Summary

Determinazione della densità del dotto biliare nel fegato del topo

Published: April 30, 2019
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Summary

Vi presentiamo un metodo piuttosto semplice e sensibile per la quantificazione accurata della densità del condotto biliare nel fegato del topo. Questo metodo può aiutare a determinare gli effetti dei modificatori genetici e ambientali e l’efficacia delle potenziali terapie nei modelli murini delle malattie biliari.

Abstract

Il topo è ampiamente usato come organismo modello per studiare le malattie biliari. Per valutare lo sviluppo e la funzione del sistema biliare, vengono utilizzate varie tecniche, tra cui la chimica del siero, l’analisi istologica e l’immunostaining per marcatori specifici. Anche se queste tecniche possono fornire importanti informazioni sul sistema biliare, spesso non presentano un quadro completo dei difetti dello sviluppo del dotto biliare (BD) in tutto il fegato. Ciò è in parte dovuto alla robusta capacità del fegato di topo di drenare la bile anche negli animali con compromissione significativa nello sviluppo biliare. Qui presentiamo un metodo semplice per calcolare il numero medio di BD associati a ogni vena del portale (PV) in sezioni che coprono tutti i lobi di topi mutanti/transgenici. In questo metodo, i fegati sono montati e sezionato in modo stereotipato per facilitare il confronto tra vari genotipi e condizioni sperimentali. I BD sono identificati tramite microscopia leggera dei cholangiociti macchiati di citokeratina, e quindi contati e divisi per il numero totale di FOTO presenti nella sezione epatica. Ad esempio, mostriamo come questo metodo possa distinguere chiaramente tra topi selvatici e un modello murino della sindrome di Alagille. Il metodo qui presentato non può sostituire le tecniche che visualizzano la struttura tridimensionale dell’albero biliare. Tuttavia, offre un modo semplice e diretto per valutare quantitativamente lo sviluppo della BD e il grado di formazione della reazione dudulare nei topi.

Introduction

L’albero biliare è una parte critica del fegato dei mammiferi, permettendo il passaggio della bile dagli epatociti nell’intestino. I dotti biliari intraepatici (BD) sono formati da cholangiociti, che si differenziano dagli epatoblasti bipotenziali attraverso la segnalazione di Notch e TGF Una corretta specificazione e impegno dei cholangiocyti e del loro assemblaggio in BD maturi sono fondamentali per lo sviluppo dell’albero biliare intraepatico. Come il fegato cresce durante lo sviluppo o sulla rigenerazione dell’organo, il sistema biliare ha bisogno di sviluppare lungo il fegato per garantire il corretto drenaggio della bile. Inoltre, un certo numero di malattie sindromiche e non sindromiche si traducono nella scarsità di BD intraepatici3 . Inoltre, una serie di malattie acute e croniche del fegato danno origine alle cosiddette reazioni dudulle nel fegato, che sono definite come la presenza di un numero significativo di cellule che esprimono marcatori biliari ma non derivano necessariamente da cellule biliari o forme brevetto BD4. Nel disturbo multisistema la sindrome di Alagille (ALGS), aploinsufficienza del ligando di Notch(JAG1) provoca scarsa formazione di BD e colestasi5,6. Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che una lineadi mouse Jag1 eterozygous generata in precedenza è un modello animale di paucedia BD in ALGS8. In questo modello di topo di ALGS, i cholangiocytes sono ancora presenti. Tuttavia, non riescono a impegnarsi nell’incorporazione in maturi, brevetti BD8. Pertanto, l’analisi del fegato in un modello di paucity BD richiede più della presenza apparente o assenza di colgaliociti. È importante valutare con precisione il grado di presenza di BD maturi nel fegato.

Nella patologia anatomica, ci sono metodi quantitativi accettati per valutare se la paucity BD esiste9. Ad esempio, gli studi su ALGS su pazienti umani spesso quantificano il rapporto BD-vina porta (PV) analizzando almeno 10 vasi portali per biopsia epatica9,10. L’analisi della forma e la presenza complessiva o l’assenza di BD brevettati, combinati con la chimica del siero, possono fornire preziose informazioni sullo sviluppo di BD nei topi11,12,13. Tuttavia, i topi possono perdere un numero significativo di BD con solo un modesto aumento del livello biliarina del siero8. Di conseguenza, un metodo quantitativo che valuta il numero di BD presenti per fotovoltaico può fornire una misura più diretta del grado di scarsità di BD nei topi. In un recente rapporto, abbiamo quantificato il numero di BD per FOTO in tutti i lobi epatici e segnalato una significativa diminuzione del rapporto BD-PV in Jag1/– animali8. Nel corso della nostra analisi, abbiamo notato che, nonostante la variazione significativa nel grado di risposta infiammatoria e reazioni dudulare, il rapporto BD-PV non mostra molta variabilità8. Inoltre, la quantificazione del rapporto BD-PV ci ha permesso di dimostrare che la rimozione di una copia del gene glicosiltransferasi Poglut1 in Jag1- / gli animali possono migliorare significativamente la loro scarsità di BD8. In uno sfondo di Jag1/ , la perdita condizionale di Poglut1 nelle cellule muscolari limpiche vascolari si traduce in un aumento progressivo del numero di BD, che è modesto (20-30%) a P7 ma diventa prominente negli adulti8. Anche in questo caso, questa tecnica ci ha permesso di dimostrare che anche a P7, l’aumento della densità di BD in questi animali è statisticamente significativo. Da notare che l’aumento della densità di BD in questo genotipo a quattro mesi di età è stato convalidato anche attraverso l’analisi del getto di resina. 8 Queste osservazioni e altre relazioni che misuravano la densità di BD in diversi modelli murini ALGS14,15 ci hanno spinto a incorporare questo metodo nella nostra strategia complessiva per analizzare i difetti biliari in vari modelli mutanti e topi transgenici.

In questo caso, viene descritta in dettaglio una tecnica semplice che può essere utilizzata per esaminare il grado di scarsità di BD nei modelli murini di malattia epatica (Figura 1). In questo metodo, la co-colorazione con marcatori di colosso ciclica (CK) 8 e CK19 (in seguito ad ampio spettro CK, wsCK) viene utilizzata per visualizzare BD e cholangiocyte non incorporati nel fegato del topo. Un anticorpo contro l’actina muscolare alfa-liscio (SMA) viene aggiunto alla colorazione per etichettare i vasi. L’analisi sistematica del rapporto BD-PV in una sezione che copre tutti i lobi epatici assicura che un gran numero di fotocamere venga analizzato per ogni genotipo. Poiché il nostro metodo si basa sulla quantificazione di BD e PV in immagini 2D, non è adatto per studiare gli effetti di una determinata mutazione sulla struttura 3D dell’albero biliare o sull’integrità dei piccoli condotti biliari. Tuttavia, fornisce una strategia semplice e oggettiva per gli investigatori per valutare lo sviluppo biliare nel mouse.

Protocol

Tutti gli animali sono stati alloggiati in una struttura per animali barriera presso il Baylor College of Medicine per le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali e con protocolli animali approvati. 1. Collezione di tessuto epatico del topo Preparazione del topo per la raccolta del fegato Eutanasia il topo usando l’isoflurane. Eseguire lussazione cervicale del topo per garantire la morte. Fare un’incisi…

Representative Results

In precedenza abbiamo documentato i difetti biliari negli animali Jag1/– un modello murino di ALGS8. Per determinare il rapporto BD-PV, abbiamo sezionato i fegati di topo P30 e li abbiamo co-macchiati per CK8 e CK19 (wsCK) insieme al marcatore vascolare sMA. Abbiamo poi immaginato tutti i PV in ciascuno dei lobi epatici. Come illustrato nella Figura 2A, abbiamo definito i PV come vasi con colorazione sMA con colorazione wsCK…

Discussion

L’analisi dello sviluppo e della riparazione di BD nei topi è uno strumento importante per studiare la patogenesi e il meccanismo dei disturbi colestatici. Inoltre, lo sviluppo di nuove terapie dipende in parte dalla creazione di un fenotipo riproducibile e preferibilmente quantificabile. L’attuale fenotipizzazione nei modelli murini di solito coinvolge la chimica del siero, l’istologia del fegato e l’immunostaining per marcatori specifici di tipo cellulare. Sebbene queste tecniche generino informazioni preziose sulla s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono il sostegno del National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 e R01 DK109982), un Pilot/Feasibility Award del Texas Medical Center Digestive Disease Center sotto NIH P30 DK56338, e un Alagille Syndrome Accelerator Award da La Fondazione Medica.

Materials

Isothesia (Isoflurane) Henry Schein 11695-6776-2
Desiccator Bel-Art 16-800-552
10% PFA Electron Microscopy Sciences 15712
50mL tube ThermoScientific 339653
70% Ethanol Decon Laboratories 2401
95% Ethanol Decon Laboratories 2801
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
HistoChoice VWR Life Sciences H103-4L clearing agent
Omnisette Tissue Cassette Fisher HealthCare 15-197-710E
Macrosette Simport M512
Paraplast X-TRA McCormick Scientific 39503002 Parrafin
Tissue Mold Fisher Scientific 62528-32
Microtome Microm HM 325
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Xylene Fisher Scientific C8H10
Tris-Based Antigen Retrieval Vector Laboratories H-3301
Pressure Cooker Instant Pot Lux Mini
Mini Pap Pen Life Technologies 8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T. Baker X251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) J.T. Baker X198-07
Normal Goat Serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I Antibody Registry ID AB531826
anti-CK19 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-III Antibody Registry ID AB2133570
anti-αSMA Sigma Aldrich A2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488 ThermoFisher A21208
anti-mouse-Cy5 Jackson Immunoresearch 715-175-151
DAPI Vector Laboratories H-1000
22×50 micro cover glass VWR Life Sciences 48393 059
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Kimwipes Kimtech Science 05511
VECTASHIELD Vector Laboratories H-1000 Antifade Mounting Medium

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Cite This Article
Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (146), e59587, doi:10.3791/59587 (2019).

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