Summary
这里描述了分离蓝藻释放的碳水化合物聚合物和分离其外蛋白酶的协议。这两种程序都体现了获得高纯度聚合物或蛋白质的关键步骤,可用于进一步分析或应用。它们也可以根据特定的用户需求轻松调整。
Abstract
蓝藻可以主动将多种生物分子分泌到细胞外环境中,如异质多糖和蛋白质。这些生物分子的鉴定和表征可以增进有关其分泌途径的知识,并有助于操纵它们。此外,其中一些生物分子在生物技术应用方面也很有趣。这里描述了两个协议,用于轻松和快速分离蓝藻释放的碳水化合物聚合物和蛋白质。释放的碳水化合物聚合物的分离方法基于使用有机溶剂在水溶液中多糖的传统沉淀技术。这种方法保留了聚合物的特性,同时避免了来自细胞碎片和培养基培养物的污染物的存在。在工艺结束时,冻干聚合物可供使用或定性,或可以进行进一步轮纯化,具体取决于最终预期用途。关于蓝藻外蛋白酶的分离,该技术基于通过离心和过滤去除主要污染物后无细胞介质的浓度。这种策略允许通过膜转运器或外膜囊泡可靠地分离通过细胞外环境的蛋白质。这些蛋白质随后可以使用标准质谱技术进行识别。这里提出的协议不仅适用于广泛的蓝藻,而且还适用于其他细菌菌株。此外,这些程序可以很容易地根据产品的最终用途、所需的纯度和细菌菌株进行定制。
Introduction
蓝藻被广泛认为是天然产品的丰富来源,具有广阔的生物技术/生物医学应用。因此,了解蓝藻分泌机制和优化提取/回收方法对于将蓝藻作为高效的微生物细胞工厂实施至关重要。
许多蓝藻菌株能够产生细胞外聚合物物质(EPS),主要由异聚糖形成,这些物质仍然与细胞表面相关或释放到介质1中。与其他细菌相比,这些释放的碳水化合物聚合物具有明显的特性,这使得它们适用于广泛的应用(例如,抗病毒药物2、免疫刺激3、抗氧化剂4、金属夹合5,乳化6,和药物输送剂7,8。分离这些聚合物的方法不仅有助于提高产量,而且有助于提高纯度,提高聚合物获得的具体物理特性。绝大多数这些方法分离聚合物依赖于沉淀策略从培养基,很容易完成由于聚合物的强烈电子性质9,10。此外,通过蒸发和/或冻干,可以迅速去除沉淀步骤中使用的溶剂。根据所预见的应用,在聚合物沉淀之后或之前可以耦合不同的步骤,以便定制最终产品,包括三氯乙酸 (TCA) 处理、过滤或尺寸排除色谱 (SEC)列净化10.
蓝藻也能够通过依赖膜输送器(经典)11或囊泡(非经典)12的通道分泌多种蛋白质。因此,分析蓝藻外蛋白体是了解/操纵蓝藻蛋白分泌机制和了解这些蛋白质的具体细胞外功能的重要工具。对外蛋白酶的可靠分离和分析需要细胞外环境的浓度,因为分泌蛋白质的丰度相对较低。此外,其他物理或化学步骤(例如离心、过滤或蛋白质沉淀)可以优化获得的外乳激素的质量,丰富蛋白质含量13,并避免污染物的存在(例如,色素、碳水化合物等)14,15或细胞内蛋白质在样本中的优势。然而,其中一些步骤也可能限制可以检测到的蛋白质集,从而导致有偏差的分析。
本作品描述了从蓝藻培养培养物中分离释放的碳水化合物聚合物和外丙酮的有效方案。这些协议可以很容易地适应研究的具体目标和用户需求,同时保持此处介绍的基本步骤。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 氰化物释放碳水化合物聚合物分离
-
聚合物分离和去除污染物
- 在标准条件下培养蓝藻菌株[例如,在 12 小时光 (50 μE m+ 2s+1) /12 h 暗方案下 30°C,在 150 rpm 下的轨道抖动]。使用标准方案测量生长(例如,730 nm (OD730nm)、叶绿素 a、干重等光学密度,然后根据苯酚-硫酸方法16测量释放多糖的产量。
- 将培养层转移到透析膜(分子量截止的12-14 kDa)中,对至少10卷脱离子水进行透析,持续搅拌24小时。
注:根据透析的培养量和介质成分,可能需要更换透析水。 - 在 4°C 下在 15,000 x g下将培养基离心 15 分钟。将上清液转移到新的小瓶,并丢弃颗粒(细胞)。
- 在 20,000 x g下在 4°C 下再次离心 15 分钟,以去除细胞壁碎屑或脂多糖 (LPS) 等污染物。
- 将上清液转移到玻璃烧杯中,然后丢弃颗粒。
-
聚合物的沉淀
- 将 2 卷 96% 乙醇添加到上清液中。
- 在4°C下孵育悬浮液,至少过夜。
- 聚合物回收
- 对于少量或不可见的沉淀聚合物:在 4°C 下将悬浮液在 13,000 x g下离心 25 分钟。丢弃上清液,将颗粒重新悬浮在 1 mL 或 2 mL 的灭菌脱离子水中。将水悬架转移到小瓶中。
注意:上清液应轻轻丢弃,因为它很容易重新悬浮。 - 对于可见/大量沉淀聚合物:将沉淀的聚合物与无菌金属钳子收集到小瓶中。挤压聚合物并丢弃多余的乙醇。
- 对于少量或不可见的沉淀聚合物:在 4°C 下将悬浮液在 13,000 x g下离心 25 分钟。丢弃上清液,将颗粒重新悬浮在 1 mL 或 2 mL 的灭菌脱离子水中。将水悬架转移到小瓶中。
- 可选:根据所需的聚合物纯化程度,在去离子水中重新悬浮聚合物后,用 96% 乙醇重复沉淀步骤。
-
聚合物的冻干
- 将沉淀聚合物的小瓶保持在-80°C,至少过夜。
- 冷冻干燥(冻干)聚合物至少48小时(不要让悬浮液在冷冻干燥前解冻)。
- 将干燥的聚合物储存在室温 (RT) 下,直到进一步使用。
注意:建议将聚合物存放在干燥器中,因为它可以随着时间的推移吸收水分。
2. 青氧杆菌外蛋白酶分离
-
中等浓度
- 在标准条件下培养蓝藻[例如,在12小时光(50μE m+2s +1)/12小时暗团下30°C,在150rpm下轨道晃动]。使用标准程序(例如,OD730nm、叶绿素a、干重等)监测氰球菌生长。
- 在 4,000 x g下离心培养物,在 RT 下 10 分钟。
- 将上清液转移到烧瓶中,并丢弃细胞颗粒。
- 通过 0.2 μm 孔径过滤器过滤变形介质。
注:如果介质保持在 4°C,则协议可以在这里暂停一小段时间。 - 使用标称分子量截止为 3 kDa 的离心集中器,将介质浓缩约 500x(考虑过滤介质的初始体积)。入离应在 4,000 x g(最大1 h% 离心圆)的 15°C 下操作。
注意:对于大多数集中器品牌,过滤器设备在使用前需要用超纯水离心冲洗。过滤器变湿后,不要让其干燥。不使用设备时,在储液罐上留有足够的液体。
注:如果目的是研究蛋白质活性,将离心温度降低至4°C可能会有所帮助,但会增加样品浓度所需的时间。如果介质保持在 4°C,则协议可以在离心步骤之间短暂暂停。 - 用浓缩样品冲洗过滤装置样品储液罐的壁,并将内容转移到微离心管中。
- 使用灭基培养基对过滤装置样品储液罐执行额外的洗涤步骤,以确保最大的外蛋白酶恢复。
注:要量化回收百分比,请按照特定制造商的说明进行操作。 - 将外蛋白酶样品储存在-20°C,直到进一步使用。
注:建议在长期储存中添加蛋白酶抑制剂。
-
外蛋白酶分析
- 根据制造商的说明,通过 96 孔板中的 BCA 蛋白质测定量量化蛋白质含量。
- 使用标准染色方案(例如,Coomassie 蓝色、银色染色)通过硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离蛋白质。
- 切出感兴趣的带/凝胶区域,并将其收集到含有适当体积超纯水的不同微离心管中。
- 通过质谱法对蛋白质进行鉴定和分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1描述了从蓝藻培养物中提取释放的碳水化合物聚合物的方法的原理图表示。图2显示了来自中度EPS生产商青霉素合成细胞的沉淀聚合物PCC 6803和高效EPS生产商Cyanothece sp.CCY 0110。 图3显示了不同程度污染的冻干聚合物,突出了离心步骤对最终产品纯度的重要性。图4描述了蓝藻外蛋白酶的隔离方法。图5显示了不同的无细胞介质浓缩样品(即从不同生长阶段的培养物和从类胡萝卜素产量较低的蓝藻菌株中获得的样品)。来自两个形态上截然不同的蓝藻菌株的外原体样本,即单细胞蓝藻合成囊素sp. PCC 6803 和由 SDS-PAGE 分离的丝状蓝藻Anabaena sp. PCC 7120,在图 6.
图 1: 用于隔离的工作流蓝藻释放碳水化合物聚合物。从蓝藻培养和污染物去除开始,以聚合物分离和冻干结束。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:沉淀后的青氧杆菌聚合物。(A)沉淀和离心(箭头)后,在离心机烧瓶壁上的中度EPS生产商Synechocystis sp.PCC 6803的聚合物。(B)沉淀后漂浮在玻璃烧杯中的高效 EPS 生产商Cyanothece sp. CCY 0110 的聚合物团。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:冻干青氧杆菌聚合物。(A) 从Synechocystis sp.PCC 6803分离的三个独立批次聚合物:无可见污染(AI),且色素沉着表明存在类胡萝卜素(AII)或细胞碎片(AIII)污染.(B)来自青基体细胞的冻干聚合物,CCY 0110。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4: 工作流蓝藻外蛋白酶分离。从蓝藻培养到中分离和浓缩,最后与外蛋白酶分析结束。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:微离心管,含有浓缩的无细胞介质样品。(A) 从Synechocystis sp. PCC 6803野生型集中的介质样品,以不同的OD 730nm(0.5、1和2)收集。(B)浓缩的中度样品来自Synechocystis +sigF,一种具有类胡萝卜素生产受损功能的突变体15。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6:库马西蓝染色SDS-PAGE凝胶,显示在无蓝细胞浓缩培养基中积累的蛋白质。(A)来自单细胞蓝藻的外蛋白酶,PCC 6803 野生型和+sigF突变体。(B) 来自Synechocystis的外蛋白酶-sigF被高浓度多糖污染。(C)从丝状青霉素Anabaena sp. PCC 7120 的外丙酮。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
为了更好地了解细菌分泌机制和研究已释放的产品,证明在细胞外细菌环境中(如释放)中存在的生物分子的有效分离和分析具有极其重要的意义。碳水化合物聚合物和蛋白质)。
青基体细胞外碳水化合物聚合物极其复杂,主要是由于构成其成分1的不同单糖的数量和比例。用于分离这些聚合物物质的传统方法依赖于一个简单的概念,即这些富含糖的物质可溶于水溶液中,可以通过添加有机溶剂(如丙酮或乙醇)沉淀9 ,17,18.这是由于从聚合物的水化壳中提取水分子,过程的效率本质上取决于聚合物的分子量(在较高的分子量分数下更有效率)、化学结构和浓度9,18。除了沉淀步骤外,本文介绍的方法还包括透析和离心的关键步骤。透析将有效地去除介质中的盐和其他化合物,这些化合物在冻干后可能表现为粉末状结构,而离心步骤将去除主要污染物和细胞碎片。
这些步骤中的故障可能导致聚合物具有高污染水平和不同特性,具体取决于隔离批次。聚合物冻干后,一些污染物很容易从宏观上检测出来,因为它们会改变聚合物色素沉着(通常是白色或浅棕色)。例如,绿色或橙色的冻干聚合物通常受到细胞碎片/叶绿素或类胡萝卜素的高度污染。这与离心步骤中的时间或g力不足有关。然而,一些蓝藻菌株可以释放色素和分泌蛋白质,保持自然与聚合物相关,这需要考虑在分析最终产品19。可以添加额外的步骤,以进一步净化聚合物(例如,TCA处理)10。然而,这些纯化步骤也可能对最终产品产生负面影响,因为去除蛋白质和其他成分可能会改变聚合物的特性(例如,粘度、疏水性等)。1,20.即使重复沉淀/冻干步骤也会对聚合物产生负面影响,这主要是由于冷冻解冻周期很容易改变其物理化学性质21。为了提高聚合物的产量,加热处理可以在沉淀前应用于整个培养物。这个额外的步骤释放与细胞表面相关的聚合物,但它也可能导致去聚合18,20。总之,重要的是要注意到,协议的选择将影响分离聚合物9,20的数量和质量。
对于在细胞外环境中识别的蓝藻蛋白,它们显示广泛的分子量和等电点,可以是可溶性的或膜相关的。这种物理化学特性的多样性是选择最适合外蛋白酶分离的方法的问题。这里介绍的方法在很大程度上取决于细胞外环境中生物分子的浓度。这种方法不仅分离出分泌到介质中的蛋白质,而且分离出外膜囊泡(OmVs)中的蛋白质,这些蛋白质来自细胞分裂。因此,应轻轻地执行离心步骤,以避免细胞中断,同时收集EPV。在高效OmVS生产商的蓝藻菌株中,由于存在与这些脂质结构14、15相关的类胡萝卜素,外蛋白酶制剂通常是橙色的。然而,此功能可能因蓝藻菌株和生长阶段而有很大差异。为了评估OmTV对蛋白质的贡献,应在程序22中加入超离心步骤。此外,通过收集不同生长阶段的样本并增加复制次数,可以检测出由于细胞分裂而到达细胞外空间的蛋白质。
如上所述,由于许多蓝藻菌株产生细胞外碳水化合物聚合物(EPS),外蛋白酶制剂在其组成中也可能具有EPS。过滤步骤应保留更复杂的大 EPS,但更简单的 EPS 分数最终可能通过。因此,大量碳水化合物的污染会干扰外蛋白酶分析。例如,这种污染可能导致聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分离延迟,以及掩盖不太丰富的蛋白质。外蛋白酶分离的替代方案已经提出,旨在去除存在于细胞外介质中的污染生物分子,但它们已被证明是非常选择性的,这可能导致偏置的外蛋白酶型13。另一方面,如果一定数量的蛋白质卡在过滤器中,可能会被困在更复杂的EPS分数中。在这种情况下,分析不同生长阶段/实验条件的外乳蛋白,以及EPS分数中的蛋白质分析,可能有助于识别被套的蛋白质。
总体而言,此处描述的协议体现了有效分离蓝藻释放的碳水化合物聚合物和外蛋白酶的关键步骤。最重要的是,它们可以很容易地根据特定的用户需求定制,并包括其他细菌菌株。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由欧洲发展基金会(FEDER)通过竞争-竞争力和国际化歌剧方案(POCI),葡萄牙2020年,葡萄牙基金通过FCT- 基金会资助a 在POCI-01-01-FEDER-028779项目框架内,在项目POCI-01-0145-FEDER-028779和赠款SFRH/BD/99715/2014(CF)中,技术技术/Ministério da Cióncia,Tecnologia e Ensino 高级版。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
