Vi presenterer detaljerte protokoller for å utføre små-vinkel X-ray Diffraksjon eksperimenter med intakt mus skjelettmuskulatur. Med den brede tilgjengeligheten av transgene Mouse-modeller for menneskelige sykdommer, kan denne eksperimentelle plattformen danne en nyttig test seng for å Elucidating det strukturelle grunnlaget for genetiske muskel sykdommer
Transgene Mouse-modeller har vært viktige verktøy for å studere forholdet mellom genotype og fenotype for menneskelige sykdommer, inkludert de av skjelettmuskulatur. Mus skjelettmuskulatur har vist å produsere høy kvalitet X-ray Diffraksjon mønstre på tredje generasjons Synchrotron beamlines gir en mulighet til å knytte endringer på nivået av genotype til funksjonell fenotyper i helse og sykdom ved å bestemme strukturelle konsekvenser av genetiske forandringer. Vi presenterer detaljerte protokoller for utarbeidelse av eksemplarer, samle X-ray mønstre og utvinne relevante strukturelle parametre fra røntgen mønstre som kan hjelpe guide forskere som ønsker å utføre slike eksperimenter for seg selv.
Synchrotron liten vinkel X-ray Diffraksjon er metoden for valg for å studere NM-skala struktur av aktivt kontraktørselskaper muskel preparater under fysiologiske forhold. Viktigere, strukturelle informasjon fra levende eller flådd muskel preparater kan fås i Synchrony med fysiologiske data, for eksempel muskelkraft og lengde endringer. Det har vært økende interesse for å anvende denne teknikken til å studere den strukturelle grunnlaget for arvet muskel sykdommer som har sitt grunnlag i punkt mutasjoner i sarcomeric proteiner. Den muskel biofysikk samfunnet har vært veldig aktiv i å generere transgene Mouse modeller for disse menneskelige sykdommer som kan gi ideelle test senger for strukturelle studier. Nyere publikasjoner fra vår gruppe1,2,3 og andre4,5 har indikert at X-ray mønstre fra musen extensor senen Longus (EDL) og soleus musklene kan gi alle Diffraksjon informasjon tilgjengelig fra mer tradisjonell modell organismer som frosk og kanin psoas skjelettmuskulatur. En fordel med musen skjelettlidelser muskel forberedelser er den enkle disseksjon og utføre grunnleggende membran-intakt, hele muskel fysiologiske eksperimenter. Dimensjonene av dissekert muskelen har tilstrekkelig masse til å gi svært detaljerte muskel mønstre i svært korte X-ray eksponeringstider (~ millisekunder per ramme) på tredje generasjons røntgen beamlines.
Muscle X-ray Diffraksjon mønstre består av ekvator refleksjoner, den Meridional refleksjoner samt laget linje refleksjoner. Den ekvator intensitet ratio (forholdet mellom intensiteten av 1, 1 og 1, 0 ekvator refleksjoner, jeg11/i10), er nært korrelert til antall festet Cross-broer, som er proporsjonal med kraften som genereres i musen skjelettlidelser muskel 2. Meridional refleksjoner som rapporterer periodicities innenfor de tykke og tynne filamenter kan brukes til å anslå filament utvidbarhet1,3,6,7. Diffraksjon funksjoner ikke på Meridian og ekvator kalles lag linjer, som oppstår fra de ca skruelinjeformet bestilte myosin hoder på overflaten av tykt filament ryggrad samt ca skruelinjeformet bestilte tynne filamenter. Intensiteten av myosin lag linjer er nært beslektet med graden av bestilling av myosin hoder under ulike forhold2,8. All denne informasjonen kan brukes studere oppførselen til sarcomeric proteiner in situ i helse og sykdom.
Synchrotron X-ray Diffraksjon av muskelen har vært historisk gjort av team av høyt spesialiserte eksperter, men fremskritt innen teknologi og tilgjengeligheten av nye data reduksjon verktøy tyder på at dette ikke alltid er tilfelle. Det BioCAT Beamline 18ID for det avansert Foton kilde, Argonne nasjonal laboratorium har plikttro stab og oppbacking fasiliteter for utføre muskelen X-rokke Diffraksjon eksperimenter det kanne hjelpe nykommere å feltet komme i gang inne benytter disse teknikker. Mange brukere velger å formelt samarbeide med BioCAT stab, men et økende antall brukere finner de kan gjøre eksperimenter og analyse selv redusere byrden på beamline staff. Hovedmålet med denne utredningen er å gi opplæring som gir potensielle forskere med den informasjonen de trenger for å planlegge og utføre eksperimenter på musen skjelettlidelser muskel system enten på BioCAT beamline eller ved andre høy Flux beamlines rundt verden hvor disse eksperimentene ville være mulig.
Nyere publikasjoner fra vår gruppe viste at røntgen mønstre fra musen skjelettmuskelen kan brukes til å belyse sarcomeric strukturelle informasjon fra muskel i helse og sykdom1,2,3 spesielt med den økte tilgjengeligheten av genetiske modifiserte musemodeller for ulike myopatier. Høyoppløselig mekaniske studier på enkelt fibre eller små bunter kombinert med røntgen Diffraksjon gjøres best av eksperter. Hvis imidlertid mer beskjeden mekanisk informasjon vil være tilstrekkelig for dine formål, gjør hele muskel forberedelser samling av detaljerte røntgen mønstre fra en enkel forberedelse.
En ren disseksjon er nøkkelen til en vellykket kombinert mekanisk og X-ray eksperiment. Det er svært viktig å ikke dra på målet muskelen samt andre muskler knyttet til soleus eller EDL musklene under disseksjon siden dette kan rive deler av muskelen og føre til redusert kraft. Det kan også føre til skadet indre struktur som vil forringe X-ray mønstre. Siden alt vil spre seg i X-ray strålen, er det viktig å rense bort noe ekstra fett, kollagen i konseptet, samt eventuelle hår eller løse biter av vev mens du gjør følgende protokoll. For å redusere ytterligere samsvar i muskel forberedelser, det er også viktig å sikkert knytte sener til krokene, så nær som mulig til muskel kroppen uten å skade den.
Ulike X-ray eksponeringstider kan gi ulike typer informasjon fra samme muskelen. Ved hjelp av full stråle på 18ID kan en analyzable ekvator fås i en 1 MS eksponering (se figur 2D). For en analyzable første myosin lag linje refleksjon, er en 10 MS totale eksponeringstid vanligvis nødvendig. For å samle høyere orden Meridional refleksjoner som M15 (2,8 NM myosin Meridional refleksjon) og 2,7 NM utgangen Meridional refleksjon, vanligvis minst 1 s total eksponering er nødvendig, men mer enn 2 s total eksponering anbefales for høy nøyaktighet Målinger.
Valget av den optimale røntgen detektoren for eksperimentet er viktig. For de mest detaljerte røntgen mønstre en tilpasset CCD-detektor, slik som den på BioCAT med ca. 40 μm piksler og ~ 65 μm punkt spredt funksjoner i fosfor, kan gi mønstre med høy dynamisk rekkevidde og god romlig oppløsning, men kan bare ta ett bilde av gangen. For tid løst eksperimenter, det Foton telling pixel array detektor på BioCAT kan samle røntgen mønstre på 500 Hz. The 172 μm pixel størrelse med denne detektoren, men gir ikke tilstrekkelig romlig oppløsning for detaljerte studier av indre del av Meridian, men er tilstrekkelig for de fleste andre formål. BioCAT ervervet en høy-resolution Foton opptellingen merker skaffer 75 μm virkelig resolution for maksimum rammen rate av 9 000 Hz. lignende detektorer av denne typen ventes å erstatte aktuelle detektorer for muskel studier i løpet av de neste årene.
Med den svært høye flukser av røntgenstråler på tredje generasjons synchrotrons, er strålings skade en alvorlig bekymring. Det er alltid et godt valg å dempe strålen til å levere noe mer stråle enn det som er nødvendig for å observere de ønskede Diffraksjon funksjoner. Den samme totale røntgen eksponeringen kan oppnås ved å forlenge eksponeringstiden fra en svekket stråle. En fordel av Foton telling pixel array detektorer er at enkelte rammer kan oppsummeres sammen med ingen støy straff. Selv da er strålings skade mulig. Tegn på stråling skader inkluderer dråpe maksimal kraft av sammentrekning, smøre av lag linje refleksjoner, selv endring av muskel farge.
En av begrensningene i intakt mus Skjelettmuskel forberedelser er vanskeligheten med å skaffe sarkomerlengde lengde fra intakt muskelen under eksperimentene. Musklene er for tykke for video mikroskopi og laser Diffraksjon. Mens med fremtidig utvikling kan det være mulig å anslå sarkomerlengde lengde direkte fra Diffraksjon mønstre14, i nær sikt det eneste alternativet er å måle den etter eksperimentet som beskrevet her.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen anvendt ressursene av det avansert Foton kilde, en U.S. avdeling av energi (DOE) kontor av vitenskap bruker Letter operert for DOE kontor av vitenskap av Argonne nasjonal laboratorium under kontrakt nei. DE-AC02-06CH11357. Dette prosjektet ble støttet av stipend P41 GM103622 fra National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health. Bruk av Pilatus 3 1M detektor ble levert av Grant 1S10OD018090-01 fra NIGMS. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og reflekterer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health.
#5 forceps | WPI | 500342 | |
4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
data accquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
high-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
micro scissor | WPI | 503365 | |
motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |