Summary
Hier werden Protokolle zur Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und zur Isolierung ihrer Exoproteome beschrieben. Beide Verfahren verkörpern wichtige Schritte zur Gewinnung von Polymeren oder Proteinen mit hohen Reinheitsgraden, die für weitere Analysen oder Anwendungen verwendet werden können. Sie können auch einfach an die spezifischen Benutzerbedürfnisse angepasst werden.
Abstract
Cyanobakterien können aktiv eine Breite von Biomolekülen in die extrazelluläre Umgebung absondern, wie Heteropolysaccharide und Proteine. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Biomoleküle kann das Wissen über ihre Sekretionswege verbessern und helfen, sie zu manipulieren. Darüber hinaus sind einige dieser Biomoleküle auch im Hinblick auf biotechnologische Anwendungen interessant. Hier sind zwei Protokolle für eine einfache und schnelle Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen beschrieben. Das Verfahren zur Isolierung freigesetzter Kohlenhydratpolymere basiert auf konventionellen Fällungstechniken von Polysacchariden in wässrigen Lösungen mit organischen Lösungsmitteln. Dieses Verfahren bewahrt die Eigenschaften des Polymers und vermeidet gleichzeitig das Vorhandensein von Verunreinigungen aus Zellablagerungen und Kulturmedium. Am Ende des Prozesses ist das lyophilisierte Polymer einsatzbereit oder charakterisiert oder kann je nach Endverwendung weiteren Reinigungsrunden unterzogen werden. In Bezug auf die Isolierung des cyanobakteriellen Exproteoms basiert die Technik auf der Konzentration des zellfreien Mediums nach Entfernung der Hauptverunreinigungen durch Zentrifugation und Filtration. Diese Strategie ermöglicht eine zuverlässige Isolierung von Proteinen, die über Membrantransporter oder äußere Membranbläschen ins extrazelluläre Milieu gelangen. Diese Proteine können anschließend mit Standard-Massenspektrometrie-Techniken identifiziert werden. Die hier vorgestellten Protokolle können nicht nur auf eine breite Palette von Cyanobakterien angewendet werden, sondern auch auf andere Bakterienstämme. Darüber hinaus können diese Verfahren leicht auf die endgültige Verwendung der Produkte, den erforderlichen Reinheitsgrad und die Bakterienstämme zugeschnitten werden.
Introduction
Cyanobakterien sind weithin als produktive Quellen von Naturprodukten mit vielversprechenden biotechnologischen/biomedizinischen Anwendungen anerkannt. Daher sind das Verständnis von cyanobakteriellen Sekretionsmechanismen und die Optimierung der Extraktions-/Wiederherstellungsmethoden unerlässlich, um Cyanobakterien als effiziente mikrobielle Zellfabriken zu implementieren.
Viele cyanobakterielle Stämme sind in der Lage, extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) herzustellen, die hauptsächlich durch Heteropolysaccharide gebildet werden, die mit der Zelloberfläche assoziiert bleiben oder in das Medium1freigesetzt werden. Diese freigesetzten Kohlenhydratpolymere haben im Vergleich zu anderen Bakterien deutliche Eigenschaften, die sie für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. antivirale Mittel2, immunstimulierend3, Antioxidans4, Metall-Chelatierung5, emulgierend6, und Drogen-Liefermittel7,8). Die Methodik zur Isolierung dieser Polymere trägt nicht nur zu einer verbesserten Ausbeute bei, sondern auch zu erhöhter Reinheit und den spezifischen physikalischen Eigenschaften des erhaltenen Polymers9. Ein Großteil dieser Verfahren zur Isolierung der Polymere stützt sich auf Niederschlagsstrategien aus dem Kulturmedium, die aufgrund der starken anionischen Natur des Polymers leicht zu erreichen sind9,10. Darüber hinaus kann die Entfernung der im Niederschlagsschritt verwendeten Lösungsmittel durch Verdunstung und/oder Lyophilisierung schnell erreicht werden. Je nach vorgesehener Anwendung können verschiedene Schritte nach oder vor der Polymerfällung gekoppelt werden, um das Endprodukt zuzuschneiden, einschließlich Trichloressigsäure (TCA) Behandlung, Filtration oder Größenausschlusschromatographie (SEC) Säulenreinigung10.
Cyanobakterien sind auch in der Lage, eine breite Palette von Proteinen durch Wege abhängig von Membrantransportern (klassisch)11 oder vermittelt durch Vesikel (nicht-klassische)12zu sezernieren. Daher stellt die Analyse des cyanobakteriellen Exproteoms ein wesentliches Werkzeug dar, um sowohl cyanobakterielle Proteinsekretionsmechanismen zu verstehen/manipulieren als auch die spezifische extrazelluläre Funktion dieser Proteine zu verstehen. Zuverlässige Isolierung und Analyse von Exoproteomen erfordern die Konzentration des extrazellulären Milieus, da der Überfluss an abgesonderten Proteinen relativ gering ist. Darüber hinaus können andere physikalische oder chemische Schritte (z. B. Zentrifugation, Filtration oder Proteinfällung) die Qualität des erhaltenen Exoproteoms optimieren, den Proteingehalt13anreichern und das Vorhandensein von Verunreinigungen (z. B. Pigmente, Kohlenhydrate, etc.) 14 , 15 oder die Dominanz intrazellulärer Proteine in den Proben. Einige dieser Schritte können jedoch auch die Gruppe von Proteinen einschränken, die nachgewiesen werden können, was zu einer voreingenommenen Analyse führt.
Diese Arbeit beschreibt effiziente Protokolle zur Isolierung von freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Exoproteomen aus Cyanobakterien-Kulturmedien. Diese Protokolle können leicht an die spezifischen Ziele und Benutzerbedürfnisse der Studie angepasst werden, wobei die hier vorgestellten grundlegenden Schritte beibehalten werden.
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Protocol
1. Cyanobacterial freigesetzte Kohlenhydrat-Polymer-Isolierung
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Polymerisolierung und Entfernung von Verunreinigungen
- Kultivieren Sie den cyanobakteriellen Stamm unter Standardbedingungen [z. B. 30 °C unter einem 12-h-Licht (50 'E m'2s '1)/12 h dunkles Regime, mit Orbitalschütteln bei 150 U/min]. Messen Sie das Wachstum mit Standardprotokollen [z.B. optische Dichte bei 730 nm (OD730nm), Chlorophyll a, Trockengewicht, etc.], und messen Sie dann die Produktion von freigesetzten Polysacchariden nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode16.
- Übertragen Sie die Kultur in Dialysemembranen (12-14 kDa molekularer Abschaltung) und dialysieren Sie gegen mindestens 10 Volumina entionisiertes Wasser für 24 h unter kontinuierlichem Rühren.
HINWEIS: Je nach Deminlysevolumen und mittlerer Zusammensetzung kann es notwendig sein, das Dialysewasser zu ändern. - Zentrifugieren Sie die Kultur bei 15.000 x g für 15 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in eine neue Durchstechflasche und entsorgen Sie das Pellet (Zellen).
- Zentrifugieren Sie wieder bei 20.000 x g für 15 min bei 4 °C, um Verunreinigungen wie Zellwandablagerungen oder Lipopolysaccharide (LPS) zu entfernen.
- Den Überstand in ein Glasbecher geben und das Pellet entsorgen.
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Niederschlag des Polymers
- Fügen Sie dem Überstand 2 Volumina von 96 % Ethanol hinzu.
- Inkubieren Sie die Suspension bei 4 °C, mindestens über Nacht.
- Polymerrückgewinnung
- Für kleine oder nicht sichtbare Mengen ausgefälltem Polymer: Zentrifugieren Sie die Suspension bei 13.000 x g für 25 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml oder 2 ml autoklaviertem entionisiertem Wasser wieder auf. Übertragen Sie die wässrige Aufhängung auf eine Durchstechflasche.
VORSICHT: Der Überstand sollte sanft entsorgt werden, da er leicht wieder ausgesetzt werden kann. - Für sichtbare/große Mengen ausgefälltem Polymer: Sammeln Sie das ausgefällte Polymer mit sterilen Metallzangen zu einer Durchstechflasche. Drücken Sie das Polymer und entsorgen Sie das überschüssige Ethanol.
- Für kleine oder nicht sichtbare Mengen ausgefälltem Polymer: Zentrifugieren Sie die Suspension bei 13.000 x g für 25 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml oder 2 ml autoklaviertem entionisiertem Wasser wieder auf. Übertragen Sie die wässrige Aufhängung auf eine Durchstechflasche.
- Optional: Wiederholen Sie je nach dem erforderlichen Polymerreinigungsgrad den Niederschlagsschritt mit 96% Ethanol nach Resuspension der Polymere in entionisiertem Wasser.
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Lyophilisierung des Polymers
- Halten Sie die Durchstechflaschen mit dem gefällten Polymer mindestens über Nacht bei -80 °C.
- Das Polymer mindestens 48 h gefriertrocken (lyophilisieren) (die Suspension nicht vor dem Gefriertrocknen auftauen lassen).
- Das getrocknete Polymer bei Raumtemperatur (RT) bis zur weiteren Verwendung aufbewahren.
HINWEIS: Das Polymer in einem Trockentrockner zu lagern ist ratsam, da es Wasser im Laufe der Zeit aufnehmen kann.
2. Cyanobakterielle Exoproteom-Isolierung
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Mittlere Konzentration
- Cyanobakterien unter Standardbedingungen anbauen [z. B. 30 °C unter einem 12 h-Licht (50 x 2 s1)/12h dunkles Regime, mit Orbitalschütteln bei 150 U/min]. Überwachen Sie das Cyanobacterium-Wachstum mit Standardverfahren (z.B. OD730nm, Chlorophyll a, Trockengewicht, etc. ).
- Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 4.000 x g, für 10 min bei RT.
- Den Überstand in einen Kolben geben und das Zellpellet entsorgen.
- Filtern Sie das dekantierte Medium durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,2 m.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier für einen kurzen Zeitraum angehalten werden, wenn das Medium bei 4 °C gehalten wird. - Konzentrieren Sie das Medium ca. 500x (unter Berücksichtigung des Anfangsvolumens des gefilterten Mediums), wobei Zentrifugalkonzentratoren mit einem nominalen Molekulargewicht von 3 kDa verwendet werden. Die Zentrifugation sollte bei 4.000 x g (maximal 1 h pro Zentrifugation rund) bei 15 °C betrieben werden.
VORSICHT: Bei den meisten Konzentratormarken muss das Filtergerät vor Gebrauch durch Zentrifugation mit Reinstwasser geräuflt werden. Sobald der Filter nass ist, lassen Sie ihn nicht austrocknen. Lassen Sie genügend Flüssigkeit auf dem Reservoir, wenn das Gerät nicht verwendet wird.
HINWEIS: Die Reduzierung der Zentrifugationstemperatur auf 4 °C kann hilfreich sein, wenn das Ziel darin besteht, die Proteinaktivität zu untersuchen, obwohl dies die für die Probenkonzentration erforderliche Zeit erhöht. Das Protokoll kann zwischen Zentrifugationsschritten für kurze Zeiträume angehalten werden, wenn das Medium bei 4 °C gehalten wird. - Spülen Sie die Wände des Filtergeräte-Probenreservoirs mit der konzentrierten Probe und übertragen Sie den Inhalt in ein Mikrozentrifugenrohr.
- Führen Sie einen zusätzlichen Waschschritt des Filtergeräte-Probenreservoirs mit autoklavierten Kulturmedium durch, um eine maximale Exoproteom-Wiederherstellung zu gewährleisten.
HINWEIS: Um den Prozentsatz der Wiederherstellung zu quantifizieren, befolgen Sie die Anweisungen des jeweiligen Herstellers. - Die Exoproteomproben bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Die Zugabe von Proteasehemmern wird für die Langzeitlagerung empfohlen.
-
Analyse des Exproteoms
- Quantifizieren Sie den Proteingehalt durch BCA-Protein-Assay in 96-Well-Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Trennen Sie die Proteine durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung von Standard-Färbeprotokollen (z.B. Coomassie blau, Silberfärbung).
- Schneiden Sie die Bandbreiten/Gelbereiche von Interesse aus und sammeln Sie sie in verschiedenen Mikrozentrifugenrohren, die entsprechende Mengen an reinem reinem Wasser enthalten.
- Fahren Sie mit der Identifizierung und Analyse der Proteine durch Massenspektrometrie fort.
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Representative Results
Eine schematische Darstellung des beschriebenen Verfahrens zur Extraktion freigesetzter Kohlenhydratpolymere aus cyanobakteriellen Kulturen ist in Abbildung 1dargestellt. Gefällte Polymere des moderaten EPS-Herstellers Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 und des effizienten EPS-Herstellers Cyanothece sp. CCY 0110 sind in Abbildung 2dargestellt. In Abbildung 3sind lyophilisierte Polymere mit unterschiedlichen Kontaminationsgraden dargestellt, die die Bedeutung der Zentrifugationsschritte für die Endproduktreinheit hervorheben. Abbildung 4 zeigt die Isolationsmethode für das cyanobakterielle Exoproteom. In Abbildung 5sind unterschiedliche zellfreie mittelkonzentrierte Proben (d.h. aus Kulturen in verschiedenen Wachstumsphasen und aus einem cyanobakteriellen Stamm mit geringerer Carotinoidenproduktion) dargestellt. Exoproteomproben von zwei morphologisch unterschiedlichen cyanobakteriellen Stämmen, den einzelligen Cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803 und den fadenförmigen Cyanobakterien Anabaena sp. PCC 7120, getrennt durch SDS-PAGE, sind in Abbildung 6.
Abbildung 1 : Workflow zur Isolierung von cyanobacterial freigesetzte Kohlenhydratpolymere. Ausgehend von der cyanobakteriellen Kultur und der Entfernung von Verunreinigungen und endend mit Polymerisolation und Lyophilisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Cyanobakterielle Polymere nach dem Niederschlag. (A) Polymer des moderaten EPS-Herstellers Synechocystis sp. PCC 6803 an der Wand des Zentrifugenkolbens nach Niederschlag und Zentrifugation (Pfeile). (B) Polymerklumpen des effizienten EPS-Herstellers Cyanothece sp. CCY 0110, die nach dem Niederschlag im Glasbecher schwimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Lyophilisierte cyanobakterielle Polymere. (A) Drei unabhängige Chargen von Polymeren, die aus Synechocystis sp. PCC 6803 isoliert sind: ohne sichtbare Kontamination (AI)und mit Pigmentierung, die auf eine Kontamination mit Carotinoiden (AII) oder Zellablagerungen (AIII) hindeutet . (B) Lyophilisiertes Polymer aus Cyanothece sp. CCY 0110. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Workflow für cyanobakterielle Exoproteom-Isolierung. Von der zyanischen Kultur bis zur mittleren Trennung und Konzentration, die mit der Exoproteomanalyse endet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Mikrozentrifugenröhrchen mit konzentrierten zellfreien Mediumproben. (A) Konzentrierte mittlere Proben von Synechocystis sp. PCC 6803 Wildtyp, gesammelt bei verschiedenen OD730nm (0,5, 1 und 2). (B) Konzentrierte mittlere Probe aus Synechocystis , einem Mutanten mit eingeschränkter Carotinoide Produktion15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 : Coomassie blau gefärbte SDS-PAGE Gele, die die Proteine zeigen, die sich in cyanobakteriellem zellfreiem konzentriertem Medium angesammelt haben. (A) Exoproteom aus den einzelligen Cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803 Wildtyp unds sigF mutant. (B) Exoproteom von Synechocystis -sigF kontaminiert mit hohen Polysacchariden. (C) Exoproteom aus dem fadenförmigen Cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Um bakterielle Sekretionsmechanismen besser zu verstehen und die freigesetzten Produkte zu untersuchen, ist es von größter Bedeutung, die effiziente Isolierung und Analyse der Biomoleküle in der extrazellulären bakteriellen Umgebung (z. B. freigesetzte Kohlenhydratpolymere und Proteine).
Cyanobakterielle extrazelluläre Kohlenhydratpolymere sind extrem komplex, vor allem aufgrund der Anzahl und des Anteils verschiedener Monosaccharide, die ihre Zusammensetzung bilden1. Die herkömmlichen Verfahren zur Isolierung dieser polymeren Substanzen beruhen auf dem einfachen Konzept, dass diese zuckerreichen Stoffe in wässrigen Lösungen löslich sind und durch Zugabe organischer Lösungsmittel (wie Aceton oder Ethanol) ausgefällt werden können9 ,17,18. Dies geschieht aufgrund der Extraktion von Wassermolekülen aus den Hydratationsschalen der Polymere, und die Effizienz des Prozesses hängt untrennbar vom Molekulargewicht des Polymers (effizienter bei höheren Molekulargewichtsfraktionen), der chemischen Struktur und der Konzentration9,18. Neben dem Niederschlagsschritt umfasst die hier beschriebene Methode die kritischen Schritte der Dialyse und Zentrifugation. Die Dialyse entfernt effizient Salze und andere Verbindungen aus dem Medium, die nach der Lyophilisierung als pulverähnliche Strukturen auftreten können, während die Zentrifugationsschritte wichtige Verunreinigungen und Zellablagerungen entfernen.
Fehler während dieser Schritte können je nach Isolationscharge zu Polymeren mit hohen Kontaminationswerten und unterschiedlichen Eigenschaften führen. Einige Verunreinigungen können nach der Polymerlyophilisierung makroskopisch leicht erkannt werden, da sie die Polymerpigmentierung (in der Regel weiß oder hellbraun) verändern. Beispielsweise sind lyophilisierte Polymere, die grün oder orange sind, in der Regel stark mit Zellresten/Chlorophyll oder Carotinoiden kontaminiert. Dies hängt mit unzureichender Zeit oder g Kraft in Zentrifugationsschritten zusammen. Jedoch, einige cyanobakterielle Stämme können Pigmente freisetzen und sezernieren Proteine, die natürlich mit den Polymeren verbunden bleiben, und dies muss bei der Analyse des Endprodukts19berücksichtigt werden. Zusätzliche Schritte können hinzugefügt werden, um die Polymere weiter zu reinigen (z.B. TCA-Behandlungen)10. Diese Reinigungsschritte können jedoch auch negative Auswirkungen auf das Endprodukt haben, da das Entfernen von Proteinen und anderen Komponenten die Polymereigenschaften (z. B. Viskosität, Hydrophobie usw.) verändern kann. 1 , 20. Selbst die Wiederholung der Niederschlags-/Lyophilisierungsschritte kann sich negativ auf Polymere auswirken, vor allem aufgrund der Gefrierzyklen, die ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften leicht verändern21. Um die Polymerausbeute zu verbessern, können Heizbehandlungen vor dem Niederschlag auf ganze Kulturen angewendet werden. Dieser zusätzliche Schritt gibt das mit der Zelloberfläche assoziierte Polymer frei, kann aber auch zu einer Depolymerisation18,20führen. Zusammenfassend ist es wichtig zu beachten, dass die Wahl des Protokolls sowohl die Menge als auch die Qualität isolierter Polymere9,20beeinflussen wird.
In Bezug auf die im extrazellulären Milieu identifizierten cyanobakteriellen Proteine weisen sie eine breite Palette von Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten auf und können entweder löslich oder membranassoziiert sein. Diese Vielfalt physikalisch-chemischer Eigenschaften stellt ein Problem für die Auswahl der am besten geeigneten Methode zur Exoproteomisolation dar. Die hier vorgestellte Methode hängt stark von der Konzentration der Biomoleküle im extrazellulären Milieu ab. Diese Methode isoliert nicht nur Proteine, die in das Medium abgesondert werden, sondern auch Proteine, die in äußeren Membranvesiken (OMVs) vorhanden sind und aus der Zelllyse abgeleitet sind. Daher sollten Zentrifugationsschritte sanft durchgeführt werden, um Zellstörungen zu vermeiden, aber gleichzeitig OMVs zu sammeln. Bei cyanobakteriellen Stämmen, die effiziente OMVs-Produzenten sind, sind die Exoproteom-Präparate in der Regel orange aufgrund des Vorhandenseins von Carotinoiden, die mit diesen Lipidstrukturen verbunden sind14,15. Diese Funktion kann jedoch je nach cyanbacterialischer Dehnung und Wachstumsphase erheblich variieren. Um den Beitrag von Proteinen durch OMVs zu bewerten, sollten dem Verfahren22Ultrazentrifugationsschritte hinzugefügt werden. Darüber hinaus können Proteine, die durch Zelllyse den extrazellulären Raum erreichen, durch das Sammeln von Proben in verschiedenen Wachstumsphasen und die Erhöhung der Anzahl der Replikationen nachgewiesen werden.
Da viele cyanobakterielle Stämme extrazelluläre Kohlenhydratpolymere (EPS) produzieren, könnten die Exoproteompräparate auch EPS in ihrer Zusammensetzung haben. Der Filtrationsschritt sollte komplexere und größere EPS-Werte beibehalten, aber einfachere EPS-Fraktionen können schließlich passieren. Folglich kann eine Kontamination mit großen Mengen an Kohlenhydraten die Exoproteomanalyse beeinträchtigen. Beispielsweise kann diese Kontamination zu einer Verzögerung der Proteintrennung in Polyacrylamidgelen führen und weniger reichlich eitel Proteine maskieren. Es wurden alternative Protokolle für die Exoproteom-Isolierung vorgeschlagen, die darauf abzielen, kontaminierende Biomoleküle im extrazellulären Medium zu entfernen, aber sie haben sich als sehr selektiv erwiesen, was zu voreingenommenen Exoproteomprofilen führen kann13. Andererseits kann eine bestimmte Menge an Proteinen in komplexeren EPS-Fraktionen gefangen sein, wenn sie im Filter stecken. In diesem Fall kann die Analyse von Exoproteompräparaten aus verschiedenen Wachstumsphasen/experimentellen Bedingungen sowie die Analyse der Proteine in EPS-Fraktionen helfen, die eingeschlossenen Proteine zu identifizieren.
Insgesamt verkörpern die hier beschriebenen Protokolle die entscheidenden Schritte zur effizienten Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Exoproteomen. Am wichtigsten ist, sie können leicht auf spezifische Benutzerbedürfnisse zugeschnitten werden und andere Bakterienstämme enthalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde aus Fondso Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) Mitteln über das COMPETE 2020 - Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal 2020, und aus portugiesischen Fonds über FCT - Fundaéo para a Ciéncia e finanziert. ein Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior im Rahmen des Projekts POCI-01-0145-FEDER-028779 und des Zuschusses SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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