Summary
Hier worden protocollen voor de isolatie van cyanobacteriële vrijkomende koolhydraatpolymeren en isolatie van hun exoproteomes beschreven. Beide procedures belichamen belangrijke stappen voor het verkrijgen van polymeren of eiwitten met hoge zuiverheids graden die kunnen worden gebruikt voor verdere analyse of toepassingen. Ze kunnen ook eenvoudig worden aangepast aan de specifieke behoeften van de gebruiker.
Abstract
Cyanobacteriën kunnen een breed scala van biomoleules actief afscheiden in de extracellulaire omgeving, zoals heteropolysacchariden en eiwitten. De identificatie en karakterisering van deze biomoleules kan de kennis over hun secretie trajecten verbeteren en helpen om ze te manipuleren. Bovendien zijn sommige van deze biomoleules ook interessant in termen van biotechnologische toepassingen. Hier beschreven zijn twee protocollen voor eenvoudige en snelle isolatie van cyanobacteriële vrijgekomen koolhydraatpolymeren en eiwitten. De methode voor isolatie van vrijgekomen koolhydraatpolymeren is gebaseerd op conventionele precipitatie technieken van polysacchariden in waterige oplossingen met behulp van organische oplosmiddelen. Deze methode behoudt de eigenschappen van het polymeer en vermijdt tegelijkertijd de aanwezigheid van verontreinigingen uit celvuil en kweekmedium. Aan het einde van het proces is het gelyofiliseerd polymeer klaar om te worden gebruikt of gekarakteriseerd of kan het worden onderworpen aan verdere zuiverings rondes, afhankelijk van het uiteindelijke beoogde gebruik. Met betrekking tot de isolatie van het cyanobacteriële exoproteome, is de techniek gebaseerd op de concentratie van het cel vrije medium na verwijdering van de grote verontreinigingen door centrifugeren en filtratie. Deze strategie zorgt voor een betrouwbare isolatie van eiwitten die de extracellulaire milieu bereiken via membraan transporteurs of buitenste membraan blaasjes. Deze eiwitten kunnen vervolgens worden geïdentificeerd met behulp van standaard massaspectrometrie technieken. De hier gepresenteerde protocollen kunnen niet alleen worden toegepast op een breed scala aan cyanobacteriën, maar ook op andere bacteriële stammen. Bovendien kunnen deze procedures eenvoudig worden aangepast aan het uiteindelijke gebruik van de producten, de vereiste zuiverheid en de bacteriestam.
Introduction
Cyanobacteriën worden alom erkend als productieve bronnen van natuurlijke producten met veelbelovende biotechnologische/biomedische toepassingen. Daarom zijn het begrijpen van cyanobacteriële secretie mechanismen en optimalisatie van de extractie/herstelmethoden essentieel om cyanobacteriën te implementeren als efficiënte microbiële celfabrieken.
Veel cyanobacteriële stammen zijn in staat om extracellulaire polymere stoffen (EPS) te produceren, voornamelijk gevormd door heteropolysacchariden, die verbonden blijven met het celoppervlak of vrijkomen in het medium1. Deze vrijgegeven koolhydraatpolymeren hebben verschillende kenmerken in vergelijking met die van andere bacteriën, die ze geschikt maken voor een breed scala aan toepassingen (bijv. antivirale middelen2, immunostimulerende3, antioxidant4, metaal-chelating5, emulgerende6, en drug delivery agenten7,8). Methodologie voor de isolatie van deze polymeren draagt niet alleen bij tot een betere opbrengst, maar ook tot meer zuiverheid en de specifieke fysische eigenschappen van het verkregen polymeer9. Een overgrote meerderheid van deze methoden voor isolatie van de polymeren is afhankelijk van neerslag strategieën uit het cultuurmedium die gemakkelijk kunnen worden bereikt door de sterke anionische natuur van het polymeer9,10. Bovendien kan het verwijderen van de oplosmiddelen die in de precipitatie stap worden gebruikt, snel worden bereikt door verdamping en/of lyofilisatie. Afhankelijk van de voorziene toepassing, kunnen verschillende stappen worden gekoppeld, hetzij na of vóór polymeer precipitatie om het eindproduct af te stemmen, waaronder Trichloorazijnzuur (TCA) behandeling, filtratie of grootte uitsluitings chromatografie (SEC) kolom zuivering10.
Cyanobacteriën kunnen ook een breed scala aan eiwitten afscheiden door middel van trajecten die afhankelijk zijn van membraan transporteurs (klassiek)11 of gemedieerd door blaasjes (niet-klassiek)12. Daarom vormt de analyse van het cyanobacteriële exoproteome een essentieel hulpmiddel om de cyanobacteriële eiwit secretie mechanismen te begrijpen/manipuleren en de specifieke extracellulaire functie van deze eiwitten te begrijpen. Betrouwbare isolatie en analyse van exoproteomes vereisen de concentratie van de extracellulaire milieu, omdat de overvloed van uitgescheiden eiwitten relatief laag is. Daarnaast kunnen andere fysische of chemische stappen (bijv. centrifugeren, filtratie of eiwit precipitatie) de kwaliteit van het verkregen exoproteome optimaliseren, het eiwitgehalte13verrijken en de aanwezigheid van verontreinigingen vermijden (bijv. pigmenten, koolhydraten, enz.) 14 , 15 of het overwicht van intracellulaire eiwitten in de monsters. Echter, sommige van deze stappen kunnen ook beperken de set van eiwitten die kunnen worden gedetecteerd, leidt tot een bevooroordeelde analyse.
Dit werk beschrijft efficiënte protocollen voor de isolatie van vrijgekomen koolhydraatpolymeren en exoproteomes van cyanobacteriën culture media. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast aan de specifieke doelstellingen van de studie en de behoeften van de gebruiker, met behoud van de basisstappen die hier worden gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cyanobacteriële vrijgekomen koolhydraat polymeer isolatie
-
Polymeer isolatie en verwijdering van verontreinigingen
- Cultiveer de cyanobacteriële stam onder standaardomstandigheden [bv. 30 °C onder een licht van 12 uur (50 μE m− 2s− 1)/12 h donker regime, met orbitaal schudden bij 150 rpm]. Meet de groei met behulp van standaardprotocollen [bv. optische dichtheid bij 730 nm (OD730nm), chlorofyl a, drooggewicht, enz.], en meet vervolgens de productie van vrijgekomen polysacchariden volgens de fenol-zwavelzuur methode16.
- Breng de cultuur over in dialyse membranen (12-14 kDa van het molecuulgewicht cut-off) en dialyze tegen minimaal 10 volumes gedeïoniseerd water gedurende 24 uur met continu roeren.
Opmerking: afhankelijk van het volume van de cultuur te dialyze en medium samenstelling, kan het nodig zijn om het dialyse water te veranderen. - Centrifugeer de kweek op 15.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Breng de supernatant over naar een nieuwe injectieflacon en gooi de pellet (cellen) weg.
- Centrifugeer opnieuw bij 20.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c om verontreinigingen zoals celwand resten of lipopolysacchariden (LPS) te verwijderen.
- Breng de supernatant over naar een glas beker en gooi de pellet weg.
-
Precipitatie van het polymeer
- Voeg 2 volumes van 96% ethanol toe aan het supernatant.
- Inincuberen van de suspensie bij 4 °C, ten minste 's nachts.
- Polymer Recovery
- Voor kleine of niet zichtbare hoeveelheden neergeprecipiteerd polymeer: Centrifugeer de suspensie bij 13.000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in 1 mL of 2 mL autoclaaf gedeïoniseerd water. Breng de waterige suspensie over naar een injectieflacon.
Let op: het supernatant moet voorzichtig worden weggegooid, omdat het gemakkelijk kan worden geresuspendeerd. - Voor zichtbare/grote hoeveelheden neergeprecipiteerd polymeer: Verzamel het neergeprecipiteerde polymeer met steriele metalen Tang naar een injectieflacon. Knijp in het polymeer en gooi de overtollige ethanol weg.
- Voor kleine of niet zichtbare hoeveelheden neergeprecipiteerd polymeer: Centrifugeer de suspensie bij 13.000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in 1 mL of 2 mL autoclaaf gedeïoniseerd water. Breng de waterige suspensie over naar een injectieflacon.
- Facultatief: afhankelijk van de mate van polymeer zuivering vereist, herhaal de precipitatie stap met 96% ethanol na resuspensie van de polymeren in gedeïoniseerd water.
-
Lyofilisatie van het polymeer
- Bewaar de flacons met het neergeprecipiteerde polymeer bij-80 °C, ten minste 's nachts.
- Vriesdrogen (lyophilize) het polymeer voor ten minste 48 h (laat de suspensie niet ontdooien voor vriesdrogen).
- Bewaar het gedroogde polymeer op kamertemperatuur (RT) tot verder gebruik.
Opmerking: het is raadzaam om het polymeer in een exsiccator op te slaan, omdat het water na verloop van tijd kan absorberen.
2. cyanobacteriële exoproteome isolatie
-
Gemiddelde concentratie
- Cultiveer cyanobacteriën onder standaardomstandigheden [bv. 30 °C onder een licht van 12 uur (50 μE m− 2s− 1)/12 h donker regime, met orbitaal schudden bij 150 rpm]. Controleer de groei van cyanobacterium met behulp van standaardprocedures (bijv. od730nm, chlorofyl a, drooggewicht, enz.).
- Centrifugeer de culturen op 4.000 x g, gedurende 10 minuten bij RT.
- Breng de supernatant over in een kolf en gooi de celpellet weg.
- Filtreer het decanteerde medium door een filter van 0,2 μm poriegrootte.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken voor een korte tijdsperiode, als het medium op 4 °C wordt gehouden. - Concentreer het medium ongeveer 500x (gezien het aanvankelijke volume van het gefilterde medium), met behulp van centrifugale concentrators met een nominale moleculaire gewichts uitschakeling van 3 kDa. Centrifugeren dient te worden uitgevoerd op 4.000 x g (maximaal 1 uur per centrifugeren-ronde) bij 15 °c.
Let op: voor de meeste concentratormerken moet het filterapparaat worden gespoeld door centrifugeren met ultrapuur water voor gebruik. Als het filter NAT is, laat het dan niet uitdrogen. Laat voldoende vloeistof op het reservoir wanneer het apparaat niet wordt gebruikt.
Opmerking: het verlagen van de Centrifugeer temperatuur tot 4 °C kan nuttig zijn als het de bedoeling is om de eiwit activiteit te bestuderen, hoewel dit de benodigde tijd voor de monsterconcentratie zal verhogen. Het protocol kan gedurende korte perioden tussen de Centrifugeer stappen worden onderbroken als het medium op 4 °C wordt gehouden. - Spoel de wanden van het monster reservoir van het filterapparaat af met het geconcentreerde monster en breng de inhoud over naar een micro centrifugebuis.
- Voer een extra wasstap van het filterapparaat monster reservoir met geautoclaveerd kweekmedium om te zorgen voor maximale exoproteome herstel.
Opmerking: Volg de instructies van de specifieke fabrikant om het percentage van het herstel te kwantificeren. - Bewaar de exoproteome monsters bij-20 °C tot verder gebruik.
Opmerking: toevoeging van proteaseremmers wordt aanbevolen voor langdurige opslag.
-
Analyse van het exoproteome
- Kwantificeer het eiwitgehalte door BCA-eiwit assay in 96-well plate volgens de instructies van de fabrikant.
- Scheid de eiwitten met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) met behulp van standaard kleurings protocollen (bijv. Coomassie blauw, zilver kleuring).
- Knip de bands/gel-gebieden van belang en Verzamel ze in verschillende microcentrifugebuisjes met geschikte volumes Ultra zuiver water.
- Doorgaan met de identificatie en analyse van de eiwitten door massaspectrometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische weergave van de methode die wordt beschreven om vrijgekomen koolhydraatpolymeren uit cyanobacteriële culturen te halen, wordt afgebeeld in Figuur 1. Geprecipiteerde polymeren van de gematigde EPS-producent cyanobacterium Synechocystis SP. pcc 6803 en de efficiënte EPS-producent cyanothece sp. ccy 0110 worden weergegeven in Figuur 2. In Figuur 3worden gelyofiliseerde polymeren met verschillende mate van verontreiniging getoond, waarbij het belang van de Centrifugeer stappen voor de uiteindelijke zuiverheid van het product wordt benadrukt. Figuur 4 toont de isolatiemethode voor het cyanobacteriële exoproteome. In Figuur 5worden duidelijke medium geconcentreerde monsters (d.w.z. verkregen uit culturen in verschillende groeifases en van een cyanobacteriële stam met lagere carotenoïde productie) weergegeven. Exoproteome monsters van twee morfologisch verschillende cyanobacteriële stammen, de unicellulaire cyanobacteriën synechocystis SP. PCC 6803 en de filamenteuze cyanobacteriën Anabaena SP. PCC 7120, gescheiden door SDS-page, worden weergegeven in Figuur 6.
Figuur 1 : Workflow voor de isolatie van cyanobacterial bracht koolhydraatpolymeren in. Beginnend bij de cyanobacteriële cultuur en verwijdering van verontreinigingen en eindigend met polymeer isolatie en lyofilisatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Cyanobacteriële polymeren na precipitatie. A) polymeer van de gematigde EPS-producent Synechocystis SP. PCC 6803 op de wand van de centrifuge kolf na precipitatie en centrifugeren (pijlen). B) polymeer klonters van de efficiënte EPS-producent cyanothece sp. ccy 0110 drijvend in het glazen bekerglas na neerslag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Gelyofiliseerde cyanobacteriële polymeren. A) drie onafhankelijke partijen polymeren geïsoleerd van Synechocystis SP. PCC 6803: zonder zichtbare verontreiniging (AI), en met pigmentatie indicatief voor besmetting met carotenoïden (AII) of celpuin (AIII) . B) gelyofiliseerd polymeer van cyanothece sp. ccy 0110. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Workflow voor cyanobacteriële exoproteome isolatie. Van cyanobacteriële cultuur tot gemiddelde scheiding en concentratie, eindigend met exoproteome-analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Micro centrifugebuizen met geconcentreerde celvrije middel monsters. A) geconcentreerde medium monsters van Synechocystis SP. PCC 6803 wild-type, verzameld op verschillende od730nm (0,5, 1 en 2). B) geconcentreerd medium monster van Synechocystis ∆sigf, een mutant met een verminderde productie van carotenoïden15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Coomassie blauw-gekleurd sds-pagina gels met de eiwitten die zich hebben verzameld in cyanobacteriële celvrij geconcentreerd medium. (A) exoproteome van de unicellulaire cyanobacteriën synechocystis SP. PCC 6803 wild-type en ∆sigf mutant. B) exoproteome van Synechocystis ∆sigf , verontreinigd met hoge concentraties polysacchariden. C) exoproteome van het filamenteuze cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om de bacteriële secretie mechanismen beter te begrijpen en de vrijgegeven producten te bestuderen, is het van extreem belang om de efficiënte isolatie en analyse van de in de extracellulaire bacteriële omgeving aanwezige biomoleules te demonstreren (zoals vrijgegeven koolhydraatpolymeren en eiwitten).
Cyanobacteriële extracellulaire koolhydraatpolymeren zijn uiterst complex, voornamelijk als gevolg van het aantal en de proportie van verschillende monosacchariden die samenstelling1vormen. De conventionele methoden die worden gebruikt voor isolatie van deze polymere stoffen vertrouwen op het eenvoudige concept dat deze suikerrijke stoffen oplosbaar zijn in waterige oplossingen en kunnen worden neergeprecipiteerd door toevoeging van organische oplosmiddelen (zoals aceton of ethanol)9 ,17,18. Dit gebeurt als gevolg van de extractie van watermoleculen uit de hydratatie schalen van de polymeren, en de efficiëntie van het proces is intrinsiek afhankelijk van het molecuulgewicht van het polymeer (efficiënter bij hogere molecuul gewichts fracties), chemische structuur en concentratie9,18. Naast de precipitatie stap omvat de hier beschreven methode de kritische stappen van dialyse en centrifugeren. Dialyse zal efficiënt zouten en andere verbindingen uit het medium verwijderen, die na lyofilisatie kunnen verschijnen als poederachtige structuren, terwijl de centrifugeren stappen belangrijke verontreinigingen en celresten zullen verwijderen.
Storingen tijdens deze stappen kunnen leiden tot polymeren met hoge besmettingsniveaus en verschillende kenmerken, afhankelijk van de isolatie batch. Sommige verontreinigingen kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd macroscopisch na polymeer lyofilisatie, omdat ze de polymeer pigmentatie (meestal wit of licht bruin) zal veranderen. Zo zijn gelyofiliseerde polymeren die groen of oranje zijn, over het algemeen sterk verontreinigd met celpuin/chlorofyl of carotenoïden. Dit is gerelateerd aan onvoldoende tijd of g kracht in centrifugeren stappen. Sommige cyanobacteriële stammen kunnen echter pigmenten vrijgeven en eiwitten afscheiden die natuurlijk in verband worden gebracht met de polymeren, en dit moet worden overwogen bij het analyseren van het eindproduct19. Er kunnen extra stappen worden toegevoegd om de polymeren verder te zuiveren (bijv. TCA-behandelingen)10. Niettemin kunnen deze zuiveringsstappen ook een negatief effect hebben op het eindproduct, omdat het verwijderen van eiwitten en andere componenten de polymeer eigenschappen kan veranderen (bijv. viscositeit, hydrofobiciteit, enz.). 1 , 20. zelfs het herhalen van de precipitatie/lyofilisatie kan de polymeren negatief beïnvloeden, voornamelijk als gevolg van de bevriezings cycli die hun fysisch-chemische eigenschappen gemakkelijk kunnen wijzigen21. Om de polymeer opbrengsten te verbeteren, kunnen verwarmings behandelingen worden toegepast op hele culturen voorafgaand aan de neerslag. Deze extra stap releases het polymeer geassocieerd met het celoppervlak, maar het kan ook leiden tot depolymerisatie18,20. Samenvattend is het belangrijk te merken dat de keuze van het protocol zowel de hoeveelheid als de kwaliteit van geïsoleerde polymeren9,20zal beïnvloeden.
Met betrekking tot de cyanobacteriale eiwitten die in het extracellulaire milieu zijn geïdentificeerd, vertonen ze een breed scala aan molecuulgewichten en ISO-elektrische punten en kunnen ze oplosbaar of membraan-geassocieerd zijn. Deze diversiteit van fysisch-chemische eigenschappen vertegenwoordigt een probleem voor de selectie van de meest geschikte methode voor exoproteome isolatie. De hier gepresenteerde methode hangt sterk af van de concentratie van de biomoleules in het extracellulaire milieu. Deze methode isoleert niet alleen eiwitten die in het medium worden uitgescheiden, maar ook eiwitten die aanwezig zijn in buitenste membraan blaasjes (Omv's) en zijn afgeleid van cellyse. Daarom moeten centrifugeren stappen voorzichtig worden uitgevoerd om celverstoring te voorkomen, maar tegelijkertijd het verzamelen van Omv's. In cyanobacteriële stammen die efficiënte OMVS-producenten zijn, zijn de exoproteome preparaten meestal oranje vanwege de aanwezigheid van carotenoïden in verband met deze lipidische structuren14,15. Deze functie kan echter aanzienlijk variëren, afhankelijk van de cyobacteriële stam en groeifase. Om de bijdrage van eiwitten door Omv's te beoordelen, moeten ultracentrifugeren stappen worden toegevoegd aan de procedure22. Bovendien kunnen eiwitten die door cellyse de extracellulaire ruimte bereiken, worden gedetecteerd door monsters in verschillende groeifases te verzamelen en het aantal replicaten te verhogen.
Zoals eerder vermeld, omdat veel cyanobacteriële stammen extracellulaire koolhydraatpolymeren (EPS) produceren, kunnen de exoproteome preparaten ook EPS in hun samenstelling hebben. De filtratie stap moet complexere en grotere EPS behouden, maar eenvoudigere EPS fracties kunnen uiteindelijk passeren. Hierdoor kan besmetting met grote hoeveelheden koolhydraten de exoproteome-analyse verstoren. Deze verontreiniging kan bijvoorbeeld leiden tot een vertraging in de eiwit scheiding in polyacrylamidegels, evenals het maskeren van minder overvloedige eiwitten. Er zijn alternatieve protocollen voorgesteld voor exoproteome-isolatie gericht op het verwijderen van verontreinigende biomoleules die aanwezig zijn in het extracellulaire medium, maar ze zijn zeer selectief gebleken, wat kan leiden tot partijdige exoproteome profielen13. Aan de andere kant kan een bepaalde hoeveelheid eiwitten worden gevangen in complexere EPS fracties als ze vastzitten in het filter. In dit geval kan het analyseren van exoproteome preparaten uit verschillende groeifases/experimentele omstandigheden en analyse van de eiwitten in EPS fracties helpen om de ingesloten eiwitten te identificeren.
Over het algemeen belichamen de hier beschreven protocollen de cruciale stappen voor efficiënte isolatie van cyanobacteriële vrijgekomen koolhydraatpolymeren en exoproteomes. Het belangrijkste is dat ze gemakkelijk kunnen worden aangepast aan specifieke gebruikersbehoeften en andere bacteriële stammen bevatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fondsen via het wedstrijd 2020-Operacional programma voor concurrentievermogen en internationalisering (POCI), Portugal 2020, en door Portugese fondsen via FCT-Fundação para a Ciência e een Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino superieur in het kader van het project POCI-01-0145-FEDER-028779 en de Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
