לאורך השריר הקדמי הפיזי (TA) ולמשוך אותו ברור באמצעות מלקחיים. לזהות ולחתוך את הגיד המרוחק של שריר ת א. הרם את שריר ה-TA וחתוך אותו בזהירות מבלי למשוך בשריר אדי.
    2. חותכים את הצד הצדדי של הברך וחושפים את שתי הגידים. חותכים את הגיד הגדול ביותר, לעזוב את הגיד ככל האפשר עדיין מחובר שריר, ולהרים את השריר אדי (שריר המדיאלי) על ידי משיכת בעדינות את הגיד. תחתוך את הגיד המרוחק. ברגע שהוא ייחשף
  4. הרכבת השריר
    1. הצמד את השריר דרך הגידים, וקצץ את כל השומן, הfascia והגיד הנוספים במרחק רב ככל האפשר. הכנס גיד אחד לקשר מראש קשור ולקשור תפר הדוק עם מלקחיים קשירת תפרים. תקשור את הקשר השני. סביב קרס המתכת
    2. חזור על אותו ההליך עם קרס ארוך בקצה השני של הגיד. ודא שאין קשר בין גוף השריר לבין התפרים. . זה יפגע בהכנה
    3. חברו את הקרס הקצר לחלק התחתון של החדר הנסיוני ואת הקרס הארוך למצב כפול כוח מתמר/מנוע. בועת הפתרון בחדר ניסיוני עם 100% חמצן.
  5. אופטימיזציה של פרוטוקולי גירוי ואורך שרירים
    1. למתוח את השריר על ידי התאמת המיקרומניפולציה המצורפת מתמר/מנוע כדי ליצור מתח בסיסי בין 15 עד 20 mN לפני מציאת הפרמטרים הגירוי הטוב ביותר. הגדר את מתח הגירוי ל-40 V. זרם הגירוי מוגבר באופן שיטתי עד שאין עלייה נוספת בכוח העווית. הזרם הגבוה ביותר שנמצא הוא גדל על ידי כ 50% כדי להבטיח הפעלה מקסימלית.
    2. מצא את האורך האופטימלי, L0, מוגדר כאורך השריר הנותן כוח עווית מקסימלית, על ידי הגדלת אורך השריר והפעלת השריר עם עווית אחת עד הכוח הפעיל (כוח שיא פחות כוח בסיסית) מפסיק להגדיל.
    3. בצע התכווצות הטטאית קצרה (1 s הפעלה) כדי לבדוק את ההרכבה ולמתוח את השריר חזרה כוח בסיסי אופטימלי במידת הצורך. הקלט את אורך השריר ב-mm עם caliper דיגיטלי.

3. עקיפה של קרני רנטגן

הערה: התיאור הבא הוא עבור ניסויים עקיפה רנטגן שנעשו באמצעות המכשיר הקטן לעקיפה רנטגן על BioCAT בבית ב-18 ID במקור פוטון מתקדם, ארגוננה המעבדה הלאומית אבל שיטות דומות יכול להיות מועסק על beamline אחרים כגון ID 02 ב-ESRF (צרפת) ו-BL40XU at SPring8 (יפן). Beamline 18 ID מופעל באנרגיה של קרן רנטגן קבועה של 12 קוו (0.1033 ננומטר גל) עם שטף האירוע של ~ 1013 פוטונים לשנייה בקרן מלא.

  1. לבחור דגימה למרחק גלאי (אורך המצלמה). השתמש אורך מצלמה 1.8 m עבור ניסויים בוחן את 2.7 ננומטר אקטין וסדר גבוה רירן השתקפויות כגון 2.8 ננומטר meridional השתקפויות. השתמש 4-6 m מצלמה עבור ניסויים אחרים, שם אחד מתעניין בעיקר פרטים עדינים על מרידיאן ושכבות שורות
  2. אופטימיזציה של מיקום המדגם בקורה
    1. קבעו את תנוחת הקרן בעזרת פיסת נייר רגישה לצילום רנטגן המפיקה נקודה אפלה בתגובה לצילומי רנטגן ("צריבה"). לאחר מכן השתמש במחולל וידאו צלב שיער כדי ליצור צלב שיער מיושר עם סימן הכוויה על הנייר או פשוט לסמן על מסך הווידאו עם עט סמן.
    2. השתמש BioCAT סיפק ממשק משתמש גרפי לעמדת המדגם כדי להזיז את השריר כדי להיות ממורכז על מיקום הקרן. נדנוד בחדר המדגם ב ~ 10-20 מ"מ/s על ידי הזזת שלב המדגם כדי להפיץ את המינון רנטגן על השריר במהלך החשיפה. צפו במדגם כפי שהוא נע כדי להימנע אזורים גדולים של fascia (מכיל קולגן אשר לזהם את דפוסי עקיפה) ולוודא שהוא נשאר מואר במהלך כל הדרך של הנסיעה שלה.
      הערה: הצעדים המדויקים הדרושים בסעיפים 3.3 ו 3.4 כדי להפוך את ההגדרות והפעולות הנדרשות באמצעות ממשק המשתמש הגרפי שסופקו על-ידי הממשק יהיה מוגדר בתור וגלאי. בקשו מאנשי הצוות לבצע פעולות אלה.
  3. הגדרת CCD (החיוב מצמידים המכשיר) גלאי עבור דפוסים ברזולוציה גבוהה מן השריר במצבים סטטיים מוגדרים (נח, או במהלך התכווצות איזומטרי)
    1. הגדר את זמן החשיפה ואת תקופת החשיפה בממשק המשתמש הגרפי לתוכנת הבקרה. קח תמונת רקע כהה לפני נטילת החשיפה ולחזור על הליך זה כל 2 שעות או לאחר שינוי של זמן חשיפה כדי לתקן את כל הסחף בתוך גלאי האלקטרוניקה הבדיקה.
    2. מחליש את קרן הרנטגן לערך הרצוי לחשיפה. . אז צלם תמונה לא ניתן לקחת רצפים של תמונות עם גלאי זה. גלאי CCD צריך גם כמה שניות כדי לקרוא תמונה בודדת.
  4. הגדרת גלאי מערך הפיקסלים עבור ניסוי שנפתר בזמן
    1. הגדר את מספר התמונות, זמן החשיפה, תקופת החשיפה בממשק המשתמש הגרפי. גלאי מערך הפיקסל המשמש כאן צריך לפחות 1 ms כדי הבדיקה. תדר המסגרת המרבי לגלאי הפוטון הוא 500 Hz. השתמש באות הפוטון של מכונת ספירת הפוטונים כדי לשלוט בתריס X-ray.
    2. מחליש את הקורה לעוצמה הרצויה. חמש את הגלאי והמתן להדק. ממערכת רכישת הנתונים סנכרן את נתוני הרנטגן המכני על-ידי הפעלה בו. דפוסי רנטגן נאספים ברציפות ברחבי הפרוטוקול a עם 1 ms זמן חשיפה 2 ms תקופת חשיפה.
      הערה: את זמן החשיפה המדויק ואת תקופת החשיפה יש לקבוע על מקרה על ידי בסיס מקרה של המידע הרצוי ואת החיים הנצפים של המדגם בקרן. מחליש את הקרן כדי לא להשתמש יותר קרן רנטגן מאשר נדרש כדי לספק נתונים analyzable בתקופת החשיפה שנבחרה.

4. לאחר הניסוי טיפול שרירים

  1. להתאושש ולשקול את השריר אחרי כל ניסוי רנטגן מכני. לחשב את האזור חתך החתך של השריר באמצעות אורך השריר נמדד ואת מסת השריר11 בהנחה צפיפות שריר של 1.06 g/mL12.
  2. למתוח את השריר לאורך ניסיוני ולתקן את השריר ב 10% פורמלין עבור 10 דקות. הפרד את השריר קבוע לסדרה של צרורות סיבים שנבחרו ממיקומים ברחבי כל חתך השריר כולו3.
  3. למדוד את אורך סרקומר באמצעות וידאו סרקומר אורך מערכת מדידה.

Representative Results

. התכווצות טטמית איזומטרי כל סוג של ניסוי מכני קלאסי השריר, כגון התכווצויות איזומטרי או איזוטוניקה, ניתן לבצע עם רכישת סימולטני של דפוסי רנטגן. איור 1 מראה את הכיוונון הניסיוני לניסויים מכניים ורנטגן. לדוגמה, מעקב אחר כוח להתכווצות הטטמית האיזומטרית מוצג באיור 1B. השריר הוחזק במנוחה עבור 0.5 s לפני הפעלת עבור 1 s. ההקלטה המכנית עוצרת 1 לאחר הגירוי. דפוסי רנטגן נאספו ברציפות במהלך הפרוטוקול 1 ms זמן חשיפה ב 500 Hz.

דפוסי עקיפה של קרני רנטגן. תבנית עקיפה של קרני רנטגן שרירים יכול לתת מידע מבנה הרזולוציה ננומטר ממבנים בתוך sarcomere. דפוסי עקיפה רנטגן של שרירים מורכבים ארבעה רביעים שווי מחולק על ידי קו המשווה ואת המרידיאן. התבנית המשוונית מתעוררת מהקומופינט אריזה בתוך סרקומר בניצב לציר סיבים, בעוד דפוסי meridional לדווח על מידע מבני מהמיופינט לאורך ציר השריר. ההשתקפויות שנותרו לא על קו המשווה או המרידיאן נקראות קווי שכבה. שורות שכבה (לדוגמה, תכונות המסומנות ב-MLL4 ו-ALL6 באיור 2א) נובעים מהסדר ההאלאני של תת-היחידות המולקולריות בתוך הרירן המכילים חוטים עבים והוא מכיל חוטים דקים. קווי השכבה המבוססת על רירן חזקים וחדים בדפוסים של שריר מנוחה (איור 2א), ואילו קווי שכבה מבוססי actin בולטים יותר בתבניות משריר מכווץ (איור 2ב). דפוסי ההפרש המתקבלים על ידי הפחתת תבנית המנוחה מהתבנית הקבלנית (איור 2ג) ניתן לשפוך אור על שינויים מבניים במהלך פיתוח כוח בשריר בריא וחולה. על-ידי ביצוע שינויים מבניים אלה בסרגל הזמן האלפית של האירועים המולקולריים במהלך התכווצות שרירים, דפוסי עקיפה של קרני רנטגן יכולים לחשוף מידע מבני משמעותי (איור 2ד).

ניתוח נתונים באמצעות מוסקס. הנה דוגמה של ניתוח הרהורים המשוונית באמצעות "המשווה" שגרת החבילה מוסלקס (איור 3). מוסקקס היא חבילת תוכנות לניתוח קוד פתוח שפותחה ב-BioCAT13. יחס האינטנסיביות המשוונית (אני1, 1/1, 0) הוא מחוון של הקרבה של רירן כדי אקטין בשריר מנוחה (איור 3א), בעוד הוא מתואם היטב את מספר הגשרים המצורפים בקבלנות ( איור 3ב) שריר השלד מוריין2. יחס האינטנסיביות, אני1, 1/1, 0, הוא על 0.47 השריר במנוחה ועל 1.2 בשריר מכווץ. המרחק בין השיקוף של 2 1, 0 (2 * S1, 0) הופך להיות קשור בהיפוך לריווח הבין-פילמנט. מתיעוד מפורטים ומדריכים עבור מוסלקס זמינים באינטרנט13.

Figure 1
איור 1 : ניסוי מכני ורנטגן התקנה ופרוטוקול. (א) השריר מותקן על קצה אחד לקרס בתוך החדר הנסיוני ואת הקצה השני מנוע במצב כפול/מתמר כוח. הוא מוחזק בין שני חלונות הסרט Kapton כדי לאפשר את צילומי רנטגן כדי לעבור. החדר מלא בתמיסה של המצלצל עם 100% חמצן במהלך הניסוי. (ב) הפרוטוקול המכני לניסויים בקרני רנטגן על שריר במהלך התכווצות הטטמית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : דפוסי עקיפה של אדי-רנטגן. דפוס השרירים של אדי שריר רנטגן ממנוחה (A) וקבלנות (ב) שריר. (ג) דפוס ההפרש בין תבנית המנוחה לבין הקבלנות. האזור הכחול מעיד על עוצמה גבוהה בתבנית מנוחה, בעוד שהאזור הצהוב מייצג עוצמה גבוהה בתבנית מתקשרת. (ד) דיפרקציה של קרני רנטגן מחשיפה של 1 אלפיות באמצעות שריר אדי. MLL1 = הסדר הראשון רירן קו השכבה; MLL4 = הסדר הרביעי רירן קו שכבה; ALL1 = הסדר הראשון קו שכבה אקטין ALL6 = קו שכבת אקטין השישי; ALL7 = קו שכבת הסדר השביעי של אקטין; Tm = משתקף השתקפות (מסומן על ידי קופסה לבנה); M3 = meridional הסדר השלישי השתקפות; M6 = הסדר השישי meridional השתקפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : ניתוח נתונים של דפוסי המשוונית באמצעות מוסקקס. הרקע מופחתים על יחס עוצמה המשוונית פרופיל (בעוד שטח) וחמש הזמנות הראשון (קווים ירוקים) היו מתאימים לחשב את העוצמה של כל שיא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרסומים אחרונים מהקבוצה שלנו הראו כי X-ray דפוסי משריר השלד העכבר ניתן להשתמש כדי לשפוך אור על מידע מבניים sarcomeric משריר בריאות ומחלה1,2,3 במיוחד עם הזמינות מוגברת של מודלים העכבר גנטית שונה עבור myopathies שונים. מחקרים מכניים ברזולוציה גבוהה על סיבים בודדים או צרורות קטנים בשילוב עם עקיפה רנטגן הטוב ביותר נעשה על ידי מומחים. אם, עם זאת, מידע מכני צנוע יותר יספיק למטרותיך, הכנת השריר כולו מאפשר אוסף של דפוסי רנטגן מפורטים מתוך הכנה פשוטה.

ניתוח נקי הוא המפתח לניסוי. מכני ורנטגן מוצלח חשוב מאוד לא למשוך את השריר היעד, כמו גם שרירים אחרים הקשורים שרירי הסוליה או אדי במהלך הניתוח מאז זה יכול לקרוע חלקים של השריר ולהוביל כוח מופחת. זה יכול גם להוביל מבנה פנימי פגום כי לבזות את דפוסי רנטגן. מאז הכל יהיה לפזר את קרן רנטגן, חשוב לנקות כל שומן נוסף, את הקולגן ב fascia, כמו גם שערות או פיסות רופף של רקמות תוך כדי לעשות את הפרוטוקול הבא. כדי להקטין את התאימות הנוספת בהכנת השריר, חשוב גם לקשור את הגידים בצורה מאובטחת ווים, קרוב ככל האפשר לגוף השריר מבלי להזיק לו.

זמני חשיפה שונים של קרני רנטגן יכולים לספק סוגים שונים של מידע מאותו שריר. באמצעות קרן מלא על 18 ID, דפוס המשוונית analyzable ניתן לקבל בחשיפה 1 ms (ראה איור 2ד). עבור analyzable first רירן שכבת השתקפות קו, 10 ms זמן חשיפה כוללת נדרש בדרך כלל. כדי לאסוף הרהורים meridional הסדר גבוה כגון M15 (2.8 nm רירן meridional השתקפות) ו 2.7 ננומטר אקטין meridional השתקפות, בדרך כלל לפחות 1 s החשיפה הכוללת נדרשת אבל יותר 2 החשיפה הכוללת מומלצת לדיוק גבוה דידות.

הבחירה של גלאי הרנטגן האופטימלי לניסוי היא חשובה. עבור תבניות רנטגן המפורט ביותר מזהה CCD מותאם אישית, כגון אחד ב biocat עם ca. 40 יקרומטר פיקסלים ו ~ 65 יקרומטר נקודת התפשטות הפונקציות זרחן, יכול לספק דפוסים עם טווח דינמי גבוה ורזולוציה מרחבית טובה אבל יכול לקחת רק מסגרת אחת בכל פעם. עבור ניסויים בזמן שנפתרו, הפוטון סופר מערך פיקסל גלאי ב BioCAT יכול לאסוף תבניות רנטגן ב 500 Hz. הגודל 172 יקרומטר פיקסל עם גלאי זה, עם זאת, אינו מספק רזולוציה מרחבית מספיק עבור מחקרים מפורטים של החלק הפנימי של מרידיאן אבל הוא הולם למטרות אחרות ביותר. Biocat רכשה גלאי הפוטון ברזולוציה גבוהה המספקת 75 יקרומטר ברזולוציה אמיתית בקצב הפריימים המקסימלי של 9,000 Hz. גלאים דומים מסוג זה צפויים לעבור הגלאים הנוכחי עבור לימודי שרירים במהלך השנים הקרובות.

עם פלקסים גבוהים מאוד של קרני רנטגן בsynchrotrons דור שלישי, נזק הקרינה היא דאגה רצינית. זו תמיד בחירה טובה כדי להחליש את הקרן כדי לספק לא יותר קרן מאשר צריך להתבונן בתכונות עקיפה הרצוי. החשיפה הכוללת של קרני רנטגן יכולה להיות מושגת על ידי הארכת זמן החשיפה מקורה מחליש. יתרון של פוטון ספירת מערך פיקסל גלאי הוא כי מסגרות בודדות ניתן לסכם יחד עם עונש לא רעש. גם אז, נזק לקרינה אפשרי. סימנים של נזק הקרינה כולל ירידה של כוח מירבי של התכווצות, מריחת שכבה קו השתקפויות, אפילו שינוי של צבע שריר.

אחת המגבלות של הכנה שריר השלד שרירי העכבר הוא הקושי בהשגת אורך סרקומר מן השריר שלמים במהלך הניסויים. השרירים עבים מדי עבור מיקרוסקופ וידאו ועקיפה לייזר. בעוד עם התפתחויות עתידיות זה יכול להיות אפשרי להעריך את אורך סרקומר ישירות מדפוסי עקיפה14, בטווח הקרוב האפשרות היחידה היא למדוד את זה אחרי הניסוי כפי שמתואר כאן.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה משמש משאבים של מקור פוטון מתקדם, ארה ב. משרד האנרגיה (DOE) המשרד של מתקן משתמש המדע מופעל עבור המשרד DOE של המדע על ידי המעבדה הלאומית של ארגוננה תחת חוזה לא. דה-AC02-06CH11357. פרויקט זה היה נתמך על ידי גרנט P41 GM103622 מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות. השימוש של מכונת הפילאטוס 3 1M גלאי סופק על ידי הענקת 1S10OD018090-01 מתוך כמיאמים. התוכן הוא רק באחריות המחברים ואינו משקף בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית או המוסדות הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 forceps WPI 500342
4/0 surgical suture Braintree Sci SUT-S 108
Aquarium air stone uxcell a regular air stone from a pet store would be fine
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
CCD detector Rayonix Inc MAR 165 CCD
Data acquisition system Aurora Scientific Inc 610A
Elastomer compound Dow Corning Sylgard 184
Glucose Sigma-Aldrich G8270
HEPES Sigma-Aldrich H3375
High resolution photon counting detector Dectris Inc EIGER X 500K
High-power bi-phasic current stimulator Aurora Scientific Inc 701
Iris Scissors WPI 501263-G
KCl Sigma-Aldrich P9541
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Micro scissor WPI 503365
Motor/force transducer Aurora Scientific Inc 300C-LR
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Petri dish Sigma-Aldrich CLS430167
Photon counting detector Dectris Inc Pilatus 3 1M
Stainless Steel wire McMaster-carr 8908K21
Suture Tying Forceps WPI 504498
Video sarcomere length measuring system Aurora Scientific Inc 900B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, W., et al. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
  2. Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  3. Kiss, B., et al. Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).
  4. Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).
  5. Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q). Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).
  6. Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle. Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).
  7. Wakabayashi, K., et al. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction. Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).
  8. Anderson, R., et al. Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
  9. National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). , National Academies Press. (2011).
  10. Rand, C. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC. , Available from: https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/ (2017).
  11. Alexander, R. M. V. A. The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert. Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).
  12. Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb. Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).
  13. Jiratrakanvong, J., et al. MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).
  14. Reconditi, M., et al. Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 149 שריר השלד עקיפה לרנטגן acto-רירן אינטראקציה מבנה סרקומר שריר השלד מיפתיה השלד שריר הפיזיולוגיה
צילום רנטגן של שריר השלד Murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, W., Irving, T. C. X-ray… More

Ma, W., Irving, T. C. X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease. J. Vis. Exp. (149), e59559, doi:10.3791/59559 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter