Summary
Ici, des protocoles pour l'isolement des polymères de glucides libérés de cyanobactérien et l'isolement de leurs exoprotémomes sont décrits. Les deux procédures incarnent des étapes clés pour obtenir des polymères ou des protéines avec des degrés de haute pureté qui peuvent être utilisés pour une analyse ou des applications plus approfondies. Ils peuvent également être facilement adaptés en fonction des besoins spécifiques de l'utilisateur.
Abstract
Les cyanobactéries peuvent sécréter activement un large éventail de biomolécules dans l'environnement extracellulaire, comme les hétéropolysaccharides et les protéines. L'identification et la caractérisation de ces biomolécules peuvent améliorer les connaissances sur leurs voies de sécrétion et aider à les manipuler. En outre, certaines de ces biomolécules sont également intéressantes en termes d'applications biotechnologiques. Décrit ici sont deux protocoles pour l'isolement facile et rapide des polymères et des protéines de hydrate de carbone libérés de cyanobacterial. La méthode d'isolement des polymères de glucides libérés est basée sur les techniques conventionnelles de précipitation des polysaccharides dans des solutions aqueuses utilisant des solvants organiques. Cette méthode préserve les caractéristiques du polymère et évite simultanément la présence de contaminants provenant des débris cellulaires et du milieu de culture. À la fin du processus, le polymère lyophilisé est prêt à être utilisé ou caractérisé ou peut être soumis à d'autres tours de purification, selon l'utilisation finale prévue. En ce qui concerne l'isolement de l'exoprotéome cyanobactérien, la technique est basée sur la concentration du milieu sans cellules après l'élimination des principaux contaminants par centrifugation et filtration. Cette stratégie permet un isolement fiable des protéines qui atteignent le milieu extracellulaire par l'intermédiaire de transporteurs membranaires ou de vésicules de membrane externe. Ces protéines peuvent être identifiées par la suite à l'aide de techniques standard de spectrométrie de masse. Les protocoles présentés ici peuvent être appliqués non seulement à un large éventail de cyanobactéries, mais aussi à d'autres souches bactériennes. En outre, ces procédures peuvent être facilement adaptées en fonction de l'utilisation finale des produits, degré de pureté requis, et souche bactérienne.
Introduction
Les cyanobactéries sont largement reconnues comme des sources prolifiques de produits naturels avec des applications biotechnologiques/biomédicales prometteuses. Par conséquent, la compréhension des mécanismes de sécrétion cyanobactérienne et l'optimisation des méthodes d'extraction/récupération sont essentielles pour mettre en œuvre des cyanobactéries en tant qu'usines efficaces de cellules microbiennes.
De nombreuses souches cyanobactériennes sont capables de produire des substances polymères extracellulaires (EPS), principalement formées par des hétéropolysaccharides, qui restent associées à la surface cellulaire ou sont libérées dans le milieu1. Ces polymères de glucides libérés ont des caractéristiques distinctes par rapport à ceux d'autres bactéries, qui les rendent appropriés pour un large éventail d'applications (par exemple, les antiviraux2, immunostimulatoire3, antioxydant4, métal-chéating5, émulsionnant6, et les agents de livraison de médicaments7,8). La méthodologie pour l'isolement de ces polymères contribue en grande partie non seulement à l'amélioration du rendement, mais aussi à l'augmentation de la pureté et les propriétés physiques spécifiques du polymère obtenu9. Une grande majorité de ces méthodes d'isolement des polymères s'appuient sur des stratégies de précipitation du milieu de culture qui sont facilement réalisées en raison de la forte nature anionique du polymère9,10. En outre, l'élimination des solvants utilisés dans l'étape de précipitation peut être rapidement réalisée par évaporation et/ou lyophilisation. Selon l'application prévue, différentes étapes peuvent être couplées après ou avant la précipitation de polymère afin d'adapter le produit final, qui incluent le traitement d'acide trichloroacétique (TCA), la filtration, ou la chromatographie d'exclusion de taille (SEC) la purification de colonne10.
Les cyanobactéries sont également capables de sécrétiser un large éventail de protéines à travers des voies dépendantes des transporteurs membranaires (classiques)11 ou médiées par des vésicules (non classiques)12. Par conséquent, l'analyse de l'exoprotéome cyanobactérien constitue un outil essentiel, à la fois pour comprendre / manipuler les mécanismes de sécrétion de protéines cyanobactériennes et de comprendre la fonction extracellulaire spécifique de ces protéines. L'isolement et l'analyse fiables des exoprotéméomes exigent la concentration du milieu extracellulaire, puisque l'abondance des protéines sécrétées est relativement faible. En outre, d'autres étapes physiques ou chimiques (p. ex. centrifugation, filtration ou précipitation sinique) peuvent optimiser la qualité de l'exoprotémome obtenu, enrichir la teneur en protéines13et éviter la présence de contaminants (p. ex., pigments, glucides, etc. ) 14 (en) , 15 ou la prédominance des protéines intracellulaires dans les échantillons. Cependant, certaines de ces étapes peuvent également restreindre l'ensemble de protéines qui peuvent être détectées, conduisant à une analyse biaisée.
Ce travail décrit des protocoles efficaces pour l'isolement des polymères et exoprotéomes de glucides libérés des médias de culture de cyanobactéries. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés aux objectifs spécifiques de l'étude et aux besoins des utilisateurs, tout en maintenant les étapes de base présentées ici.
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Protocol
1. Isolement de polymère de hydrate de carbone libéré de cyanobactérien
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Isolement des polymères et élimination des contaminants
- Cultiver la souche cyanobactérienne dans des conditions standard [p. ex., 30 oC sous une lumière de 12 h (50 e m2s1)/12 h de régime foncé, avec une secousse orbitale à 150 tr/min]. Mesurer la croissance à l'aide de protocoles standard [p. ex., densité optique à 730 nm (OD730nm),chlorophylle a, poids sec, etc.], puis mesurer la production de polysaccharides libérés selon la méthode de l'acide phénol-sulfurique16.
- Transférer la culture dans des membranes de dialyse (12-14 kDa de coupure de poids moléculaire) et dialyser contre un minimum de 10 volumes d'eau déionisée pendant 24 h avec une agitation continue.
REMARQUE : Selon le volume de culture à dialyser et à composer à moyen terme, il peut être nécessaire de changer l'eau de dialyse. - Centrifuger la culture à 15 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans une nouvelle fiole et jeter la pastille (cellules).
- Centrifugeuse à nouveau à 20 000 x g pendant 15 min à 4 oC pour éliminer les contaminants tels que les débris de la paroi cellulaire ou les lipopolysaccharides (LPS).
- Transférer le supernatant dans un bécher en verre et jeter la boulette.
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Précipitation du polymère
- Ajouter 2 volumes d'éthanol à 96 % au supernatant.
- Incuber la suspension à 4 oC, au moins toute la nuit.
- Récupération des polymères
- Pour les petites quantités ou non visibles de polymère précipité : centrifugeuse de la suspension à 13 000 x g pendant 25 min à 4 oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 1 ml ou 2 ml d'eau désionisée autoclaved. Transférer la suspension aqueuse sur une fiole.
CAUTION: Le supernatant doit être jeté doucement, car il peut devenir facilement suspendu. - Pour les quantités visibles/grandes de polymère précipité : ramassez le polymère précipité avec des forceps métalliques stériles à un flacon. Pressez le polymère et jetez l'excès d'éthanol.
- Pour les petites quantités ou non visibles de polymère précipité : centrifugeuse de la suspension à 13 000 x g pendant 25 min à 4 oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 1 ml ou 2 ml d'eau désionisée autoclaved. Transférer la suspension aqueuse sur une fiole.
- Facultatif : selon le degré de purification des polymères requis, répétez l'étape de précipitation avec 96 % d'éthanol après la résuspension des polymères dans l'eau déionisée.
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Lyophilisation du polymère
- Gardez les flacons avec le polymère précipité à -80 oC, au moins toute la nuit.
- Lyophiliser le polymère pendant au moins 48 h (ne laissez pas la suspension décongeler avant le lyophilisation).
- Conserver le polymère séché à température ambiante (RT) jusqu'à ce qu'il soit utilisé davantage.
REMARQUE : Il est conseillé de stocker le polymère dans un dessiccateur, car il peut absorber l'eau au fil du temps.
2. Isolement d'exoprotéome cyanobactérien
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Concentration moyenne
- Cultiver des cyanobactéries dans des conditions standard [p. ex., 30 oC sous une lumière de 12 h (50 e m2s1)/12 h de régime sombre, avec une secousse orbitale à 150 tr/min]. Surveiller la croissance du cyanobacterium à l'aide de procédures standard (p. ex.730 nmOD, chlorophylle a, poids sec, etc. ).
- Centrifugeles les cultures à 4 000 x g, pour 10 min à RT.
- Transférer le supernatant dans une fiole et jeter le granule de cellule.
- Filtrer le milieu décanté à l'intermédiaire d'un filtre de taille pore de 0,2 m.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici pendant une courte période de temps, si le milieu est maintenu à 4 oC. - Concentrez le milieu environ 500x (compte tenu du volume initial du milieu filtré), en utilisant des concentrateurs centrifuges avec une coupure de poids moléculaire nominale de 3 kDa. La centrifugation doit être opérée à 4 000 x g (maximum 1 h par centrifugation) à 15 oC.
CAUTION: Pour la majorité des marques de concentrateurs, le dispositif de filtre doit être rincé par centrifugation avec de l'eau ultrapure avant utilisation. Une fois que le filtre est mouillé, ne le laissez pas sécher. Laissez suffisamment de liquide sur le réservoir lorsque l'appareil n'est pas utilisé.
REMARQUE : La réduction de la température de centrifugation à 4 oC peut être utile si l'objectif est d'étudier l'activité protéique, bien qu'elle augmente le temps nécessaire à la concentration de l'échantillon. Le protocole peut être mis en pause entre les étapes de centrifugation pendant de courtes périodes de temps si le milieu est maintenu à 4 oC. - Rincer les parois du réservoir d'échantillon de l'appareil filtre avec l'échantillon concentré et transférer le contenu dans un tube de microcentrifuge.
- Effectuer une étape de lavage supplémentaire du réservoir d'échantillon de dispositif de filtre avec le milieu de culture autoclaved pour assurer la récupération maximale d'exoprotémome.
REMARQUE : Pour quantifier le pourcentage de récupération, suivez les instructions du fabricant spécifique. - Conserver les échantillons d'exoprotémome à -20 oC jusqu'à ce qu'ils soient utilisés davantage.
REMARQUE : L'ajout d'inhibiteurs de la protéase est recommandé pour le stockage à long terme.
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Analyse de l'exoprotéome
- Quantifier la teneur en protéines par l'analyse des protéines BCA dans une assiette de 96 puits selon les instructions du fabricant.
- Séparez les protéines par l'électrophores gel de sulfate-polyacrylamide de dodecyl de sodium (SDS-PAGE), en utilisant des protocoles de coloration standard (p. ex., bleu Coomassie, coloration argentée).
- Découpez les bandes/gel régions d'intérêt et collectez-les dans différents tubes de microcentrifuge contenant des volumes appropriés d'eau ultra-pure.
- Procéder à l'identification et à l'analyse des protéines par spectrométrie de masse.
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Representative Results
Une représentation schématique de la méthode décrite pour extraire les polymères de glucides libérés des cultures cyanobactériennes est représentée dans la figure 1. Les polymères précipités du producteur modéré d'EPS cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 et l'efficace producteur d'EPS Cyanothece sp. CCY 0110 sont présentés à la figure 2. Dans la figure 3, les polymères lyophilisés avec différents degrés de contamination sont montrés, soulignant l'importance des étapes de centrifugation pour la pureté finale du produit. La figure 4 représente la méthode d'isolement de l'exoprotéome cyanobactérien. Des échantillons concentrés de milieu sans cellules distincts (c.-à-d. obtenus à partir de cultures dans différentes phases de croissance et d'une souche cyanobactérienne avec une production caroténoïde inférieure) sont montrés dans la figure 5. Des échantillons d'exoprotéome de deux souches cyanobactériennes morphologiquement distinctes, les cyanobactéries unicellulaires Synechocystis sp. PCC 6803 et les cyanobactéries filamenteuses Anabaena sp. PCC 7120, séparés par SDS-PAGE, sont montrés dans Figure 6.
Figure 1 : Flux de travail pour l'isolement des polymères de glucides libérés cyanobactériens. À partir de la culture cyanobactérienne et l'élimination des contaminants et se terminant par l'isolement des polymères et la lyophilisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Polymères cyanobactériens après précipitation. (A) Polymère du producteur modéré d'EPS Synechocystis sp. PCC 6803 sur la paroi du flacon de centrifugeuse après précipitation et centrifugation (flèches). (B) Des amas de polymères provenant de l'efficace producteur d'EPS Cyanothece sp. CCY 0110 flottant dans le bécher de verre après les précipitations. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Polymères cyanobactériens lyophilisés. (A) Trois lots indépendants de polymères isolés de Synechocystis sp. PCC 6803 : sans contamination visible (IA), et avec pigmentation indicatif de contamination par des caroténoïdes (AII) ou des débris cellulaires (AIII) . (B) Polymère lyophilisé de Cyanothece sp. CCY 0110. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Flux de travail pour isolement exoprotéome cyanobactérien. De la culture cyanobactérienne à la séparation et à la concentration moyennes, se terminant par l'analyse de l'exoprotémomie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Tubes microcentrifuges avec des échantillons moyens concentrés sans cellules. (A) Échantillons moyens concentrés de Synechocystis sp. PCC 6803 de type sauvage, recueillis à différents OD730nm (0,5, 1 et 2). (B) Échantillon moyen concentré de Synechocystis -sigF, un mutant avec la production altérée de caroténoïdes15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Gels SDS-PAGE teintés de bleu Coomassie montrant les protéines accumulées dans le milieu concentré sans cellules cyanobactériennes. (A) Exoprotéome de la cyanobacteria unicellulaire Synechocystis sp. PCC 6803 sauvage-type etmutant de sigF. (B) Exoprotéome de Synechocystis etsigF contaminé par des niveaux élevés de polysaccharides. (C) Exoprotéome du cyanobacterium filamenteux Anabaena sp. PCC 7120. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Pour mieux comprendre les mécanismes de sécrétion bactérienne et étudier les produits libérés, il est d'une extrême importance de démontrer l'isolement efficace et l'analyse des biomolécules présentes dans l'environnement bactérien extracellulaire (tels que libérés polymères et protéines).
Les polymères de glucides extracellulaires cyanobactériens sont extrêmement complexes, principalement en raison du nombre et de la proportion de différents monosaccharides qui constituent leur composition1. Les méthodes conventionnelles utilisées pour isoler ces substances polymères reposent sur le concept simple que ces substances riches en sucre sont solubles dans des solutions aqueuses et peuvent être précipitées par l'ajout de solvants organiques (comme l'acétone ou l'éthanol)9 ,17,18. Cela se produit en raison de l'extraction de molécules d'eau à partir des coquilles d'hydratation des polymères, et l'efficacité du processus dépend intrinsèquement du poids moléculaire du polymère (plus efficace à des fractions de poids moléculaire plus élevé), la structure chimique, et concentration9,18. En plus de l'étape de précipitation, la méthode décrite ici inclut les étapes critiques de la dialyse et de la centrifugation. La dialyse éliminera efficacement les sels et autres composés du milieu, qui peuvent apparaître après la lyophilisation comme des structures semblables à de la poudre, tandis que les étapes de centrifugation élimineront les contaminants majeurs et les débris cellulaires.
Les défaillances au cours de ces étapes peuvent conduire à des polymères avec des niveaux de contamination élevés et des caractéristiques différentes, selon le lot d'isolement. Certaines contaminations peuvent être facilement détectées macroscopiquement après la lyophilisation des polymères, car elles modifieront la pigmentation des polymères (généralement blanc ou brun clair). Par exemple, les polymères lyophilisés qui sont verts ou oranges sont généralement fortement contaminés par des débris de cellules/chlorophylle ou des caroténoïdes. Ceci est lié au temps insuffisant ou à la force g dans les étapes de centrifugation. Cependant, certaines souches cyanobactériennes peuvent libérer des pigments et sécréder des protéines qui restent naturellement associées aux polymères, et cela doit être pris en considération lors de l'analyse du produit final19. Des étapes supplémentaires peuvent être ajoutées pour purifier davantage les polymères (p. ex., les traitements TCA)10. Néanmoins, ces mesures de purification pourraient également avoir un impact négatif sur le produit final, car l'élimination des protéines et d'autres composants peut modifier les propriétés des polymères (p. ex., viscosité, hydrophobicité, etc.) 1 Fois , 20. Même en répétant les étapes de précipitation/lyophilisation peut affecter négativement les polymères, principalement en raison des cycles de gel-dégel qui modifient facilement leurs propriétés physicochimiques21. Pour améliorer les rendements en polymères, les traitements de chauffage peuvent être appliqués à des cultures entières avant les précipitations. Cette étape supplémentaire libère le polymère associé à la surface cellulaire, mais elle peut également conduire à la dépolymérisation18,20. En résumé, il est important de noter que le choix du protocole influencera à la fois la quantité et la qualité des polymères isolés9,20.
En ce qui concerne les protéines cyanobactériennes identifiées dans le milieu extracellulaire, elles présentent un large éventail de poids moléculaires et de points isoélectriques et peuvent être solubles ou associées à la membrane. Cette diversité de propriétés physicochimiques représente un problème pour le choix de la méthode la plus appropriée pour l'isolement de l'exoprotémome. La méthode présentée ici dépend fortement de la concentration des biomolécules dans le milieu extracellulaire. Cette méthode isole non seulement les protéines qui sont sécrétées dans le milieu, mais aussi les protéines présentes dans les vésicules de la membrane externe (OMV) et dérivées de la lyse cellulaire. Par conséquent, les étapes de centrifugation doivent être effectuées en douceur afin d'éviter les perturbations cellulaires, mais en même temps recueillir les OMV. Dans les souches cyanobactériennes qui sont des producteurs efficaces omVs, les préparations d'exoprotémome sont généralement orange en raison de la présence de caroténoïdes associés à ces structures lipidiques14,15. Cependant, cette caractéristique peut varier considérablement en fonction de la souche cyanobactérienne et de la phase de croissance. Afin d'évaluer la contribution des protéines par les OMV, des étapes d'ultracentrifugation doivent être ajoutées à la procédure22. En outre, les protéines qui atteignent l'espace extracellulaire en raison de la lyse cellulaire peuvent être détectées en recueillant des échantillons dans différentes phases de croissance et en augmentant le nombre de répliques.
Comme mentionné ci-dessus, puisque de nombreuses souches cyanobactériennes produisent des polymères de glucides extracellulaires (EPS), les préparations d'exoprotéome pourraient également avoir EPS dans leur composition. L'étape de filtration devrait conserver un BPA plus complexe et plus important, mais des fractions d'EPS plus simples pourraient éventuellement passer. Par conséquent, la contamination par de grandes quantités de glucides peut interférer avec l'analyse de l'exoprotémome. Par exemple, cette contamination peut entraîner un retard dans la séparation des protéines dans les gels de polyacrylamide, ainsi que masquer des protéines moins abondantes. Des protocoles alternatifs ont été proposés pour l'isolement de l'exoprotémome visant à éliminer les biomolécules contaminantes présentes dans le milieu extracellulaire, mais il a été démontré qu'elles étaient très sélectives, ce qui peut conduire à des profils biaisés d'exoprotémomique13. D'autre part, une certaine quantité de protéines peut être piégée dans des fractions D'EPS plus complexes si elles sont coincées dans le filtre. Dans ce cas, l'analyse des préparations d'exoprotémome de différentes phases de croissance/conditions expérimentales ainsi que l'analyse des protéines dans les fractions d'EPS peuvent aider à identifier les protéines piégées.
Dans l'ensemble, les protocoles décrits ici incarnent les étapes cruciales pour un isolement efficace des polymères et exoprotéomes de glucides libérés de cyanobactérien. Plus important encore, ils peuvent être facilement adaptés en fonction des besoins spécifiques de l'utilisateur et inclure d'autres souches bactériennes.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par les fonds fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) par le biais du PROGRAMME competecional pour la compétitivité et l'internationalisation (POCI), Portugal 2020, et par des fonds portugais par l'intermédiaire de la FCT - Fundaço para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior dans le cadre du projet POCI-01-0145-FEDER-028779 et de la subvention SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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