Summary
Aquí, se describen los protocolos para el aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados por cianobacterias y el aislamiento de sus exoproteomes. Ambos procedimientos incorporan pasos clave para obtener polímeros o proteínas con grados de alta pureza que se pueden utilizar para análisis o aplicaciones adicionales. También se pueden adaptar fácilmente según las necesidades específicas del usuario.
Abstract
Las cianobacterias pueden secretar activamente una amplia gama de biomoléculas en el entorno extracelular, como los heteropolisacáridos y las proteínas. La identificación y caracterización de estas biomoléculas puede mejorar el conocimiento sobre sus vías de secreción y ayudar a manipularlas. Además, algunas de estas biomoléculas también son interesantes en términos de aplicaciones biotecnológicas. Aquí se describen dos protocolos para el aislamiento fácil y rápido de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados por cianobacterias. El método de aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados se basa en técnicas convencionales de precipitación de polisacáridos en soluciones acuosas utilizando disolventes orgánicos. Este método preserva las características del polímero y al mismo tiempo evita la presencia de contaminantes de los desechos celulares y el medio de cultivo. Al final del proceso, el polímero liofilizado está listo para ser utilizado o caracterizado o puede ser sometido a más rondas de purificación, dependiendo del uso final previsto. En cuanto al aislamiento del exoproteoma cianobacteriano, la técnica se basa en la concentración del medio libre de células después de la eliminación de los principales contaminantes por centrifugación y filtración. Esta estrategia permite un aislamiento fiable de las proteínas que alcanzan el medio extracelular a través de transportadores de membrana o vesículas de membrana externa. Estas proteínas se pueden identificar posteriormente utilizando técnicas estándar de espectrometría de masas. Los protocolos presentados aquí se pueden aplicar no sólo a una amplia gama de cianobacterias, sino también a otras cepas bacterianas. Además, estos procedimientos se pueden adaptar fácilmente según el uso final de los productos, el grado de pureza requerido y la cepa bacteriana.
Introduction
Las cianobacterias son ampliamente reconocidas como fuentes prolíficas de productos naturales con aplicaciones biotecnológicas/biomédicas prometedoras. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de secreción cianobacteriana y la optimización de los métodos de extracción/recuperación son esenciales para implementar cianobacterias como fábricas de células microbianas eficientes.
Muchas cepas cianobacterianas son capaces de producir sustancias poliméricas extracelulares (EPS), formadas principalmente porheteropolisacáridos, que permanecen asociadas a la superficie celular o se liberan en el medio 1. Estos polímeros de carbohidratos liberados tienen características distintas en comparación con los de otras bacterias, que los hacen adecuados para una amplia gama de aplicaciones (por ejemplo, antivirales2, inmunoestimuladores3, antioxidante4, metal-quelating5, emulsionando6, y agentes de administración de drogas7,8). La metodología para el aislamiento de estos polímeros contribuye en gran medida no sólo a la mejora del rendimiento, sino también al aumento de la pureza y las propiedades físicas específicas del polímero obtenido9. La gran mayoría de estos métodos para el aislamiento de los polímeros se basan en estrategias de precipitación del medio de cultivo que se logran fácilmente debido a la fuerte naturaleza aniónica del polímero9,10. Además, la eliminación de los disolventes utilizados en el paso de precipitación se puede lograr rápidamente por evaporación y/o liofilización. Dependiendo de la aplicación prevista, se pueden acoplar diferentes pasos después o antes de la precipitación de polímeros para adaptar el producto final, que incluyen el tratamiento del ácido tricloroacético (TCA), filtración o cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) purificación de columnas10.
Las cianobacterias también son capaces de secretar una amplia gama de proteínas a través de vías dependientes de transportadores de membrana (clásicos)11 o mediadas por vesículas (no clásicas)12. Por lo tanto, el análisis del exoproteome cianobacteriano constituye una herramienta esencial, tanto para entender/manipular los mecanismos de secreción de proteínas cianobacterianas como para comprender la función extracelular específica de estas proteínas. El aislamiento y análisis fiables de los exoproteomes requieren la concentración del entorno extracelular, ya que la abundancia de proteínas secretadas es relativamente baja. Además, otras etapas físicas o químicas (por ejemplo, centrifugación, filtración o precipitación proteica) pueden optimizar la calidad del exproteome obtenido, enriqueciendo el contenido proteico13y evitando la presencia de contaminantes (por ejemplo, pigmentos, carbohidratos, etc.) 14 , 15 o el predominio de proteínas intracelulares en las muestras. Sin embargo, algunos de estos pasos también pueden restringir el conjunto de proteínas que se pueden detectar, lo que conduce a un análisis sesgado.
Este trabajo describe protocolos eficientes para el aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados y exoproteomes de medios de cultivo de cianobacterias. Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente a los objetivos específicos del estudio y a las necesidades del usuario, manteniendo al mismo tiempo los pasos básicos que se presentan aquí.
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Protocol
1. Aislamiento de polímero de carbohidratos liberado por cianobacteria
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Aislamiento de polímeros y eliminación de contaminantes
- Cultivar la cepa cianobacteriana en condiciones estándar [p. ej., 30 oC bajo una luz de 12 h (50 oEm s 2s x1) /12 h de régimen oscuro, con temblor orbital a 150 rpm]. Mida el crecimiento utilizando protocolos estándar [por ejemplo, densidad óptica a 730 nm (OD730nm),clorofila a, peso seco, etc.], luego mida la producción de polisacáridos liberados según el método de ácido fenol-sulfúrico16.
- Transfiera el cultivo a membranas de diálisis (12-14 kDa de corte de peso molecular) y dializar contra un mínimo de 10 volúmenes de agua desionizada durante 24 horas con agitación continua.
NOTA: Dependiendo del volumen de cultivo para dializar y la composición media, puede ser necesario cambiar el agua de diálisis. - Centrifugar el cultivo a 15.000 x g durante 15 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un vial nuevo y deseche el pellet (células).
- Centrifugar de nuevo a 20.000 x g durante 15 minutos a 4 oC para eliminar contaminantes como los desechos de la pared celular o lipopolisacáridos (LPS).
- Transfiera el sobrenadante a un vaso de vidrio y deseche el pellet.
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Precipitación del polímero
- Añadir 2 volúmenes de 96% de etanol al sobrenadante.
- Incubar la suspensión a 4oC, al menos durante la noche.
- Recuperación de polímeros
- Para cantidades pequeñas o no visibles de polímero precipitado: centrifugar la suspensión a 13.000 x g durante 25 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml o 2 ml de agua desionizada autoclave. Transfiera la suspensión acuosa a un vial.
ADVERTENCIA: El sobrenadante debe desecharse suavemente, ya que puede volverse fácilmente resuspendido. - Para cantidades visibles/grandes de polímero precipitado: recoger el polímero precipitado con fórceps metálicos estériles a un vial. Apriete el polímero y deseche el exceso de etanol.
- Para cantidades pequeñas o no visibles de polímero precipitado: centrifugar la suspensión a 13.000 x g durante 25 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml o 2 ml de agua desionizada autoclave. Transfiera la suspensión acuosa a un vial.
- Opcional: dependiendo del grado de purificación de polímeros requerido, repita el paso de precipitación con 96% de etanol después de la resuspensión de los polímeros en agua desionizada.
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Liofilización del polímero
- Conservar los viales con el polímero precipitado a -80 oC, al menos durante la noche.
- Congelar congele (liofilizar) el polímero durante al menos 48 h (no deje que la suspensión se descongele antes de secarse con gelión).
- Almacene el polímero seco a temperatura ambiente (RT) hasta su uso posterior.
NOTA: Es aconsejable almacenar el polímero en un desecador, ya que puede absorber el agua con el tiempo.
2. Aislamiento de exoproteome cianobacteria
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Concentración media
- Cultivar las cianobacterias en condiciones estándar [p. ej., 30 oC bajo una luz de 12 h (50 oE ms 2sx 1s/12 h de régimen oscuro, con temblor orbital a 150 rpm]. Controlar el crecimiento de la cianobacterium mediante procedimientos estándar (p. ej., OD730nm, clorofila a , peso seco, etc.).
- Centrifugar los cultivos a 4.000 x g, durante 10 min a RT.
- Transfiera el sobrenadante a un matraz y deseche el pellet celular.
- Filtrar el medio decantado a través de un filtro de tamaño de poro de 0,2 m.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí durante un breve período de tiempo, si el medio se mantiene a 4 oC. - Concentrar el medio aproximadamente 500x (considerando el volumen inicial del medio filtrado), utilizando concentradores centrífugos con un corte de peso molecular nominal de 3 kDa. La centrifugación debe funcionar a 4.000 x g (ronda máxima de 1 h de centrifugación) a 15 oC.
ADVERTENCIA: Para la mayoría de las marcas concentradoras, el dispositivo de filtro debe enjuagarse centrifugando con agua ultrapura antes de su uso. Una vez que el filtro esté mojado, no deje que se seque. Deje suficiente líquido en el depósito cuando el dispositivo no esté siendo utilizado.
NOTA: Reducir la temperatura de centrifugación a 4 oC puede ser útil si el objetivo es estudiar la actividad proteica, aunque aumentará el tiempo necesario para la concentración de la muestra. El protocolo se puede pausar entre pasos de centrifugación durante períodos de tiempo cortos si el medio se mantiene a 4 oC. - Enjuague las paredes del depósito de muestra sorma con la muestra concentrada y transfiera el contenido a un tubo de microcentrífuga.
- Realice un paso de lavado adicional del depósito de muestra del dispositivo de filtro con medio de cultivo autoclave para garantizar la máxima recuperación del exproteome.
NOTA: Para cuantificar el porcentaje de recuperación, siga las instrucciones específicas del fabricante. - Almacene las muestras de exoproteome a -20 oC hasta su uso posterior.
NOTA: Se recomienda la adición de inhibidores de la proteasa para el almacenamiento a largo plazo.
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Análisis del exoproteome
- Cuantifique el contenido de proteínas mediante el ensayo de proteínas BCA en una placa de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Separe las proteínas por electroforesis de gel de dodecilo-poliacrilamida sódica (SDS-PAGE), utilizando protocolos de tinción estándar (por ejemplo, azul coomassie, tinción de plata).
- Corte las bandas/regiones de gel de interés y recójalas en diferentes tubos de microcentrífuga que contengan volúmenes adecuados de agua ultrapura.
- Proceder con la identificación y análisis de las proteínas por espectrometría de masas.
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Representative Results
En la Figura 1se muestra una representación esquemática del método descrito para extraer polímeros de carbohidratos liberados de cultivos cianobacterianos. Los polímeros precipitados del productor moderado de EPS cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 y el eficiente productor de EPS Cyanothece sp. En la Figura3, se muestran polímeros liofilizados con diferentes grados de contaminación, destacando la importancia de los pasos de centrifugación para la pureza final del producto. La Figura 4 representa el método de aislamiento del exoproteome cianobacteriano. En la Figura 5se muestran distintas muestras concentradas de medios libres de células (es decir, obtenidas de cultivos en diferentes fases de crecimiento y de una cepa cianobacteriana con menor producción de carotenoides). Muestras de exoproteome de dos cepas cianobacterianas morfológicamente distintas, las cianobacterias unicelulares Synechocystis sp. PCC 6803 y las cianobacterias filamentosas Anabaena sp. PCC 7120, separadas por SDS-PAGE, se muestran en Figura 6.
Figura 1 : Flujo de trabajo para el aislamiento de poliméricos liberados por cianobacterias. Comenzando por el cultivo cianobacteriano y la eliminación de contaminantes y terminando con aislamiento de polímeros y liofilización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Polímeros cianobacterianos después de la precipitación. (A) Polímero del productor moderado de EPS Synechocystis sp. PCC 6803 en la pared del matraz de centrífuga después de la precipitación y centrifugación (flechas). (B) Los grumos de polímeros del eficiente productor de EPS Cyanothece sp. CCY 0110 flotando en el vaso de precipitados después de la precipitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Polímeros cianobacterianos liofilizados. (A) Tres lotes independientes de polímeros aislados de Synechocystis sp. PCC 6803: sin contaminación visible (AI)y con pigmentación indicativa de contaminación con carotenoides (AII) o desechos celulares (AIII) . (B) Polímero liofilizado de Cyanothece sp. CCY 0110. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Flujo de trabajo para aislamiento de exoproteome cianobacteria. Desde el cultivo cianobacteriano hasta la separación y concentración media, terminando con el análisis de exproteome. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Tubos de microcentrífuga con muestras medias sin células concentradas. (A) Muestras de medios concentrados de Synechocystis sp. PCC 6803 de tipo salvaje, recogidas en diferentes OD730nm (0.5, 1 y 2). (B) Muestra media concentrada de Synechocystis sigF, un mutante con producción de carotenoides deteriorados15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Geles SDS-PAGE teñidos de azul coomassie que muestran las proteínas acumuladas en un medio concentrado libre de células cianobacterianas. (A) Exoproteome de las cianobacterias unicelulares Synechocystis sp. PCC 6803 mutante de tipo salvaje ysigF. (B) Exoproteome de Synechocystis sigF contaminado con altos niveles de polisacáridos. (C) Exoproteome de la cianobacterium anabaena sp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para comprender mejor los mecanismos de secreción bacteriana y estudiar los productos liberados, es de extrema importancia demostrar el aislamiento y análisis eficientes de las biomoléculas presentes en el entorno bacteriano extracelular (como polímeros de carbohidratos y proteínas).
Los polímeros de carbohidratos extracelulares cianobacterianos son extremadamente complejos, principalmente debido al número y proporción de diferentes monosacáridos que constituyen su composición1. Los métodos convencionales utilizados para el aislamiento de estas sustancias poliméricas se basan en el concepto simple de que estas sustancias ricas en azúcar son solubles en soluciones acuosas y pueden precipitarse mediante la adición de disolventes orgánicos (como la acetona o el etanol)9 ,17,18. Esto ocurre debido a la extracción de moléculas de agua de las cáscaras de hidratación de los polímeros, y la eficiencia del proceso depende intrínsecamente del peso molecular del polímero (más eficiente en fracciones de mayor peso molecular), estructura química y concentración9,18. Además del paso de precipitación, el método descrito aquí incluye los pasos críticos de diálisis y centrifugación. La diálisis eliminará eficientemente las sales y otros compuestos del medio, que pueden aparecer después de la liofilización como estructuras similares a polvo, mientras que las etapas de centrifugación eliminarán los principales contaminantes y desechos celulares.
Las fallas durante estos pasos pueden conducir a polímeros con altos niveles de contaminación y diferentes características, dependiendo del lote de aislamiento. Algunas contaminaciones se pueden detectar macroscópicamente después de la liofilización de polímeros, ya que alterarán la pigmentación del polímero (generalmente blanco o marrón claro). Por ejemplo, los polímeros liofilizados que son verdes o naranjas generalmente están altamente contaminados con desechos celulares/clorofila o carotenoides. Esto está relacionado con un tiempo insuficiente o fuerza g en los pasos de centrifugación. Sin embargo, algunas cepas cianobacterianas pueden liberar pigmentos y secretar proteínas que permanecen naturalmente asociadas con los polímeros, y esto debe ser considerado al analizar el producto final19. Se pueden añadir pasos adicionales para purificar aún más los polímeros (por ejemplo, tratamientos TCA)10. Sin embargo, estas etapas de purificación también podrían tener un impacto negativo en el producto final, ya que la eliminación de proteínas y otros componentes puede alterar las propiedades del polímero (por ejemplo, viscosidad, hidrofobicidad, etc.) 1 , 20. Incluso repetir los pasos de precipitación/liofilización puede afectar negativamente a los polímeros, principalmente debido a los ciclos de congelación-descongelación que modifican fácilmente sus propiedades fisicoquímicas21. Para mejorar el rendimiento de los polímeros, los tratamientos de calentamiento se pueden aplicar a cultivos enteros antes de la precipitación. Este paso adicional libera el polímero asociado con la superficie celular, pero también puede conducir a la despolimerización18,20. En resumen, es importante notar que la elección del protocolo influirátanto en la cantidad como en la calidad de los polímeros aislados 9,20.
En cuanto a las proteínas cianobacterianas identificadas en el entorno extracelular, muestran una amplia gama de pesos moleculares y puntos isoeléctricos y pueden ser solubles o asociados a la membrana. Esta diversidad de propiedades fisicoquímicas representa un problema para la selección del método más adecuado para el aislamiento del exoproteome. El método presentado aquí depende en gran medida de la concentración de las biomoléculas en el entorno extracelular. Este método aísla no sólo las proteínas que se secretan en el medio, sino también las proteínas presentes en las vesículas de membrana externa (OmVs) y derivadas de la lisis celular. Por lo tanto, los pasos de centrifugación deben realizarse suavemente para evitar la interrupción celular, pero al mismo tiempo recoger los OMV. En cepas cianobacterianas que son eficientes productores de OMVs, las preparaciones de exoproteoma suelen ser naranjas debido a la presencia de carotenoides asociados con estas estructuras lipídicas14,15. Sin embargo, esta característica puede variar considerablemente dependiendo de la cepa cianobacteriana y la fase de crecimiento. Para evaluar la contribución de las proteínas por los OMV, deben añadirse al procedimiento22los pasos de ultracentrifugación. Además, las proteínas que alcanzan el espacio extracelular debido a la lisis celular pueden detectarse mediante la recolección de muestras en diferentes fases de crecimiento y el aumento del número de réplicas.
Como se mencionó anteriormente, dado que muchas cepas cianobacterianas producen polímeros de carbohidratos extracelulares (EPS), las preparaciones de exoproteoma también podrían tener EPS en su composición. El paso de filtración debe retener EPS más complejas y grandes, pero las fracciones EPS más simples eventualmente pueden pasar a través. En consecuencia, la contaminación con grandes cantidades de carbohidratos puede interferir con el análisis de exproteome. Por ejemplo, esta contaminación puede causar un retraso en la separación de proteínas en geles de poliacrilamida, así como enmascarar proteínas menos abundantes. Se han propuesto protocolos alternativos para el aislamiento del exoproteomo con el objetivo de eliminar las biomoléculas contaminantes presentes en el medio extracelular, pero se ha demostrado que son muy selectivos, lo que puede dar lugar a perfiles de exoproteome sesgados13. Por otro lado, una cierta cantidad de proteínas puede quedar atrapada en fracciones EPS más complejas si están atascadas en el filtro. En este caso, el análisis de las preparaciones de exproteoma de diferentes fases de crecimiento/condiciones experimentales, así como el análisis de las proteínas en fracciones EPS puede ayudar a identificar las proteínas atrapadas.
En general, los protocolos descritos aquí encarnan los pasos cruciales para el aislamiento eficiente de polímeros de carbohidratos liberados de cianobacterias y exoproteomes. Lo más importante es que se pueden adaptar fácilmente de acuerdo con las necesidades específicas del usuario e incluyen otras cepas bacterianas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los fondos de la Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) a través del Programa DE Competitividad e Internacionalización (POCI) COMPETE 2020, Portugal 2020, y por fondos portugueses a través del FCT - Fundación para la Ciencia y el Programa De Lancia e A Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior en el marco del proyecto POCI-01-0145-FEDER-028779 y la subvención SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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