Summary
Här beskrivs protokoll för isolering av cyanobakterial som frigörs kolhydratpolymerer och isolering av deras exoproteomes. Båda procedurerna förkroppsligar viktiga steg för att få polymerer eller proteiner med hög renhetsgrad som kan användas för ytterligare analys eller tillämpningar. De kan också enkelt anpassas efter specifika användarbehov.
Abstract
Cyanobakterier kan aktivt utsöndra ett brett spektrum av biomolekyler i den extracellulära miljön, såsom heteropolysackarider och proteiner. Identifieringen och karakteriseringen av dessa biomolekyler kan förbättra kunskapen om deras utsöndringen vägar och hjälpa till att manipulera dem. Dessutom är några av dessa biomolekyler också intressanta när det gäller bioteknologiska tillämpningar. Här beskrivs två protokoll för enkel och snabb isolering av cyanobakterial utsläppt kolhydrat polymerer och proteiner. Metoden för isolering av frisläppt kolhydrat polymerer är baserad på konventionella nederbördstekniker av polysackarider i vattenlösningar med organiska lösningsmedel. Denna metod bevarar polymerens egenskaper och undviker samtidigt närvaron av föroreningar från Cellrester och odlingssubstrat. I slutet av processen, den frystorkade polymeren är redo att användas eller kännetecknas eller kan utsättas för ytterligare omgångar av rening, beroende på den slutliga avsedda användningen. När det gäller isoleringen av cyanobakterial exoproteome är tekniken baserad på koncentrationen av det cell fria mediet efter avlägsnande av de stora föroreningarna genom centrifugering och filtrering. Denna strategi möjliggör tillförlitlig isolering av proteiner som når den extracellulära miljö via membran transportörer eller yttre membran blåsor. Dessa proteiner kan därefter identifieras med hjälp av standardmasspektrometritekniker. De protokoll som presenteras här kan inte bara tillämpas på ett brett spektrum av cyanobakterier, utan även på andra bakteriestammar. Dessutom kan dessa förfaranden lätt anpassas efter den slutliga användningen av produkterna, renhetsgrad som krävs, och bakteriestam.
Introduction
Cyanobakterier är allmänt erkända som produktiva källor av naturliga produkter med lovande bioteknologiska/biomedicinska tillämpningar. Därför är det viktigt att förstå cyanobakteriala sekretionsmekanismer och optimering av utvinnings-och återvinningsmetoderna för att kunna implementera cyklo-terier som effektiva mikrobiella cell fabriker.
Många cyanobakterial stammar kan producera extracellulära polymera ämnen (EPS), huvudsakligen bildas av heteropolysackarider, som förblir associerade till cellytan eller släpps ut i mediet1. Dessa frigörs kolhydrat polymerer har distinkta funktioner jämfört med de från andra bakterier, som gör dem lämpliga för ett brett spektrum av tillämpningar (t. ex., antivirala läkemedel2, immunstimulerande3, antioxidant4, Metal-Kelating5, emulgering6, och Drug Delivery agenter7,8). Metod för isolering av dessa polymerer bidrar till stor del inte bara till förbättrad avkastning utan också till ökad renhet och de specifika fysikaliska egenskaperna hos den polymer som erhålls9. En stor majoritet av dessa metoder för isolering av polymererna förlitar sig på nederbördsstrategier från odlingsmediet som lätt kan åstadkommas på grund av polymerens starka anjonnatur9,10. Dessutom kan avlägsnande av lösningsmedel som används i nederbörden steg snabbt uppnås genom avdunstning och/eller frystorkade. Beroende på den planerade appliceringen kan olika steg kopplas antingen efter eller före polymernederbörd för att skräddarsy slutprodukten, som omfattar behandling med triklorättiksyra (TCA), filtrering eller kromatografi av storlek (SEC) kolumn rening10.
Cyanobakterier kan också utsöndra ett brett spektrum av proteiner genom vägar som är beroende av membran transportörer (klassisk)11 eller medieras av vesikler (icke-klassisk)12. Därför är analys av cyanobakterial exoproteome ett viktigt verktyg, både för att förstå/manipulera cyanobakterial proteinutsöndringen mekanismer och förstå den specifika extracellulära funktionen av dessa proteiner. Tillförlitlig isolering och analys av exoproteomes kräver koncentrationen av den extracellulära miljön, eftersom överflödet av utsöndras proteiner är relativt lågt. Dessutom kan andra fysikaliska eller kemiska steg (t. ex. centrifugering, filtrering eller protein nederbörd) optimera kvaliteten på det exoproteome som erhålls, berika proteinhalten13och undvika förekomst av föroreningar (t. ex. pigment, kolhydrater, etc.) fjorton , 15 eller dominans av intracellulära proteiner i proverna. Men vissa av dessa steg kan också begränsa den uppsättning proteiner som kan upptäckas, vilket leder till en partisk analys.
Detta arbete beskriver effektiva protokoll för isolering av utsläppt kolhydrat polymerer och exoproteomes från cyanobakterier odlingsmedier. Dessa protokoll kan lätt anpassas till studiens specifika mål och användarbehov, samtidigt som de grundläggande stegen som presenteras här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cyanobakterial släppt kolhydrat polymerisolering
-
Polymerisolering och avlägsnande av föroreningar
- Odla cyanobakterial stammen under standardförhållanden [t. ex., 30 ° c under en 12 h ljus (50 μE m− 2s− 1)/12 h mörk regim, med orbitalskakning vid 150 rpm]. Mät tillväxt med hjälp av standardprotokoll [t. ex. optisk densitet vid 730 nm (OD730nm), klorofyll a, torr-vikt, etc.] och mät sedan produktionen av frisläppt polysackarider enligt metoden för fenolsulfuric Acid16.
- Överföra kulturen till dialysmembran (12-14 kDa av molekylvikt cut-off) och dialyze mot minst 10 volymer avjoniserat vatten för 24 h med kontinuerlig omrörning.
Obs: beroende på volymen av kulturen för att dialyze och medium sammansättning, kan det vara nödvändigt att ändra dialys vatten. - Centrifugera kulturen vid 15 000 x g i 15 min vid 4 ° c. Överför supernatanten till en ny injektionsflaska och kassera pelleten (cellerna).
- Centrifugera igen vid 20 000 x g i 15 min vid 4 ° c för att avlägsna föroreningar som cell Väggs skräp eller lipopolysackarider (LPS).
- Överför supernatanten till en glasbägare och kassera pelleten.
-
Utfällning av polymeren
- Tillsätt 2 volymer 96% etanol till supernatanten.
- Inkubera suspensionen vid 4 ° c, åtminstone över en natt.
- Polymer återhämtning
- För små eller inte synliga mängder av utfälld polymer: Centrifugera suspensionen vid 13 000 x g i 25 minuter vid 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 1 mL eller 2 mL autoklaverat avjoniserat vatten. Överför vattensuspensionen till en injektionsflaska.
FÖRSIKTIGHET: supernatanten bör kasseras försiktigt, eftersom det kan bli lätt återsuspenderad. - För synliga/stora mängder av fälld polymer: samla den utfälld polymer med sterila metallpinpett till en injektionsflaska. Pressa polymeren och kassera överflödig etanol.
- För små eller inte synliga mängder av utfälld polymer: Centrifugera suspensionen vid 13 000 x g i 25 minuter vid 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 1 mL eller 2 mL autoklaverat avjoniserat vatten. Överför vattensuspensionen till en injektionsflaska.
- Tillval: beroende på graden av polymerrening krävs, upprepa nederbörden steg med 96% etanol efter resuspension av polymerer i avjoniserat vatten.
-
Frystorkade av polymeren
- Förvara injektionsflaskorna med den utfälld polymeren vid-80 ° c, åtminstone över natten.
- Frys-torr (frystorkad) polymeren i minst 48 h (låt inte fjädringen avfrostas före Frystorkning).
- Förvara den torkade polymeren i rumstemperatur (RT) tills den används ytterligare.
Anmärkning: förvaring av polymeren i en exsickator är tillrådligt, eftersom den kan absorbera vatten över tid.
2. isolering av cyanobakterial exoproteome
-
Medelhög koncentration
- Odla cyanobakterier under standardbetingelser [t. ex. 30 ° c under 12 h ljus (50 μE m− 2s− 1)/12 h mörk regim, med orbitalskakning vid 150 rpm]. Övervaka Cyanobakterium-tillväxten med hjälp av standardprocedurer (t. ex. OD730nm, klorofyll a, torrsubstans etc.).
- Centrifugera kulturerna vid 4 000 x g, i 10 minuter vid RT.
- Överför supernatanten till en kolv och kassera cellpelleten.
- Filtrera det dekanterade mediet genom ett porstorleks filter på 0,2 μm.
Obs: protokollet kan pausas här under en kort tidsperiod, om mediet hålls vid 4 ° c. - Koncentrera mediet cirka 500x (med tanke på den initiala volymen av filtrerat medium), med hjälp av centrifugalkoncentratorer med en nominell molekylvikt cut-off av 3 kDa. Centrifugering skall användas vid 4 000 x g (högst 1 h per centrifugeringsrunda) vid 15 ° c.
Försiktighet: för de flesta koncentratormärken måste filter anordningen sköljas genom centrifugering med ultrarent vatten före användning. När filtret är vått, låt det inte torka ut. Lämna tillräckligt med vätska på behållaren när enheten inte används.
Anmärkning: att minska centrifugeringstemperaturen till 4 ° c kan vara till hjälp om syftet är att studera protein aktivitet, även om det kommer att öka den tid som krävs för prov koncentrationen. Protokollet kan pausas mellan centrifugeringsstegen under korta tidsperioder om mediet hålls vid 4 ° c. - Skölj väggarna i provbehållaren för filterenheten med det koncentrerade provet och överför innehållet till ett microcentrifugerör.
- Utför ytterligare tvättsteg i filter enhetens provbehållare med autoklaverat odlingssubstrat för att säkerställa maximal exoproteome återhämtning.
Anmärkning: för att kvantifiera andelen återvinning, följ tillverkarens instruktioner. - Förvara exoproteome-proverna vid-20 ° c tills den används ytterligare.
Anmärkning: tillsats av proteashämmare rekommenderas för långtidsförvaring.
-
Analys av exoproteomen
- Kvantifiera proteinhalten genom BCA proteinanalys i 96-brunnen plattan enligt tillverkarens anvisningar.
- Separera proteinerna med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), med hjälp av standardfärg protokoll (t. ex. Coomassie Blue, silver färgning).
- Klipp ut banden/gel regioner av intresse och samla in dem i olika microcentrifug rör som innehåller lämpliga volymer av ultra-rent vatten.
- Fortsätt med identifiering och analys av proteinerna genom masspektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk framställning av den metod som beskrivs för att extrahera frisläppt kolhydrat polymerer från cyanobakteriala kulturer avbildas i figur 1. Utfälld polymerer från den måttliga EPS-producenten Cyanobakterie synechocystis SP. PCC 6803 och den effektiva EPS-producenten cyanothece SP. CCY 0110 visas i figur 2. I figur 3visas frystorkade polymerer med olika grader av kontamination som belyser vikten av centrifugeringsstegen för den slutliga produktens renhet. Figur 4 visar isolerings metoden för cyanobakterial exoproteome. Distinkta, cellfria, medel koncentrerade prover (dvs. erhållna från kulturer i olika tillväxtfaser och från en cyanobakterial stam med lägre karotenoidproduktion) visas i figur 5. Exoproteome prover från två morfologiskt distinkta cyanobakterial stammar, den encelliga cyanobakterier Synechocystis SP. pcc 6803 och trådformiga cyanobakterier Anabaena sp. PCC 7120, SEPARERADE med SDS-sida, visas i Figur 6.
Figur 1 : Arbetsflöde för isolering av cyanobakterial släppte kolhydrat polymerer. Från cyanobakterial kultur och avlägsnande av föroreningar och slutar med polymer isolering och frystorkade. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Cyanobakterial polymerer efter nederbörd. A polymer från den moderata EPS-producenten Synechocystis SP. PCC 6803 på centrifugerkolven efter nederbörd och centrifugering (pilar). B polymerklumpar från den effektiva EPS-producenten Cyanothece sp. CCY 0110 som flyter i glasbägaren efter nederbörden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Frystorkade cyanobakteriella polymerer. A) tre oberoende partier av polymerer som isolerats från Synechocystis SP. PCC 6803: utan synlig kontamination (AI)och med pigmentering som tyder på kontaminering med karotenoider (AII) eller cellfragment (AIII) . B) frystorkat polymer från Cyanothece sp. CCY 0110. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Arbetsflöde för cyanobakterial exoproteome-isolering. Från cyanobakterial kultur till medelhög separation och koncentration, som avslutas med exoproteome analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Mikrocentrifugrör med koncentrerade cell fria medelprover. A) koncentrerade medelprover från Synechocystis SP. PCC 6803 vildtyp, insamlade vid olika OD730nm (0,5, 1 och 2). (B) koncentrerat medium prov från Synechocystis ∆sigf, en mutant med nedsatt karotenoider produktion15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Coomassie blåfärgade SDS-Page geler som visar de proteiner som samlats i cyanobakterial cellfritt koncentrerat medium. (A) exoproteome från de encelliga cyanobakterier Synechocystis sp. PCC 6803 vildtyp och ∆sigf Mutant. (B) exoproteome från Synechocystis ∆sigf förorenat med höga halter av polysackarider. C) exoproteome från den trådformiga Cyanobakterium Anabaena sp. PCC 7120. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att bättre förstå bakteriella sekretionsmekanismer och studera de frisläppta produkterna, är det av yttersta vikt att demonstrera effektiv isolering och analys av biomolekyler som finns i den extracellulära bakteriella miljön (såsom utsläppt kolhydrat polymerer och proteiner).
Cyanobakterial extracellulära kolhydrat polymerer är extremt komplexa, främst på grund av antalet och andelen olika monosackarider som utgör deras sammansättning1. De konventionella metoder som används för isolering av dessa polymera ämnen förlitar sig på det enkla konceptet att dessa socker rika ämnen är lösliga i vattenlösningar och kan fällas genom tillsats av organiska lösningsmedel (t. ex. aceton eller etanol)9 ,17,18. Detta sker på grund av utvinning av vattenmolekyler från polymerernas vätskebalans skal, och effektiviteten i processen beror i sig på polymerens molekylvikt (effektivare vid högre molekylvikt fraktioner), kemisk struktur, och koncentrationen9,18. Förutom nederbörd steg, den metod som beskrivs här innehåller de kritiska stegen av dialys och centrifugering. Dialys kommer att effektivt ta bort salter och andra föreningar från mediet, som kan förekomma efter frystorkade som pulverliknande strukturer, medan centrifugering steg kommer att ta bort stora föroreningar och cellfragment.
Misslyckanden under dessa steg kan leda till polymerer med höga kontaminations nivåer och olika egenskaper, beroende på isolerings partiet. Vissa föroreningar kan lätt upptäckas makroskopiskt efter polymer lyophilization, eftersom de kommer att förändra polymerpigmentering (vanligen vit eller ljusbrun). Till exempel, frystorkade polymerer som är gröna eller orange är i allmänhet starkt förorenade med Cellrester/klorofyll eller karotenoider. Detta är relaterat till otillräcklig tid eller g kraft i centrifugeringssteg. Vissa cyanobakteriella stammar kan dock frigöra pigment och utsöndra proteiner som fortfarande är naturligt förknippade med polymererna, och detta måste beaktas vid analysen av slutprodukten19. Ytterligare åtgärder kan läggas till för att ytterligare rena polymererna (t. ex. TCA-behandlingar)10. Icke desto mindre kan dessa reningssteg också ha en negativ inverkan på slutprodukten, eftersom avlägsnande av proteiner och andra komponenter skulle kunna förändra polymeregenskaperna (t. ex. viskositet, hydrofobicitet, etc.) 1 , 20. även upprepa nederbörd/lyophilization steg kan negativt påverka polymerer, främst på grund av frys-upptinning cykler som lätt ändra sina fysikalisk-kemiska egenskaper21. För att förbättra polymeravkastningen kan värmebehandlingar appliceras på hela kulturer före nederbörden. Detta extra steg frigör polymeren i samband med cellytan, men det kan också leda till depolymerisation18,20. Sammanfattnings, det är viktigt att notera att valet av protokoll kommer att påverka både mängden och kvaliteten på isolerade polymerer9,20.
När det gäller de cyanobakteriella proteiner som identifierats i den extracellulära miljön visar de ett brett spektrum av molekylvikter och isoelektriska punkter och kan vara antingen lösliga eller membran-associerade. Denna mångfald av fysikalisk-kemiska egenskaper är ett problem vid urvalet av den lämpligaste metoden för isolering av exoproteome. Den metod som presenteras här beror mycket på koncentrationen av biomolekyler i den extracellulära miljön. Denna metod isolerar inte bara proteiner som utsöndras i mediet men också proteiner som finns i yttre membran blåsor (OMVs) och härrör från cell Lys. Därför bör centrifugering steg försiktigt utföras för att undvika cell störningar, men samtidigt samla OMVs. I cyanobakterial stammar som är effektiva omvs producenter, exoproteome preparat är vanligtvis orange på grund av närvaron av karotenoider i samband med dessa lipidic strukturer14,15. Emellertid, denna funktion kan variera avsevärt beroende på cyanobakterial stam och tillväxtfas. För att kunna bedöma proteiners bidrag med omvs bör ultracentrifugering-steg läggas till i förfarandet22. Dessutom kan proteiner som når det extracellulära utrymmet på grund av celllys upptäckas genom att samla in prover i olika tillväxtfaser och öka antalet replikat.
Som tidigare nämnts, eftersom många cyanobakterial stammar producera extracellulära kolhydrater polymerer (EPS), exoproteome preparat kan också ha EPS i sin sammansättning. Filtrerings steget bör behålla mer komplexa och stora EPS, men enklare EPS-fraktioner kan så småningom passera igenom. Därför kan kontaminering med stora mängder kolhydrater störa exoproteome-analys. Till exempel kan denna kontaminering orsaka en fördröjning av protein separation i polyakrylamidgeler, samt maskera mindre rikligt med proteiner. Alternativa protokoll har föreslagits för exoproteome-isolering som syftar till att avlägsna kontaminerande biomolekyler som finns i det extracellulära mediet, men de har visat sig vara mycket selektiva, vilket kan leda till vinklade exoproteomprofiler13. Å andra sidan kan en viss mängd proteiner fastna i mer komplexa EPS-fraktioner om de fastnar i filtret. I detta fall, analysera exoproteome preparat från olika tillväxtfaser/experimentella förhållanden samt analys av proteiner i EPS fraktioner kan hjälpa till att identifiera de anhållna proteiner.
Sammantaget är de protokoll som beskrivs här förkroppsliga de avgörande stegen för effektiv isolering av cyanobakterial släppt kolhydrat polymerer och exoproteomes. Viktigast av allt, de kan enkelt skräddarsys enligt specifika användarbehov och inkluderar andra bakteriestammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Fundo europeu de Desenvolvimento regional (FEDER) medel genom att konkurrera 2020-Operacional program för konkurrenskraft och internationalisering (POCI), Portugal 2020, och av portugisiska fonder genom FCT-Fundação para a Ciência e en Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino överlägsen inom ramen för projektet POCI-01-0145-FEDER-028779 och Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
