Summary
यहाँ, साइनोबैक्टीरियल के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर जारी किया और उनके exoproteomes के अलगाव का वर्णन कर रहे हैं. दोनों प्रक्रियाओं आगे विश्लेषण या अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि उच्च शुद्धता डिग्री के साथ पॉलिमर या प्रोटीन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रतीक. वे भी आसानी से विशिष्ट उपयोगकर्ता की जरूरत के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
सायनोबैक्टीरिया जैव अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला को बाह्य कोशिकीय वातावरण में सक्रिय रूप से स्रावित कर सकता है, जैसे कि हेटेरोपॉलीसैकेराइड और प्रोटीन। इन जैव अणुओं की पहचान और विशेषता उनके स्राव रास्ते के बारे में ज्ञान में सुधार कर सकते हैं और उन्हें हेरफेर करने में मदद कर सकते हैं। इसके अलावा, इन जैव अणुओं में से कुछ भी जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के संदर्भ में दिलचस्प हैं. यहाँ वर्णित साइनोबैक्टीरियल जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और प्रोटीन के आसान और तेजी से अलगाव के लिए दो प्रोटोकॉल हैं. जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर के अलगाव के लिए विधि कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग कर जलीय समाधान में polysaccharides की पारंपरिक वर्षा तकनीकों पर आधारित है। इस विधि बहुलक की विशेषताओं को बरकरार रखता है और एक साथ सेल मलबे और संस्कृति माध्यम से contaminants की उपस्थिति से बचा जाता है. प्रक्रिया के अंत में, lyophilized बहुलक इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है या विशेषता या शुद्धि के आगे दौर के अधीन किया जा सकता है, अंतिम इरादा उपयोग के आधार पर. सायनोबैक्टीरियल एक्सोप्रोटओम के अलगाव के बारे में, तकनीक सेंट्रीफ्यूगेशन और निस्पंदन द्वारा प्रमुख संदूषकों को हटाने के बाद सेल-मुक्त माध्यम की एकाग्रता पर आधारित है। इस रणनीति प्रोटीन है कि झिल्ली ट्रांसपोर्टरों या बाहरी झिल्ली vesicles के माध्यम से extracellular वातावरण तक पहुँचने के विश्वसनीय अलगाव के लिए अनुमति देता है. इन प्रोटीन बाद में मानक मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक का उपयोग कर पहचाना जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल न केवल साइनोबैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन यह भी अन्य जीवाणु उपभेदों के लिए. इसके अलावा, इन प्रक्रियाओं को आसानी से उत्पादों के अंतिम उपयोग के अनुसार सिलवाया जा सकता है, शुद्धता की डिग्री की आवश्यकता है, और जीवाणु तनाव.
Introduction
Cyanobacteria व्यापक रूप से वादा जैव प्रौद्योगिकी / इसलिए, साइनोबैक्टीरियल स्राव तंत्र को समझना और निष्कर्षण/पुनर्प्राप्ति विधियों के अनुकूलन को कुशल माइक्रोबियल सेल कारखानों के रूप में साइनोबैक्टीरिया को लागू करने के लिए आवश्यक है।
कई सायनोबैक्टीरियल उपभेदों को कोशिकीय बहुलक पदार्थ (ईपीएस) का उत्पादन करने में सक्षम हैं, जो मुख्य रूप से विषमपालिसैकेराइड द्वारा निर्मित होते हैं, जो कोशिका की सतह से जुड़े रहते हैं या मध्यम1में छोड़े जाते हैं। इन जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर अन्य बैक्टीरिया से उन लोगों की तुलना में अलग विशेषताएं हैं, जो उन्हें अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त बनाने (जैसे, antivirals2, इम्यूनोस्टिमुलेटरी3, एंटीऑक्सीडेंट4, धातु-चेलेटिंग5, पायसीकारी6, और दवा वितरण एजेंट7,8) . इन बहुलकों के पृथक्रूपन की पद्धति न केवल उपज में सुधार करती हैबल्कि 9 प्राप्त बहुलक के शुद्धता और विशिष्ट भौतिक गुणों में भी वृद्धि करती है . बहुलकों के पृथक्सन के लिए इन विधियों का एक विशाल बहुमत संस्कृति माध्यम से वर्षा रणनीतियों पर निर्भर करता है जो बहुलक के प्रबल एनिओनिक प्रकृति9,10के कारण आसानी से पूरा हो जाता है। इसके अलावा, वर्षण चरण में प्रयुक्त सॉल्वैंट्स को हटाने को वाष्पीकरण और/या lyophilization द्वारा तेजी से प्राप्त किया जा सकता है। पूर्वानुमेय आवेदन के आधार पर, अंतिम उत्पाद को अनुकूलित करने के लिए बहुलक वर्षा के बाद या उससे पहले अलग-अलग चरणों को युग्मित किया जा सकता है, जिसमें ट्राइक्लोरोऐसीटिक एसिड (टीसीए) उपचार, निस्पंदन, या आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) शामिल हैं। स्तंभ शोधन10|
Cyanobacteria भी झिल्ली ट्रांसपोर्टरों पर निर्भर रास्ते के माध्यम से प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला स्रावित करने में सक्षम हैं (क्लासिक)11 या vesicles द्वारा मध्यस्थता (गैर शास्त्रीय)12. इसलिए, साइनोबैक्टीरियल एक्सोप्रोटओम का विश्लेषण एक आवश्यक उपकरण का गठन करता है, दोनों को समझने के लिए/ विश्वसनीय अलगाव और exoproteomes के विश्लेषण extracellular वातावरण की एकाग्रता की आवश्यकता है, के बाद से स्रावित प्रोटीन की बहुतायत अपेक्षाकृत कम है. इसके अलावा, अन्य भौतिक या रासायनिक कदम (उदा., सेंट्रीफ्यूगेशन, निस्पंदन, या प्रोटीन वर्षा) प्राप्त एक्सोप्रोटीओम की गुणवत्ता का अनुकूलन कर सकते हैं, प्रोटीन सामग्री को समृद्ध कर सकते हैं13, और contaminants की उपस्थिति से बचने (उदा, वर्णक, कार्बोहाइड्रेट आदि) 14 , 15 या नमूनों में इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन की प्रधानता। हालांकि, इन चरणों में से कुछ भी प्रोटीन है कि पता लगाया जा सकता है के सेट को प्रतिबंधित कर सकते हैं, एक पक्षपाती विश्लेषण करने के लिए अग्रणी.
यह काम जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और साइनोबैक्टीरिया संस्कृति मीडिया से exoproteomes के अलगाव के लिए कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. इन प्रोटोकॉल आसानी से अध्ययन के विशिष्ट उद्देश्यों और उपयोगकर्ता की जरूरत के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जबकि बुनियादी यहाँ प्रस्तुत कदम को बनाए रखने.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. सायनोबैक्टीरियल जारी कार्बोहाइड्रेट बहुलक अलगाव
-
पॉलिमर अलगाव और contaminants को हटाने
- मानक परिस्थितियों के तहत साइनोबैक्टीरियल तनाव की खेती करें [उदाहरण के लिए, 12 एच प्रकाश के तहत 30 डिग्री सेल्सियस (50 डिग्री सेल्सियस[2s]1)/12 h अंधेरे आहार, 150 rpm पर कक्षीय मिलाते हुए के साथ। मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके विकास को मापें [उदा., 730 एनएम (ओडी730nm)पर ऑप्टिकल घनत्व , क्लोरोफिल ए, शुष्क-भार, आदि], फिर फीनॉल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि16के अनुसार जारी पॉलीसैकेराइड्स के उत्पादन को मापें।
- डायलिसिस झिल्ली में संस्कृति स्थानांतरण (12-14 आणविक वजन कट-ऑफ के केडीए) और लगातार सरगर्मी के साथ 24 एच के लिए deionized पानी की एक न्यूनतम 10 संस्करणों के खिलाफ डायलीज।
नोट: डायलीज़ और मध्यम संरचना के लिए संस्कृति की मात्रा पर निर्भर करता है, यह डायलिसिस पानी बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें। एक नई शीशी के लिए supernatant स्थानांतरण और गोली (कोशिकाओं) को त्यागें।
- सेल दीवार मलबे या lipopolysaccharides (LPS) के रूप में contaminants को दूर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर फिर से सेंट्रीफ्यूज।
- सुपरनेंट को कांच बीकर में स्थानांतरित करें और गोली को त्याग दें।
-
बहुलक की वर्षा
- सुपरनेंट में 96% इथेनॉल की 2 मात्रा जोड़ें।
- निलंबन को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, कम से कम रात भर।
- पॉलिमर वसूली
- छोटे या नहीं दिखाई मात्रा के लिए वेग से बहुलक: 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए 13,000 x g पर निलंबन centrifuge. सुपरनेंट को त्याग दें और 1 एमएल या 2 एमएल ऑटोक्लेव्ड डिओनीकृत पानी में गोली को फिर से चालू करें। जलीय निलंबन को शीशी में स्थानांतरित करें।
चेतावनी: supernatant धीरे खारिज कर दिया जाना चाहिए, क्योंकि यह आसानी से resuspended हो सकता है. - दिखाई के लिए / बड़ी मात्रा में वेग से बहुलक: एक शीशी के लिए बाँझ धातु संदंश के साथ वेगसेक बहुलक इकट्ठा। बहुलक निचोड़ और अतिरिक्त इथेनॉल त्यागें।
- छोटे या नहीं दिखाई मात्रा के लिए वेग से बहुलक: 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए 13,000 x g पर निलंबन centrifuge. सुपरनेंट को त्याग दें और 1 एमएल या 2 एमएल ऑटोक्लेव्ड डिओनीकृत पानी में गोली को फिर से चालू करें। जलीय निलंबन को शीशी में स्थानांतरित करें।
- वैकल्पिक: आवश्यक बहुलक शुद्धि की डिग्री के आधार पर, deionized पानी में पॉलिमर के resuspension के बाद 96% इथेनॉल के साथ वर्षा कदम दोहराएँ.
-
बहुलक का Lyophilization
- -80 डिग्री सेल्सियस पर वेग से गिरे बहुलक के साथ शीशियों रखें, कम से कम रात भर।
- फ्रीज-सूखी (lyophilize) कम से कम 48 एच के लिए बहुलक (फ्रीज सुखाने से पहले निलंबन defrost मत देना)।
- आगे का उपयोग जब तक कमरे के तापमान (आरटी) पर सूखे बहुलक स्टोर।
नोट: एक desiccator में बहुलक भंडारण सलाह दी जाती है, क्योंकि यह समय के साथ पानी को अवशोषित कर सकते हैं.
2. सायनोबैक्टीरियल एक्सोप्रोटीओम अलगाव
-
मध्यम एकाग्रता
- मानक शर्तों के तहत सायनोबैक्टीरिया की खेती करें [उदाहरण के लिए, 12 एच प्रकाश के तहत 30 डिग्री सेल्सियस (50 डिग्री सेल्सियस[2s]1)/12 h अंधेरे आहार, कक्षीय 150 आरपीएम पर मिलाते हुए। मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर सायनोबैक्टीरियम विकास की निगरानी करें (उदा., ओडी730nm, क्लोरोफिल ए,शुष्क-भार, आदि )।
- आरटी में 10 मिनट के लिए, 4,000 x ग्राम पर संस्कृतियों को सेंट्रीफ्यूज करें।
- सुपरनेंट को फ्लास्क में स्थानांतरित करें और सेल गोली को त्याग दें।
- एक 0.2 डिग्री मीटर pores आकार फिल्टर के माध्यम से decanted माध्यम फ़िल्टर.
नोट: प्रोटोकॉल यहाँ एक कम समय अवधि के लिए रोका जा सकता है, अगर माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है. - माध्यम लगभग 500x ध्यान केंद्रित (फिल्टर्ड माध्यम के प्रारंभिक मात्रा पर विचार), 3 kDa के एक नाममात्र आणविक वजन कट-ऑफ के साथ केन्द्रापसारक concentrators का उपयोग कर. सेंट्रीफ्यूगेशन को 4,000 x g (अधिकतम 1 ज प्रतिशत सेंट्रीफ्यूगेशन राउंड) पर 15 डिग्री सेल्सियस पर संचालित किया जाना चाहिए।
चेतावनी: concentrator ब्रांडों के बहुमत के लिए, फिल्टर डिवाइस उपयोग करने से पहले ultrapure पानी के साथ centrifugation द्वारा कुल्ला करने की जरूरत है. एक बार फिल्टर गीला है, यह बाहर सूखी मत करो. जब डिवाइस का उपयोग नहीं किया जा रहा है तो जलाशय पर पर्याप्त तरल पदार्थ छोड़ दें।
नोट: अपकेंद्रण तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस तक कम करना सहायक हो सकता है यदि उद्देश्य प्रोटीन गतिविधि का अध्ययन करना है, हालांकि यह नमूना एकाग्रता के लिए आवश्यक समय में वृद्धि करेगा। यदि माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है तो प्रोटोकॉल को अल्प समयावधियों के लिए अपकेंद्रण चरणों के बीच रोका जा सकता है। - केंद्रित नमूना के साथ फिल्टर डिवाइस नमूना जलाशय की दीवारों कुल्ला और एक microcentrifuge ट्यूब के लिए सामग्री हस्तांतरण.
- अधिक से अधिक exoproteome वसूली सुनिश्चित करने के लिए autoclaved संस्कृति माध्यम के साथ फिल्टर डिवाइस नमूना जलाशय के एक अतिरिक्त धोने कदम प्रदर्शन करते हैं।
नोट: पुनर्प्राप्ति के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करने के लिए, विशिष्ट निर्माता के निर्देशों का पालन करें। - आगे का उपयोग करने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एक्सोप्रोटीओम नमूने स्टोर करें।
नोट: लंबी अवधि के भंडारण के लिए प्रोटीज़ अवरोधकों के अलावा की सिफारिश की जाती है।
-
एक्सोप्रोटीओम का विश्लेषण
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार 96-वेल प्लेट में बीसीए प्रोटीन परख द्वारा प्रोटीन सामग्री को क्वांटिफित करें।
- सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा प्रोटीन को अलग, मानक धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग कर (जैसे, Coomasie नीले, चांदी धुंधला).
- ब्याज के बैंड/जेल क्षेत्रों को काट लें और उन्हें विभिन्न माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एकत्र करें जिसमें अल्ट्रा-शुद्ध जल की उचित मात्रा होती है।
- बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन की पहचान और विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
सायनोबैक्टीरियल संस्कृतियों से मुक्त कार्बोहाइड्रेट बहुलकों को निकालने के लिए वर्णित विधि का एक योजनाबद्ध निरूपण चित्र 1में दर्शाया गया है। मध्यम ईपीएस उत्पादक सायनोबैक्टीरियम साइकोबैक्टीरियम साइकोसिस्टिस एसपी पीसीसी 6803 और कुशल ईपीएस निर्माता सायनोथीस एसपी सी सी आई 0110 से पूर्वनिर्धारित बहुलक चित्र 2में दिखाए गए हैं। चित्र 3में, संदूषण के विभिन्न डिग्री के साथ lyophilized पॉलिमर दिखाया गया है, अंतिम उत्पाद शुद्धता के लिए centrifugation चरणों के महत्व पर प्रकाश डाला. चित्र 4 साइनोबैक्टीरियल एक्सोप्रोटीओम के लिए अलगाव विधि को दर्शाया गया है। विशिष्ट कोशिका-मुक्त माध्यम केंद्रित नमूने (अर्थात्, विभिन्न विकास चरणों में संस्कृतियों से प्राप्त और कम कैरोटीनॉयड उत्पादन के साथ एक साइनोबैक्टीरियल तनाव से) चित्र 5में दिखाए गए हैं। दो रूपात्मक रूप से अलग सायनोबैक्टीरियल उपभेदों से एक्सोप्रोटओम नमूने, एककोशिकीय सायनोबैक्टीरिया साइकोसिस्टिस एसपी 6803 और फिलामेंटेनस सायनोबैक्टीरिया एनाबाना एसपी पीसीसी 7120, एसडीएस-पेज द्वारा अलग किए गए हैं। चित्र 6|
चित्र 1 : के अलगाव के लिए कार्यप्रवाह सायनोबैक्टीरियल ने कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर जारी किए। सायनोबैक्टीरियल संस्कृति और contaminants को हटाने और बहुलक अलगाव और lyophilization के साथ समाप्त से शुरू. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : वर्षा के बाद साइनोबैक्टीरियल पॉलिमर। (क) वर्षा और अपकेंद्रण (ए) वर्षा के बाद अपकेंद्रित्र फ्लास्क की दीवार पर मध्यम ईपीएस उत्पादक साइकोकोसिस्टिस एसपी पीसीसी 6803 से पॉलिमर। (बी) कुशल ईपीएस निर्माता Cyanothece एसपी से पॉलिमर clumps 0110 वर्षा के बाद कांच बीकर में चल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : Lyophilized सायनोबैक्टीरियल पॉलिमर. (A) सिनेकोसिस्टिस एसपी से अलग पॉलिमर के तीन स्वतंत्र बैच: बिना दृश्य संदूषण (एआई), और पिग्मेंटेशन के साथ कैरोटीनोइड (एआई) या सेल मलबे (एIII) के साथ संदूषण का संकेत . (बी) Cyanothece एसपी CCY 0110 से Lyophilized बहुलक. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : वर्कफ़्लो के लिए सायनोबैक्टीरियल एक्सोप्रोटीओम अलगाव। साइनोबैक्टीरियल संस्कृति से मध्यम जुदाई और एकाग्रता के लिए, एक्सोप्रोटीओम विश्लेषण के साथ समाप्त होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5 : केंद्रित सेल मुक्त मध्यम नमूने के साथ Microcentrifuge ट्यूबों। (क) Synechocystis एसपी पीसीसी 6803 जंगली प्रकार से केंद्रित मध्यम नमूने, विभिन्न OD730nm (0.5, 1, और 2) में एकत्र. (बी) सिनेकोसिस्टिस से केंद्रित मध्यम नमूना -sigF, बिगड़ा carotenoids उत्पादन15के साथ एक उत्परिवर्ती . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6 : Coomassi नीले रंग का सना हुआ एसडीएस-पेज जैल सायनोबैक्टीरियल सेल मुक्त केंद्रित माध्यम में जमा प्रोटीन दिखा. (क) एककोशिकीय सायनोबैक्टीरिया साइकोसिस्टिस एसपी पीसीसी 6803 वाइल्ड-टाइप और ]सिगफ उत्परिवर्ती से एक्सोप्रोटम। (बी) साइकोकोसिस्टिस से एक्सोप्रोटियोम -सिगएफ पॉलीसैकेराइड के उच्च स्तर के साथ दूषित होता है। (C) तंतुश सायनोबैक्टीरियम एनाबाना एसपी पीसीसी 7120 से एक्सप्रोटियोम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
जीवाणु स्राव तंत्र को बेहतर ढंग से समझने और जारी किए गए उत्पादों का अध्ययन करने के लिए, अतिरिक्त कोशिकीय जीवाणु वातावरण में मौजूद जैव अणुओं के कुशल अलगाव और विश्लेषण को प्रदर्शित करना अत्यधिक महत्वपूर्ण है (जैसे जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और प्रोटीन).
सायनोबैक्टीरियल एक्स्ट्रासेलर कार्बोहाइड्रेट बहुलक अत्यंत जटिल होते हैं, मुख्य रूप से विभिन्न मोनोसैकेराइडकी की संख्या और अनुपात के कारण जो उनकी संरचना1का गठन करते हैं। इन बहुलक पदार्थों के अलगाव के लिए इस्तेमाल पारंपरिक तरीकों सरल अवधारणा है कि इन चीनी समृद्ध पदार्थ जलीय समाधान में घुलनशील हैं और कार्बनिक सॉल्वैंट्स के अलावा द्वारा वेग से किया जा सकता है पर भरोसा करते हैं (जैसे एसीटोन या इथेनॉल के रूप में)9 ,17,18. यह बहुलक के जलयोजन के गोले से पानी के अणुओं की निकासी के कारण होता है, और प्रक्रिया की दक्षता बहुलक आणविक वजन पर आंतरिक रूप से निर्भर करता है (उच्च आणविक वजन अंश पर अधिक कुशल), रासायनिक संरचना, और संकेन्द्रण9,18. वर्षा चरण के अलावा, यहाँ वर्णित विधि डायलिसिस और अपकेंद्रण के महत्वपूर्ण कदम भी शामिल है. डायलिसिस कुशलता से मध्यम से लवण और अन्य यौगिकों को हटा देगा, जो पाउडर की तरह संरचनाओं के रूप में lyophilization के बाद दिखाई दे सकता है, जबकि अपकेंद्रण कदम प्रमुख contaminants और सेल मलबे को हटा देगा।
इन चरणों के दौरान विफलताओं अलगाव बैच के आधार पर उच्च संदूषण के स्तर और विभिन्न विशेषताओं के साथ पॉलिमर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। कुछ संदूषण आसानी से बहुलक lyophilization के बाद मैक्रोस्कोपिक रूप से पता लगाया जा सकता है, क्योंकि वे बहुलक pigmentation (आमतौर पर सफेद या हल्के भूरे रंग) बदल जाएगा. उदाहरण के लिए, lyophilized पॉलिमर कि हरे या नारंगी हैं आम तौर पर सेल मलबे के साथ अत्यधिक दूषित कर रहे हैं / यह अपकेंद्रण चरणों में अपर्याप्त समय या जी बल से संबंधित है। हालांकि, कुछ सायनोबैक्टीरियल उपभेदों pigments जारी कर सकते हैं और प्रोटीन है कि स्वाभाविक रूप से पॉलिमर के साथ जुड़े रहते हैं, और यह जब अंतिम उत्पाद19का विश्लेषण करने पर विचार करने की जरूरत है. बहुलकों (जैसे, टीसीए उपचार)10को और अधिक शुद्ध करने के लिए अतिरिक्त कदम जोड़े जा सकते हैं। फिर भी, इन शुद्धि कदम भी अंतिम उत्पाद में एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है, प्रोटीन और अन्य घटकों को हटाने के रूप में बहुलक गुण (जैसे, चिपचिपापन, हाइड्रोफोबिकिटी, आदि) को बदल सकते हैं 1 , 20. वर्षा/lyophilization चरणों को दोहराने से भी बहुलकों पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है, मुख्य रूप से फ्रीज-थॉइंग चक्र के कारण जो आसानी से अपने भौतिक रासायनिक गुणों को संशोधित करतेहैं 21. बहुलक पैदावार में सुधार करने के लिए, हीटिंग उपचार वर्षा से पहले पूरी संस्कृतियों के लिए लागू किया जा सकता है। यह अतिरिक्त चरण कोशिका सतह से संबद्ध बहुलक को मुक्त करता है, परंतु इससे बहुलकन18,20भी हो सकता है। संक्षेप में यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रोटोकॉल का चुनाव पृथक बहुलकों9,20दोनों की मात्रा और गुणवत्ता को प्रभावित करेगा।
बाह्य कोशिकीय वातावरण में पहचाने गए सायनोबैक्टीरियल प्रोटीन के बारे में, वे आणविक भार और आइसोइलेक्ट्रिक अंक की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदर्शित करते हैं और या तो घुलनशील या झिल्ली-संबद्ध हो सकते हैं। भौतिक रासायनिक गुणों की यह विविधता एक्सोप्रोटओम आइसोलेशन के लिए सबसे उपयुक्त विधि के चयन के लिए एक मुद्दे का प्रतिनिधित्व करती है। यहाँ प्रस्तुत विधि बाह्य कोशिकीय वातावरण में जैव अणुओं की सांद्रता पर अत्यधिक निर्भर करती है। यह विधि न केवल प्रोटीन को अलग करती है जो मध्यम में स्रावित होती है बल्कि बाहरी झिल्ली vesicles (OMVs) में मौजूद प्रोटीन और सेल lysis से व्युत्पन्न होती है। इसलिए, centrifugation कदम धीरे सेल व्यवधान से बचने के लिए किया जाना चाहिए, लेकिन एक ही समय में OMVs इकट्ठा. सायनोबैक्टीरियल उपभेदों में जो कुशल OMVs उत्पादक होते हैं, एक्सोप्रोटीओम तैयारियां आमतौर पर इन लिपिडिक संरचनाओं14,15के साथ जुड़े कैरोटीनोइड की उपस्थिति के कारण नारंगी होती हैं। हालांकि, यह सुविधा साइनोबैक्टीरियल तनाव और विकास चरण के आधार पर काफी भिन्न हो सकती है। ओएमवी द्वारा प्रोटीन के योगदान का आकलन करने के लिए, 22प्रक्रिया में अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन चरणों को जोड़ा जाना चाहिए। इसके अलावा, सेल lysis के कारण extracellular अंतरिक्ष तक पहुँचने वाले प्रोटीन विभिन्न विकास चरणों में नमूने इकट्ठा करने और प्रतिकृति की संख्या में वृद्धि से पता लगाया जा सकता है.
जैसा कि ऊपर उल्लिखित है, चूंकि कई सायनोबैक्टीरियल उपभेदों अतिरिक्त कोशिकीय कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर (ईपीएस) का उत्पादन करते हैं, एक्सोप्रोटीम की तैयारी में उनकी संरचना में ईपीएस भी हो सकता है। निस्पंदन कदम अधिक जटिल और बड़े EPS बनाए रखना चाहिए, लेकिन सरल EPS अंश अंततः के माध्यम से पारित हो सकता है. नतीजतन, कार्बोहाइड्रेट की बड़ी मात्रा के साथ संदूषण एक्सोप्रोटओम विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। उदाहरण के लिए, इस संदूषण polyacrylamide जैल में प्रोटीन जुदाई में देरी का कारण हो सकता है, साथ ही मुखौटा कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन. बाह्य कोशिकीय माध्यम में मौजूद जैव अणुओं को दूषित करने के उद्देश्य से एक्सोप्रोटीओम अलगाव के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव किया गया है, लेकिन उन्हें बहुत ही चयनात्मक दिखाया गया है, जिससे बायसित एक्सोप्रोटओम प्रोफाइल13हो सकता है। दूसरी ओर, प्रोटीन की एक निश्चित राशि अधिक जटिल ईपीएस अंश में फंस सकता है अगर वे फिल्टर में फंस रहे हैं. इस मामले में, विभिन्न विकास चरणों/प्रयोगात्मक स्थितियों से एक्सोप्रोटओम तैयारी का विश्लेषण करने के साथ-साथ ईपीएस अंशों में प्रोटीन का विश्लेषण करने से फंसे प्रोटीन की पहचान करने में मदद मिल सकती है।
कुल मिलाकर, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल साइनोबैक्टीरियल के कुशल अलगाव के लिए महत्वपूर्ण चरणों का प्रतीक कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और एक्सोप्रोटोम्स जारी किया। सबसे महत्वपूर्ण बात, वे आसानी से विशिष्ट उपयोगकर्ता की जरूरत के अनुसार सिलवाया जा सकता है और अन्य जीवाणु उपभेदों शामिल हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम को प्रतिस्पर्धा 2020 के माध्यम से Fundo Europeu desenvolvimento क्षेत्रीय (FEDER) धन द्वारा वित्त पोषण किया गया था - प्रतिस्पर्धा और अंतर्राष्ट्रीयकरण के लिए संचालन कार्यक्रम (POCI), पुर्तगाल 2020, और एफसीटी के माध्यम से पुर्तगाली धन द्वारा - Funda$o पैरा एक Cincia ई परियोजना POCI-01-0145-FEDER-028779 और अनुदान SFRH/BD/99715/2014 (CF) के ढांचे में एक Tecnologia /
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
