माउस लिवर में पित्त Duct घनत्व का निर्धारण
Summary
हम माउस जिगर में पित्त नली घनत्व का सही परिमाणीकरण के लिए एक बल्कि सरल और संवेदनशील विधि प्रस्तुत करते हैं. इस विधि आनुवंशिक और पर्यावरण संशोधक के प्रभाव और पित्त रोगों के माउस मॉडल में संभावित उपचार की प्रभावशीलता का निर्धारण करने में सहायता कर सकते हैं.
Abstract
माउस मोटे तौर पर पित्त रोगों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में प्रयोग किया जाता है। पित्त प्रणाली के विकास और समारोह का मूल्यांकन करने के लिए, विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया जाता है, सीरम रसायन विज्ञान सहित, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, और विशिष्ट मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग। हालांकि इन तकनीकों पित्त प्रणाली के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं, वे अक्सर पूरे जिगर भर में पित्त नली (बीडी) विकास दोष की एक पूरी तस्वीर पेश नहीं करते. यह पित्त विकास में महत्वपूर्ण हानि के साथ जानवरों में भी पित्त नाली करने के लिए माउस जिगर की मजबूत क्षमता के कारण भाग में है। यहाँ हम उत्परिवर्ती/ट्रांसजेनिक चूहों के सभी खण्डों को कवर करने वाले वर्गों में प्रत्येक पोर्टल नस (पीवी) से संबद्ध बीडी की औसत संख्या की गणना करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं। इस विधि में, जिगर घुड़सवार और विभिन्न जीनोटाइप और प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच तुलना की सुविधा के लिए एक stereotypic तरीके से काट रहे हैं. बीडी साइटोकेराटिन-सना हुआ cholangiocytes के प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पहचाने जाते हैं, और फिर जिगर अनुभाग में मौजूद PVs की कुल संख्या से गिना और विभाजित किया जाता है। एक उदाहरण के रूप में, हम बताते हैं कि कैसे इस विधि स्पष्ट रूप से जंगली प्रकार चूहों और Alagille सिंड्रोम के एक माउस मॉडल के बीच भेद कर सकते हैं. यहाँ प्रस्तुत विधि उन तकनीकों के लिए विकल्प नहीं दे सकती जो पित्ती वृक्ष की त्रि-आयामी संरचना को विज़ुअलाइज़ करती हैं। हालांकि, यह मात्रात्मक बीडी विकास और चूहों में डक्ट्युलर प्रतिक्रिया गठन की डिग्री का आकलन करने के लिए एक आसान और सीधा तरीका प्रदान करता है।
Introduction
पित्त का पेड़ स्तनधारी जिगर का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, पेट में hepatocytes से पित्त के पारित होने की अनुमति. इंट्राहेपेटिक पित्त नलिकाएं (बीडी) कोलंग्योसाइट्स द्वारा बनाई जाती हैं, जो नोच और टीजीएफ के माध्यम से द्वि-क्षमता हेपाटोब्लास्टों से अंतर करती हैं 1,2. उचित विनिर्देश और cholangiocytes और परिपक्व बीडी में उनकी विधानसभा की प्रतिबद्धता intrahepatic पित्ती पेड़ के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं. के रूप में जिगर के विकास के दौरान या अंग पुनर्जनन पर बढ़ता है, पित्त प्रणाली उचित पित्त जल निकासी सुनिश्चित करने के लिए जिगर के साथ विकसित करने की जरूरत है. इसके अलावा, syndromic और गैर-syndromic रोगों की एक संख्या intrahepatic बीडीएस3की कमी में परिणाम. इसके अलावा, तीव्र और पुरानी जिगर की बीमारियों की एक संख्या जिगर में तथाकथित डक्युलर प्रतिक्रियाओं को जन्म देती है, जो कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या की उपस्थिति के रूप में परिभाषित की जाती है जो पित्त मार्करों को व्यक्त करती हैं लेकिन अनिवार्य रूप से पित्त कोशिकाओं या रूप से उत्पन्न नहीं होती हैं पेटेंट बीडी4| मल्टीसिस्टम डिसऑर्डर में ऐगिले सिंड्रोम (एएलजीएस ) में , नच लिगेंड 1 (JAG1) की क्षमता खराब बीडी गठन और कोलेस्टेसिस5,6में होती है . हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में दिखा दिया है कि एक पहले से उत्पन्न Jag1 heterozygous माउस लाइन7 ALGS8में बीडी कमी का एक पशु मॉडल है . ALGS के इस माउस मॉडल में, cholangiocytes अभी भी मौजूद हैं. हालांकि, वे परिपक्व, पेटेंट बीडी8में शामिल करने के लिए प्रतिबद्ध करने में विफल। इसलिए, बीडी कमी के एक मॉडल में जिगर के विश्लेषण स्पष्ट उपस्थिति या cholangiocytes की अनुपस्थिति से अधिक की आवश्यकता है. यह सही डिग्री जो परिपक्व बीडी जिगर में मौजूद हैं का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
परमाणु विकृति में, यह आकलन करने के लिए मात्रात्मक तरीके स्वीकार किए जाते हैं कि बीडी की कमी9है या नहीं। उदाहरण के लिए, मानव रोगियों में एएलजीएस पर किए गए अध्ययन ों में अक्सर बीडी को यकृत बायोप्सी9,10 प्रति कम से कम 10 पोर्टल जहाजों का विश्लेषण करके पोर्टल नस (पीवी) अनुपातकीमात्रा निर्धारित की जाती है। आकार और समग्र उपस्थिति या पेटेंट बीडी की अनुपस्थिति का विश्लेषण, सीरम रसायन के साथ संयुक्त, चूहों में बीडी विकास के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं11,12,13. हालांकि, चूहों सीरम बिलीरूबिन स्तर8में केवल एक मामूली वृद्धि के साथ बीडीएस की एक महत्वपूर्ण संख्या खो सकते हैं। तदनुसार, एक मात्रात्मक विधि है कि पीवी प्रति मौजूद बीडी की संख्या का मूल्यांकन चूहों में बीडी कमी की डिग्री का एक अधिक प्रत्यक्ष उपाय प्रदान कर सकते हैं. हाल ही की एक रिपोर्ट में हमने सभी यकृत पालिमें प्रति बी डी की संख्या का आकलन किया और जग1+/- पशुओं8में बीडी से पीवी अनुपात में उल्लेखनीय कमी की सूचना दी। हमारे विश्लेषण के दौरान, हमने देखा कि भड़काऊ प्रतिक्रिया और नलिकाप्रतिक्रियाओं की डिग्री में महत्वपूर्ण भिन्नता के बावजूद, बीडी से पीवी अनुपात में अधिक परिवर्तनशीलता8नहीं दिखाई देती है। इसके अलावा, बीडी से पीवी अनुपात के परिमाणीकरण ने हमें यह प्रदर्शित करने की अनुमति दी कि जग1 में ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज जीन पोग्लू1 की एक प्रति को हटाने से उनकी बीडी कमी8में काफी सुधार हो सकता है। एक Jag1 + / + पृष्ठभूमि में, संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में Poglut1 की सशर्त हानि बीडी संख्या में एक प्रगतिशील वृद्धि में परिणाम है, जो मामूली है (20-30%) P7 पर लेकिन वयस्कों में प्रमुख हो जाताहै 8. फिर, इस तकनीक हमें दिखाने के लिए कि P7 में भी, इन जानवरों में बीडी घनत्व में वृद्धि सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है की अनुमति दी. ध्यान दें, उम्र के चार महीने में इस जीनोटाइप में वृद्धि हुई बीडी घनत्व राल डाली विश्लेषण के माध्यम से भी मान्य किया गया था. 8 इन टिप्पणियों और अन्य रिपोर्टों जो विभिन्न ALGS माउस मॉडल14में बीडी घनत्व मापा,15 हमें हमारे समग्र रणनीति में इस विधि को शामिल करने के लिए विभिन्न उत्परिवर्ती में पित्त दोष का विश्लेषण करने के लिए प्रेरित किया और ट्रांसजेनिक चूहों.
यहाँ, हम एक सरल तकनीक का विस्तार करते हैं जिसका उपयोग यकृत रोग के माउस मॉडलमें बीडी कमी की डिग्री की जांच करने के लिए किया जा सकता है (चित्र1)। इस विधि में, cholangiocyte मार्कर cytokeratin (सीके) 8 और CK19 (बाद में व्यापक स्पेक्ट्रम सीके, wsCK) के साथ सह-स्टेनिंग माउस जिगर में बीडी और unincorporated cholangiocytes कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अल्फा चिकनी मांसपेशी actin के खिलाफ एक एंटीबॉडी ($SMA) लेबल वाहिकाओं के लिए धुंधला करने के लिए जोड़ा जाता है. सभी जिगर lobes को कवर एक खंड में बीडी से पीवी अनुपात के व्यवस्थित विश्लेषण सुनिश्चित करता है कि PVs की एक बड़ी संख्या में प्रत्येक जीनोटाइप के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. चूंकि हमारी विधि 2 डी छवियों में बीडी और पीवी की मात्रा निर्धारित करने पर निर्भर करती है, यह पित्त ी के पेड़ की 3 डी संरचना या छोटे पित्त नाली की अखंडता पर दिए गए उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं है। फिर भी, यह जांचकर्ताओं के लिए माउस में पित्त विकास का आकलन करने के लिए एक सरल और उद्देश्य रणनीति प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
चूहों में बीडी विकास और मरम्मत का विश्लेषण रोगजनन और cholestatic विकारों के तंत्र का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण है। इसके अलावा, नए उपचारों का विकास एक पुन: उत्पादनीय और अधिमानतः परिमाणात्मक फीनोटाइ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (R01 GM084135 और R01 DK109982), NIH P30 DK56338 के तहत टेक्सास मेडिकल सेंटर पाचन रोग केंद्र से एक पायलट / मेडिकल फाउंडेशन.
Materials
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
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