Summary

Bepaling van de Galkanaal dichtheid in de lever van de muis

Published: April 30, 2019
doi:

Summary

We presenteren een vrij eenvoudige en gevoelige methode voor nauwkeurige kwantificering van de dichtheid van de gal duct in de lever van de muis. Deze methode kan helpen bij het bepalen van de effecten van genetische en omgevings modificatoren en de effectiviteit van mogelijke therapieën in muizen modellen van galziekten.

Abstract

Muis wordt in grote lijnen gebruikt als modelorganisme om biliaire ziekten te bestuderen. Om de ontwikkeling en functie van het biliaire systeem te evalueren, worden verschillende technieken gebruikt, waaronder serum chemie, histologische analyse en immunokleuring voor specifieke markers. Hoewel deze technieken belangrijke informatie over de galwegen kunnen bieden, presenteren ze vaak geen volledig beeld van de ontwikkelings defecten van galwegen (BD) over de hele lever. Dit is deels te wijten aan het robuuste vermogen van de muis lever om de gal af te voeren, zelfs bij dieren met een significante beperking in de biliaire ontwikkeling. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het berekenen van het gemiddelde aantal BDs dat is gekoppeld aan elke portaal ader (PV) in secties die alle lobben van Mutante/transgene muizen beslaan. Bij deze methode worden levers op type wijze gemonteerd en gesectioneerd om de vergelijking tussen verschillende genotypen en experimentele omstandigheden te vergemakkelijken. BDs worden geïdentificeerd door middel van lichte microscopie van cytokeratine-gekleurd cholangiocyten, en vervolgens geteld en gedeeld door het totale aantal Pv’s aanwezig in de lever sectie. Als voorbeeld laten we zien hoe deze methode duidelijk onderscheid kan maken tussen wild-type muizen en een muismodel van Alagille syndroom. De hier gepresenteerde methode kan geen vervanging zijn voor technieken die de driedimensionale structuur van de biliaire boom visualiseren. Het biedt echter een eenvoudige en directe manier om de ontwikkeling van BD en de mate van ductulaire reactie vorming bij muizen kwantitatief te beoordelen.

Introduction

De biliaire boom is een cruciaal onderdeel van de lever van zoogdieren, waardoor de passage van gal van hepatocyten in de darm. Intrahepatische galwegen (BDs) worden gevormd door cholangiocyten, die differentiëren van bipotentiaal hepatoblasten door Inkeping en tgfβ signalering1,2. De juiste specificatie en toewijding van cholangiocyten en hun assemblage in volwassen BDs zijn van cruciaal belang voor de ontwikkeling van de Intrahepatische biliaire boom. Naarmate de lever groeit tijdens de ontwikkeling of bij orgaan regeneratie, moet het biliaire systeem langs de lever worden ontwikkeld om een goede galdrainage te garanderen. Bovendien resulteren een aantal syndromische en niet-syndromische ziekten in de paustad van de Intrahepatische BDs3. Bovendien geven een aantal acute en chronische leverziekten aanleiding tot zogenaamde ductular reacties in de lever, die worden gedefinieerd als de aanwezigheid van een significant aantal cellen die biliaire markers uitdrukken, maar niet noodzakelijkerwijs voortvloeien uit biliaire cellen of vorm Patent BDs4. In de multi systeem stoornis Alagille syndroom (algs), haploinsufficiëntie van de inkeping ligand jagged1 (JAG1) resulteert in een slechte BD vorming en cholestase5,6. Ons lab heeft onlangs aangetoond dat een eerder gegenereerde Jag1 heterozygoot Mouse line7 een diermodel is van BD gebrek aan in algs8. In dit muismodel van ALGS zijn cholangiocyten nog steeds aanwezig. Ze zijn echter niet verplicht om zich te integreren in volwassen, patent BDs8. Daarom, analyse van de lever in een model van BD gebrek aan vereist meer dan de schijnbare aanwezigheid of afwezigheid van cholangiocyten. Het is belangrijk om de mate waarin volwassen BDs aanwezig zijn in de lever nauwkeurig te beoordelen.

In anatomische pathologie zijn er geaccepteerde kwantitatieve methoden om te beoordelen of BD gebrek aan9bestaat. Bijvoorbeeld, studies over algs bij menselijke patiënten kwantificeren vaak de BD naar portal ader (PV) ratio door het analyseren van ten minste 10 portaal vaten per leverbiopsie9,10. Analyse van de vorm en de algehele aanwezigheid of afwezigheid van patent BDs, gecombineerd met serum chemie, kan waardevolle informatie verschaffen over de ontwikkeling van BD in muizen11,12,13. Muizen kunnen echter een significant aantal Bdeen verliezen met slechts een bescheiden toename van het serum bilirubine niveau8. Dienovereenkomstig kan een kwantitatieve methode die het aantal aanwezige bd’s per PV evalueert, een directere meting van de mate van BD gebrek aan bij muizen opleveren. In een recent rapport kwantificeren we het aantal Bd’s per PV over alle lever lobben en rapporteerden we een significante afname in de BD-naar-PV-verhouding in Jag1 +/– dieren8. In de loop van onze analyse merkten we dat ondanks de significante variatie in de mate van inflammatoire respons en ductular reacties, de BD-naar-PV-verhouding niet veel variabiliteit toont8. Bovendien konden we met de kwantificering van de BD-naar-PV-ratio aantonen dat het verwijderen van één exemplaar van het glycosyltransferase gen Poglut1 in Jag1 +/– dieren hun BD gebrek aan8aanzienlijk kan verbeteren. In een Jag1 +/+ achtergrond resulteert voorwaardelijk verlies van Poglut1 in vasculaire gladde spiercellen in een progressieve toename van BD-getallen, wat bescheiden is (20-30%) bij P7 maar wordt prominent bij volwassenen8. Nogmaals, deze techniek liet ons toe om te laten zien dat zelfs bij P7, de toename van BD dichtheid bij deze dieren statistisch significant is. De verhoogde BD-dichtheid in dit genotype op vier maanden leeftijd werd ook gevalideerd door middel van hars giet analyse. 8 deze observaties en andere rapporten die de dichtheid van BD in verschillende algs-muizen modellen14,15 hebben gemeten, hebben ons ertoe aangezet deze methode in onze algemene strategie op te nemen om biliaire defecten in verschillende mutanten te analyseren en transgene muizen.

Hier, we detail een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om te onderzoeken de mate van BD gebrek aan in muismodellen van leverziekte (Figuur 1). Bij deze methode wordt co-kleuring met cholangiocyte markers cytokeratine (CK) 8 en CK19 (hierna Wide-spectrum CK, wsCK) gebruikt om Bd’s en cholangiocyten in de muis te visualiseren. Een antilichaam tegen alpha-glad spier actine (αsma) wordt toegevoegd aan de kleuring om schepen te labelen. Systematische analyse van de BD-naar-PV-verhouding in een gedeelte dat alle lever lobben omvat, zorgt ervoor dat een groot aantal Pv’s voor elk genotype wordt geanalyseerd. Omdat onze methode gebaseerd is op het kwantificeren van BDs en PVs in 2D-beelden, is het niet geschikt voor het bestuderen van de effecten van een bepaalde mutatie op de 3D-structuur van de galstructuur of de integriteit van de kleine galbuizen. Niettemin biedt het een eenvoudige en objectieve strategie voor onderzoekers om de biliaire ontwikkeling in de muis te beoordelen.

Protocol

Alle dieren werden ondergebracht in een barrière dierenfaciliteit aan Baylor College of Medicine per institutionele richtlijnen voor dierenverzorging en-gebruik en onder erkende dier protocollen. 1. verzameling van muis leverweefsel Bereiding van de muis voor de oogst van de lever Euthanas de muis met behulp van isoflurane. Voer cervicale dislocatie van de muis om de dood te garanderen. Maak een dwarse incisie ongeveer één inch ond…

Representative Results

We eerder gedocumenteerde biliaire gebreken in Jag1 +/– dieren, een muismodel van algs8. Om de BD-naar-PV-verhouding te bepalen, hebben we P30-muis levers verdeeld en ze samen met de vasculaire marker αSMA aan CK8 en CK19 (wsCK) gekoppeld. Vervolgens hebben we alle Pv’s in elk van de lever lobben gefotografeerd. Zoals weergegeven in Fig. 2a, hebben we pv’s gedefinieerd als αsma-bevlekte schepen met aangrenzende wsck-kleuri…

Discussion

Analyse van de ontwikkeling en reparatie van BD bij muizen is een belangrijk hulpmiddel bij het bestuderen van de pathogenese en het mechanisme van cholestatische aandoeningen. Daarnaast is de ontwikkeling van nieuwe therapieën deels afhankelijk van het tot stand brengen van een reproduceerbare en bij voorkeur kwantificeerbaar fenotype. Huidige fenotyping in muismodellen omvat meestal serum chemie, lever histologie en immunokleuring voor cel-type specifieke markers. Hoewel deze technieken waardevolle informatie generere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen de steun van de National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 en R01 DK109982), een pilot/haalbaarheids Award van de Texas Medical Center spijsvertering ziekte centrum onder NIH P30 DK56338, en een Alagille syndroom Accelerator Award van De medische basis.

Materials

Isothesia (Isoflurane) Henry Schein 11695-6776-2
Desiccator Bel-Art 16-800-552
10% PFA Electron Microscopy Sciences 15712
50mL tube ThermoScientific 339653
70% Ethanol Decon Laboratories 2401
95% Ethanol Decon Laboratories 2801
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
HistoChoice VWR Life Sciences H103-4L clearing agent
Omnisette Tissue Cassette Fisher HealthCare 15-197-710E
Macrosette Simport M512
Paraplast X-TRA McCormick Scientific 39503002 Parrafin
Tissue Mold Fisher Scientific 62528-32
Microtome Microm HM 325
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Xylene Fisher Scientific C8H10
Tris-Based Antigen Retrieval Vector Laboratories H-3301
Pressure Cooker Instant Pot Lux Mini
Mini Pap Pen Life Technologies 8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T. Baker X251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) J.T. Baker X198-07
Normal Goat Serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I Antibody Registry ID AB531826
anti-CK19 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-III Antibody Registry ID AB2133570
anti-αSMA Sigma Aldrich A2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488 ThermoFisher A21208
anti-mouse-Cy5 Jackson Immunoresearch 715-175-151
DAPI Vector Laboratories H-1000
22×50 micro cover glass VWR Life Sciences 48393 059
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Kimwipes Kimtech Science 05511
VECTASHIELD Vector Laboratories H-1000 Antifade Mounting Medium

References

  1. Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
  2. Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
  3. Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
  4. Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
  5. Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
  6. Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
  7. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  8. Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
  9. Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
  10. Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
  11. Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
  12. Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
  13. McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
  14. Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
  15. Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
  16. Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
  17. Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
  18. Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
  19. Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
  20. Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
  21. Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
  22. Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
  23. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  24. Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
  25. Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
  26. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
  27. Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
  28. Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).

Play Video

Cite This Article
Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (146), e59587, doi:10.3791/59587 (2019).

View Video