Summary
Nós descrevemos protocolos para preparar ooocysts e purificar esporozoítos para estudar a infecção de organóides intestinais e da via aérea humanos pelo parvum de Cryptosporidium. Nós demonstramos os procedimentos para o microinjection dos parasita no lúmen organoid intestinal e na imunocoloração dos organoids. Finalmente, nós descrevemos o isolamento de ooocysts gerados dos organoids.
Abstract
O parvum de Cryptosporidium é uma das causas principais da doença diarreicas humana. Para compreender a patologia do parasita e desenvolver drogas eficientes, um sistema in vitro da cultura que recapitula as circunstâncias no anfitrião é necessário. Organóides, que se assemelham estreitamente aos tecidos de sua origem, são ideais para estudar interações hospedeiro-parasita. Os organóides são estruturas derivadas de tecido tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco adultas e crescem em cultura por longos períodos de tempo sem sofrer qualquer aberração genética ou transformação. Têm a polaridade bem definida com superfícies apical e basolateral. Organóides têm várias aplicações em testes de drogas, biobancário, e modelagem de doenças e estudos de interação hospedeiro-micróbio. Aqui nós apresentamos um protocolo passo a passo de como preparar os oocistos e os esporozoítos do Cryptosporidium para infectar organoids intestinais e da via aérea humana. Nós demonstramos então como a microinjeção pode ser usada para injetar os micróbios no lúmen organoid. Existem três métodos principais pelos quais os organóides podem ser usados para estudos de interação hospedeiro-micróbe — microinjeção, cisalhamento mecânico e chapeamento, e fazendo monolayers. Microinjection permite a manutenção da estrutura 3D e permite o controle preciso de volumes do parasita e de contato lateral apical direto para os micróbios. Nós fornecemos detalhes para o crescimento ideal dos organóides para a produção da imagem latente ou do ooocyst. Finalmente, nós igualmente demonstramos como os ooocysts recentemente gerados podem ser isolados do organoid para um processamento e uma análise a jusante mais adicionais.
Introduction
O desenvolvimento de medicamentos ou vacinas para tratamento e prevenção da infecção por Cryptosporidium tem sido dificultado pela falta de sistemas in vitro que imitam precisamente a situação in vivo em humanos1,2. Muitos dos sistemas atualmente disponíveis permitem apenas a infecção a curto prazo (< 5 dias) ou não suportam o ciclo de vida completo do parasita3,4. Outros sistemas que permitam o desenvolvimento completo do parasita são baseados em linhas celulares imortalizadas ou linhas de células cancerosas que não recapitulam fielmente a situação fisiológica em humanos5,6,7 . Organóides ou ' miniórgãos ' são estruturas derivadas de tecido 3D que são cultivadas em uma matriz extracelular suplementada com vários fatores de crescimento específicos do tecido. Organóides foram desenvolvidos a partir de vários órgãos e tecidos. Eles são geneticamente estáveis e recapitulam a maioria das funções dos órgãos de sua origem, e podem ser mantidos em cultura por longos períodos de tempo. Nós desenvolvemos um método para infectar organóides intestinais e pulmonares humanos com Cryptosporidium que fornece um modelo in vitro exato para o estudo de interações hospedeiro-parasita relevantes para a criptosporidiose intestinal e respiratória8 ,9,10,11,12,13. Em contraste com outros modelos de cultura publicados, o sistema organoide é representativo das interações do parasita hospedeiro da vida real, permite a conclusão do ciclo de vida para que todos os estágios do ciclo de vida do parasita possam ser estudados, e mantém a propagação do parasita até 28 dias10.
O Cryptosporidium parvum é um parasita apicomplexum que infecta o epitélio dos tratos respiratório e intestinal, causando doença diarreica prolongada. A fase ambiental resistente é o oocisto, encontrado em alimentos contaminados e água14. Uma vez ingerido ou inalado, o oocisto excistos e libera quatro esporozoítos que se unem às células epiteliais. Os esporozoítos deslizam sobre as células hospedeiras e envolvem receptores de células hospedeiras, mas o parasita não invade totalmente a célula, e parece induzir a célula hospedeira a engolir15. O parasita, que é internalizado dentro de um compartimento intracelular mas extracytoplasmic, permanece na superfície apical da pilha, replicando dentro de um vacuole do vacúolos parasitóforos. Ele sofre duas rodadas de reprodução assexuada — um processo chamado merogonia. Durante a merogonia, o tipo I meronts desenvolve que contêm oito merozoítos que são liberados para invadir novas células. Estes merozoítos invadem novas células para se desenvolverem em merontes tipo II contendo quatro merozoítos. Estes merozoites, quando liberados, infectam as células e se desenvolvem em macrogamonts e microgamonts. Microgametas são liberados e fertilizar os macrogametas produzindo zigotos que amadurecem em oocistos. Os oocistos maduros são liberados subseqüentemente no lúmen. Os oocistos são ou de paredes finas que imediatamente exquisto para reinfectar o epitélio, ou paredes grossas que são liberados para o ambiente para infectar o próximo hospedeiro14. Todas as etapas do ciclo de vida de Cryptosporidium foram identificadas no sistema de cultivo organoide previamente desenvolvido pelo nosso grupo10.
Como os organóides humanos replicam fielmente os tecidos humanos9,11,13, e apoiam todos os estágios replicativos do Cryptosporidium10, eles são o sistema ideal de cultura tecidual para estudar Biologia de Cryptosporidium e interações hospedeiro-parasita. Aqui nós descrevemos os procedimentos para infectar organóides com oocistos do Cryptosporidium e os sporozoites metacercárias, e isolando os ooocysts novos produzidos neste sistema da cultura do tecido.
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Protocol
Toda a manipulação e Resection do tecido foram executados protocolos aprovados da placa de revisão institucional (IRB) com consentimento paciente.
1. preparação de oocistos de C. parvum para injeção
Nota: Os oocistos de Cryptosporidium foram adquiridos de uma fonte comercial (ver a tabela de materiais). Estes oocistos são produzidos em bezerros e são armazenados em soro-tampão fosfato (PBS) com antibióticos. Eles podem ser armazenados por cerca de 3 meses a 4 ° c e nunca devem ser congelados. Nós normalmente usamos oocistos dentro de um mês. Os organóides podem ser infectados com oocistos intactos, ou os esporozoítos podem ser isolados de oocistos metacercárias e utilizados para infectar organóides se for importante não ter oocistos a partir do inóculo original.
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Prepare oocistos de Cryptosporidium para infectar as células (Figura 1a).
- Manter oocistos no gelo durante todas as manipulações até que eles são adicionados aos organóides.
- Calcule o número de oocistos necessários para uma placa de seis poços completa de organóides (geralmente cerca de 5 x 105– 2,5 x 105 para a placa). Conte os números de oocistos em um hemociômetro para verificar a quantidade e transferir para um tubo de centrífuga.
Nota: Para ajudar na visualização, os oocistos podem ser misturados 1:1 com um anticorpo fluorescente oocyst-específico (veja a tabela de materiais) antes de ser carregado no Hemocytometer. Os oocistos rotulados com fluoróforo podem ser facilmente visualizados e enumerados usando um microscópio de fluorescência. Nós sugerimos injetar aproximadamente 100-1000 ooocysts/organoid. Em geral, os organóides de 1000 – 2000 podem ser cultivados em uma placa de seis poços. - Coloque o volume da suspensão dos oocistos até 900 μL com PBS. Adicionar 100 μL de hipoclorito de sódio (por exemplo, Clorox) lixívia (a 4 ° c). Incubar por 10 min no gelo.
- Centrifugar durante 3 min num microcentrifugador a 8.000 x g a 4 ° c. Oriente os tubos na centrífuga com a abertura da tampa voltada para dentro. A pelota pode ser difícil de ver assim sabendo onde os parasitas têm peletizadas no tubo é essencial.
- Retire o sobrenadante com uma pipeta sendo cuidadoso para evitar o pellet. Adicione 1 mL do meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) e vórtice para misturar.
- Centrifugar durante 3 min num microcentrifugador a 8.000 x g a 4 ° c.
- Repita as lavagens com DMEM mais duas vezes.
- Prepare o meio de expansão (OME) ou o meio organoide de diferenciação (OMD) ao qual taurocolato foi adicionado a uma concentração final de 0,5% (p/v) (ver tabela de materiais). Taurocolato deve sempre ser preparado e adicionado fresco.
Nota: Nós usamos com sucesso 0,5% taurocolato em nossos ensaios da infecção onde o inóculo é ooocysts intactos, e vimos taxas melhoradas da infecção sem efeitos deletérios nas pilhas de anfitrião. No entanto, taurocolato pode ter efeitos inesperados nas células, e as concentrações mais baixas têm sido usadas com sucesso em ensaios de infecção16. - Ressuspender oocistos em 100 μL de meio de cultura organoide suplementado com 0,5% (p/v) de sódio taurocolato. Os oocistos da contagem outra vez como descrito em etapa 1.1.2.
- Adicionar corante verde rápido à suspensão para visualizar a injecção.
- Encha as pontas do Micro-carregador (veja a tabela dos materiais) com a suspensão do de oocistos e use-a para encher capilares puxados.
Atenção: O procedimento inteiro deve ser feito em uma capa da cultura do tecido com protocolos de segurança de nível 2. O uso de máscaras é recomendado, pois os oocistos de Cryptosporidium também podem ser infecciosos quando transportados pelo ar.
2. purificação in vitro de Sporozoites de C. parvum oocistos
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Purificar os esporozoites de C. pilotom oocistos após o branqueamento e lavar o alvejante como descrito acima.
- Transfira os oocistos para um tubo de 15 mL. Ressuspender os oocistos no meio da temperatura ambiente excistação (0,75% w/v taurocolato de sódio em DMEM) para obter 1 x 107 oocistos/ml. A adição de taurocolato melhora a taxa do excistação dos ooocysts, melhorando a produção do esporozoítos.
- Incubar a suspensão do oocisto a 37 ° c por 1 – 1,5 h.
- Verifique a amostra microscopicamente para a extensão do excystation; 60 – 80% excistação é razoável para uma boa recuperação de esporozoites. Se o nível de excistação for baixo, incubar mais tempo (outros 30 min a 1 h).
- Determine o percentual de excistação em relação ao número de oocistos iniciadores. Excystation é calculado como:
% excistação = [1 – (número de oocistos intactos/número de oocistos no início)] x 100 - Lave as células para remover os reagentes da excistação adicionando 14 ml de PBS ou meio, misturando e recuperando células (oocistos intactos, conchas de oocistos e esporozoítas) por centrifugação a 3.400 x g por 20 min para recuperar esporozoites. Aspirar com cuidado para evitar a perda de células.
- Ressuscita o pellet esporozoítos em 1 – 2 ml de DMEM para obter 3 x 107 oocistos/ml (com base no número de oocistos iniciais).
- Para remover os oocistos e conchas remanescentes, filtre a suspensão através de um filtro de 3 μm (Figura 1b). Use um aparelho de suporte de filtro de 47 mm equipado com filtro de policarbonato (tamanho de poros de 3 μm) anexado a um barril de seringa de 10 mL. Coloque o aparelho do suporte do filtro em cima de um tubo de 15 mL. Coloque a montagem em um balde de gelo ou em sala fria.
- Adicione 7,5 ml da suspensão do esporozoítos ao conjunto do filtro e permita filtrar completamente pela gravidade. Lave com outro 7,5 mL de DMEM.
Nota: Para assegurar o sucesso na isolação do esporozoítos os ooocysts frescos e o bom excistação são críticos. Se houver demasiados oocistos unexcysted, a suspensão não fluirá através pela gravidade. Aplicar pressão sobre a seringa pode forçar oocistos unexcysted completamente. A microinjeção de esporozoítos é mais desafiadora do que a dos oocistos, pois os esporozoítos podem se amontoam e bloqueiam o capilar. Para evitar isso, recomendamos fazer uma ponta capilar mais ampla ao injetar organóides com esporozoites. Para atingir níveis suficientes de infecção, 2 – 4 vezes o número de esporozoites precisa ser injetado em cada organóide em comparação com organóides infectados com oocistos. - Centrifugue a suspensão filtrada do esporozoítos em 3.400 x g usando um rotor de balanço da cubeta por 20 minutos aos sporozoites da pelota.
- Ressuscite em 50 – 100 μL de meio de cultura organóide OME ou OMD (ver tabela de materiais) suplementado com 0, 5% (p/v) corante verde rápido e l-glutationa, betaína, l-cisteína, ácido linoleico e tampão de redução contendo taurina5 (ver o Tabela de materiais).
Nota: Incubando oocistos por muito tempo pode resultar na lise de esporozoites e recuperação pobre e, portanto, deve ser evitado.
3. cultura in vitro de Organoides intestinais e pulmonares humanos para microinjeção
- Cultura organóides intestinais em condições de expansão e meios de diferenciação.
Nota:Os detalhes da propagação organoid intestinal e do pulmão foram descritos previamente em outros artigos8,13(videTabela de materiaispara receitas de mídia). Aqui, descrevemos brevemente o método de cultura organóide com referência específica à otimização paraCryptosporidiuminjeção e crescimento. Descobrimos que, para a imagem de parasitas em organóides, os organóides cultivados em meio de expansão são preferíveis àqueles em meios de diferenciação cultivados, pois há menos acúmulo de detritos do que o observado em organóides cultivados em meio de diferenciação. No entanto, se o objetivo é isolar oocistos, organóides cultivados em meios de diferenciação produzem um número muito maior de oocistos.- Manter organóides em culturas 3D na matriz extracelular (ver a tabela de materiais) em 37 ° c. Adicione OME (mídia de expansão) na parte superior e atualize todos os dias.
Nota: Para organóides pulmonares, não temos meios de expansão e diferenciação separados. - Para dividir e organoides de placa para microinjeção, remova a mídia da placa de 6 poços contendo organóides humanos e adicione F12 + + + (veja a tabela de materiais) ao poço e divida a matriz, introduzindo uma pipeta com uma ponta de pipetagem de 1 ml várias vezes. Colete células em um tubo de 15 mL (2 mL de F12 + + + por tubo é suficiente para procedimentos adicionais).
- Adicione 10 – 12 mL de F12 + + + em outro tubo de 15 mL e coloque um Pipet de vidro polido a fogo no meio, pipeta para cima e para baixo 3 vezes para quebrar os organóides intestinais e pulmonares humanos.
Nota: Use um Pipet de vidro longo (20 – 30 cm) e fogo-lustre-o brevemente. Não faça a abertura (diâmetro de 1 milímetro) muito pequena porque os organóides podem ser danificados. Faça a ponta do Pipet liso por momentaneamente fogo-lustrando o. Quebre organóides em pedaços menores de ~ 50 μm. os organóides pulmonares têm uma membrana externa mais espessa e, portanto, necessitam de cisalhamento mais forte com a pipeta de vidro em comparação com os organóides intestinais. Além disso, eles têm uma taxa de crescimento mais lenta do que os organóides intestinais (até 14 dias entre cada passaging). - Adicionar F12 + + + até 5 – 7 mL e centrifugar a 350 x g durante 5 min.
Nota: A velocidade da centrifugação nesta etapa é mais elevada do que o normal a fim fazer uma boa pelota da pilha que seja separada bem da matriz extracelular (veja a tabela dos materiais). Observamos que, em comparação com os organóides do intestino delgado, os organóides do intestino delgado humano são mais difíceis de interromper. - Retire o máximo de meio possível sem perturbar as células, em seguida, Ressuspender a pelota com matriz mantida a 4 ° c; são necessários 200 – 300 μL de matriz por poço de uma placa de seis poços. Os organóides devem ser divididos um em cada três para manter uma densidade celular bastante alta.
- Placa os organóides em gotas de matriz de cerca de 5 – 10 μL cada um no poço de uma placa de seis poços. Incubar por 20 – 30 min a 37 ° c e depois adicionar meio de expansão (OME) na parte superior.
- Mude o meio a cada 2 – 3 dias.
Nota: Em cerca de 5 – 7 dias, os organóides que crescem em em atingem um tamanho de 100 – 200 μm e estão prontos para injeção. - Para diferenciar os organóides, após 5 – 6 dias em em, mude a mídia para as condições de mídia de diferenciação (DM) e mantenha por 5 – 6 dias adicionais antes de injetar os parasitas.
Nota: Para a expansão de organóides, recomenda-se a placa dos organóides densamente. Para a microinjecção, recomenda-se a utilização de uma placa de seis poços com organóides revestidos a uma densidade inferior. Por exemplo, organoides de placa de três poços de uma placa de seis bem em uma placa de seis bem completa para microinjeções. A matriz deve ser mantida a-20 ° c para armazenamento a longo prazo e descongelada a 4 ° c ou no gelo antes da utilização. A expansão dos organóides pulmonares é feita de forma semelhante, mas utilizando componentes de meios específicos organoides pulmonares (tabela 1)8 .
- Manter organóides em culturas 3D na matriz extracelular (ver a tabela de materiais) em 37 ° c. Adicione OME (mídia de expansão) na parte superior e atualize todos os dias.
4. microinjeção de oocistos/Esporozoites no lúmen Organóide
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Microinjete parasitas no lado apical do organoide 3D (Figura 2).
- Prepare capilares de vidro de 1 mm de diâmetro usando um extrator de micropipeta.
Nota: Os ajustes usados no extrator da micropipeta (veja a tabela dos materiais) são: calor = 663, tração = 100, velocidade = 200, tempo = 40 MS. as configurações precisarão ser ajustadas de acordo com as instruções do usuário para uma máquina específica. - Corte a ponta do capilar com fórceps. O tamanho/diâmetro da extremidade capilar mede cerca de 9 – 12 μm; Isto permite o fluxo fácil dos ooocysts (tamanho de 4 – 5 μm).
- Encha capilares com de oocistos ou a suspensão do esporozoítos usando pontas do Micro-carregador.
- Coloque o capilar cheio de oocistos sobre um microinjetor.
- Microinjetar 100 – 200 nL suspensão em cada organóide um microscópio invertido em 5x ampliação, mantendo a pressão constante. Após a microinjecção, refresque a mídia com OME ou OMD todos os dias e mantenha a chapa a 37 ° c.
Nota: Nós não usamos um micromanipulador para microinjection. O uso do mesmo capilar é recomendado para todo o experimento para garantir a mesma injeção em cada amostra.
- Prepare capilares de vidro de 1 mm de diâmetro usando um extrator de micropipeta.
5. coloração de imunofluorescência de organóides
- Colete organóides (1 – 2 x 24 poços) com uma pipeta P1000 em um tubo de 15 mL contendo o frio F12 + + +.
- Os organóides da pelota em 300 x g por 2 minutos, removem o sobrenadante sem interromper o pellet, e gentilmente Pipet a pelota solta no volume restante.
- Adicione 5 mL de paraformaldeído a 2% em PBS. Para evitar que os organóides aderem à parede não inverta o tubo. Permita que os organóides se instalem na parte inferior do tubo e fixem a 4 ° c durante a noite ou 1 h à temperatura ambiente.
- Retire o fixador e adicione 10 mL de tampão de permeabilização (0,2% Triton em PBS).
- Gire o tubo à temperatura ambiente durante 20 min (isto assegura que todos os organóides permaneçam em suspensão).
- Pellet os organóides em 300 x g por 2 min, e depois descartar o sobrenadante.
- Ressuscite os organóides suavemente em 500 μL de solução de bloqueio (consulte a tabela de materiais) e transfira para um tubo de microcentrífuga de 2 ml.
- Incubar durante 20 min à temperatura ambiente numa coqueteleira. Permita que os organóides se instalem na parte inferior do tubo por gravidade. Substitua a solução de bloqueio por solução de anticorpo primário (ver tabela de materiais) e incubar por 1 – 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° c.
- Lave 3x com PBS contendo 0,1% de Tween. Deixe os organóides resolver cada vez e remover o sobrenadante.
- Adicione a solução secundária do anticorpo (veja a tabela dos materiais) e incubar para 2 h na temperatura ambiente.
- Lave 3x com PBS contendo 0,1% de Tween. Deixar 50 μL de PBS após a terceira lavagem.
- Monte na corrediça introduzindo com pipting os organóides suspendidos em 50 μl do PBS na corrediça. Remova o excesso de PBS, adicione uma gota de agente de montagem (veja a tabela de materiais) e adicione a lamínula na parte superior. Selar os lados com esmalte e deixe secar.
6. isolamento de oocistos de organóides
- Isole oocistos recém-formados do lúmen organoide.
Nota:Os oocistos são isolados dos organóides por separação imunomagnética utilizando um kit de isolamento do oocisto (verTabela de materiais) com as modificações descritas abaixo. Os oocistos isolados podem então ser analisados por imunofluorescência e microscopia eletrônica.- Comece com organóides diferenciados que foram mantidos em OMD por 5 – 7 dias e que não estão infectados, infectados por 1 dia e infectados por 5 dias. Use os dois primeiros como controles negativos.
Nota: Nós encontramos que os organóides diferenciados produzem mais ooocysts do que o pulmão ou expandindo organóides intestinais10. - Colete organóides em tubos de centrifugação de 15 mL. Centrifugue os organoides durante 20 min a 3.000 x g e 10 ° c.
Nota: Esta alta velocidade é necessária para certificar-se de que nenhum oocistos são perdidos de qualquer organoides que podem ser quebrados. - Retire a mídia organoide e substitua-a por 5 mL de água.
- Interrompa os organóides com pipetagem vigorosa repetida com uma pipeta Pasteur de vidro polido a fogo.
- Se os aglomerados são visíveis, transfira a suspensão organoid a um homogeneizador de com de vidro, e Homogeneize até que os organóides estejam interrompidos bem. O homogeneizador de com não afetará os oocistos.
- Uma vez que não existam aglomerantes visíveis, adicione 5 mL de tampão a do kit de isolamento do oocisto. Misturar e, em seguida, adicionar 120 μL das esferas magnéticas revestidas com anti-oocisto IgM.
- Incubar a suspensão da pilha e os grânulos magnéticos para 2 h na temperatura ambiente com mistura contínua em uma plataforma do balancim.
- No final da incubação, coloque os tubos contendo células e grânulos em um rack de separação magnética projetado para tubos de 15 mL.
- Gire os tubos em rack de separação magnética manualmente por 3 min. Os grânulos aderirão ao lado do tubo ao lado do ímã.
- Com cuidado, com uma pipeta de 10 mL, retire o sobrenadante das esferas. Suspender os grânulos em 450 μL de tampão B e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
Nota: Mantenha o sobrenadante até que o isolamento dos oocistos seja confirmado. - Para recolher os restantes grânulos e oocistos, lave o tubo de 15 mL com 450 μL de tampão B e acrescente esta lavagem aos grânulos magnéticos no tubo de microcentrífuga.
- Repita o passo 6.1.11 mais uma vez. Todos os grânulos e oocistos capturados devem agora ser transferidos para o tubo de microcentrífuga.
- Coloc o tubo do microcentrifugador em uma cremalheira magnética da separação projetada prendendo os tubos do microcentrifugador.
- Gire o tubo na cremalheira magnética da separação à mão por 3 minutos.
- Retire cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta para um novo tubo.
Nota: Mantenha o sobrenadante até que o isolamento dos oocistos seja confirmado. - Retire o tubo de microcentrífuga contendo grânulos magnéticos e oocistos do rack de separação magnética.
- Adicionar 100 μl de HCl 0,1 N a grânulos magnéticos para eluir os oocistos fora dos grânulos. Vortex por 30 s.
Nota: Vortexer deve ser ajustado para um pouco menos do que a velocidade máxima. - Incubar os grânulos no HCl 0,1 N por 10 minutos na temperatura ambiente.
- Vortex de novo. Em seguida, coloque o tubo de volta na cremalheira de separação magnética. Aguarde que os grânulos aderiram ao lado do tubo e, em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
- Repita as etapas 6.1.17 através de 6.1.19 e combine o segundo eluído com a primeira elution.
- Neutralize o eluato com 20 μL de 1 N NaOH, ou outro tampão de neutralização como 1 M Tris, pH 8.
- Para a contagem de oocistos, tomar 10 μL do eluato, combiná-lo com 10 μL de anticorpo oocyst-specific (ver tabela de materiais) e contagem de oocistos fluorescentes em um Hemocytometer.
Nota: Oocistos isolados podem ser armazenados a 4 ° c ou utilizados imediatamente para a imunofluorescência ou microscopia eletrônica de imagem.
- Comece com organóides diferenciados que foram mantidos em OMD por 5 – 7 dias e que não estão infectados, infectados por 1 dia e infectados por 5 dias. Use os dois primeiros como controles negativos.
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Representative Results
Os protocolos aqui apresentados resultam na purificação eficiente de oocistos e esporozoítos (Figura 1a) prontos para a microinjeção. O protocolo do excistação conduz à liberação dos esporozoítos de aproximadamente 70 – 80% dos ooocysts, conseqüentemente é essencial filtrar para fora os ooocysts e os escudos restantes através de um filtro de 3 μm. A filtração resulta em quase 100% de purificação de esporozoíta (Figura 1b). Além disso, a adição de um corante verde ajuda a garantir a injeção de todos os organóides e permite a visualização de organóides injetados por pelo menos 24 h após a injeção (Figura 2b).
Estes protocolos para a preparação de oocistos e esporozoítos são simples e têm sido utilizados por muitos anos, por isso é esperado que os oocistos tratados e esporozoites purificados serão viáveis e infecciosas. No entanto, em nossos estudos, utilizamos microscopia eletrônica de varredura para garantir que o processo de excistação não danifique os esporozoítos ou oocistos (Figura 2a)10. A injeção de quantidades iguais de oocistos no lúmen organoide pode ser visualmente confirmada por imagens microscópicas simples (Figura 2C). Uma porção de organóides infectados deve ser configurada para verificar a propagação do parasita por PCR quantitativo, como descrevemos10.
O progresso através do ciclo de vida do parasita pode ser visualizado pela coleta de organóides infectados em diferentes pontos temporais após a infecção e análise por microscopia eletrônica de transmissão ou por imunofluorescência combinada com 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole ( DAPI) coloração dos núcleos parasitas10. Por exemplo, os anticorpos aos antígenos de superfície do Merozoite, tais como gp40 e gp1517 podem ser usados para identificar estágios do meront; tipo I meronts terá 8 núcleos e tipo II meronts, 4 núcleos10. Recentemente, um painel de anticorpos monoclonais específicos para trophozoites, merozoites, tipo I versus II meronts, e macrogamonts tornou-se disponível18. Estes anticorpos também seria muito eficaz na marcação do progresso do parasita através de suas várias fases do ciclo de vida nos organóides.
Os ensaios de imunofluorescência também podem ser usados para explorar quais tipos de células estão infectados pelo Cryptosporidium. Isto era especial importante olhar nos organóides da via aérea porque muito pouco se sabe sobre o cryptosporidiosis respiratório, e a pilha de anfitrião exata para o parasita não foi sabida. Realizamos ensaios de imunofluorescência em organóides infectados com Cryptosporidium, COLOCALIZANDO CC10, um marcador para as células do clube e constatamos que o Cryptosporidium infectou células CC10-negativas e positivas (Figura 3). Esses resultados foram corroborados por TEMs em que observamos Cryptosporidium infectando células secretoras e não secretoras nos organoides das vias aéreas10.
Depois que os organóides diferenciados foram contaminados por cinco dias, deve haver um número significativo de ooocysts que estão sendo produzidos. Em nossas mãos, a infecção dos organóides da placa 1 6-well rendeu aproximadamente 4000 ooocysts, que poderia facilmente ser identificado e contado em um hemocitômetro etiquetando com um anticorpo ooocyst-específico. A presença de quatro esporozoítos nos oocistos pode ser confirmada pela secagem de uma porção dos oocistos em uma lâmina adesiva, fixando-se com metanol e combinando a coloração DAPI com o anticorpo específico do oocisto (Figura 4). A verificação da produção de oocistos murados espessos pode ser feita pela análise do TEM10.
Figura 1: preparação e purificação de oocistos de Cryptosporidium e esporozoítos. (A) representação esquemática do método utilizado para a preparação de oocistos e esporozoitos para infecção. (B) imagem que mostra excistação in vitro de oocistos. A filtração de oocistos e de escudos unexcysted dá uma solução purified dos sporozoites. Barra de escala = 10 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: microinjeção de oocistos no lúmen organoide. Este número foi modificado de Heo et al.10. (A) imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de oocistos e esporozoítas. (B) imagem mostrando organóides com injeção de oocisto. O corante verde ajuda a visualizar a injeção de cada organóide e persiste ao longo de pelo menos 24 h. (C) imagem de um organóide injetado com oocistos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagem de imunofluorescência do organóide de vias aéreas infectadas por Cryptosporidium. O mucin é etiquetado com o anticorpo do anti-mucin 5 (vermelho) no lúmen do organoid, as pilhas do clube são etiquetadas com o CC10 (amarelo), Cryptosporidium é detectado com anticorpo oocyst-específico (verde), e os núcleos da pilha são manchados com DAPI (azul). O painel B é um alargamento da área indicada no quadrado no painel A. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagem de imunofluorescência do oocisto isolada de organóides intestinais diferenciados. A parede do oocyst é etiquetada com o anticorpo oocyst-específico no verde e os quatro núcleos do esporozoítos são visualizados com DAPI (azul) estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A cultura de parasitas de Cryptosporidium em organóides intestinais e de vias aéreas fornece um modelo preciso para estudar interações parasita-hospedeiro10 , mas também tem muitas outras aplicações. Por exemplo, os métodos atuais de seleção e propagação de parasitas de Cryptosporidium geneticamente modificados necessitam de passagem em camundongos19 , o que não permite o isolamento de parasitas que têm modificações essenciais para a infecção in vivo. A cultura organóide de Cryptosporidium fornece uma alternativa a este procedimento. Entretanto, nós observamos que os esporozoítos em moita junto e bloqueiam a micropipeta. Com a finalidade de selecionar parasitas geneticamente modificados, os organóides podem ser cultivados em transpoços revestidos de colágeno em um formato bidimensional em condições de diferenciação para permitir a infecção com esporozoítos transfectados e, consequentemente, a seleção de Os oocistos geneticamente modificados. As transpoços permitem o acesso às superfícies apical e basolateral e são estáveis por períodos de tempo prolongados.
Atualmente, nós cultura organóides em um formato bidimensional para a triagem de alta taxa de transferência de medicamentos para o câncer organóides derivados do tecido (dados não publicados). Este método de cultura organoide também pode ser adaptado para testes de drogasanticriptosporidium usando a luciferase geneticamente modificada marcada com cepas de Cryptosporidium 19. Além disso, mesmo que a infecção não seja sincronizada firmemente, a infecção dos organóides com esporozoítos fornece a suficiente sincronização do ciclo de vida que as drogas podem ser testadas para sua eficácia de encontro aos estágios específicos do ciclo de vida.
Os sistemas de cocultura organoide estão sendo desenvolvidos tendo em conta alguns outros aspectos do sistema hospedeiro, como a microbiota e as células imunes20. Assim, a capacidade de dissecar interações entre o parasita e as células hospedeiras, as células imunes e a microbiota em breve será possível in vitro. A manipulação genética de Cryptosporidium é também agora possível19, e a combinação de cepas fluorescentes do repórter do Cryptosporidium e da cultura organoid fornecerá as ferramentas para arranjar em seqüência da única pilha de pilhas contaminadas, e ainda mais especificamente o sequenciamento único de células infectadas com estágios específicos do parasita.
O sucesso dos experimentos aqui descritos é altamente dependente da viabilidade e da infectividade dos oocistos. Diferentes lotes de oocistos de Cryptosporidium podem variar amplamente em taxas de excistação e capacidade de infectar células hospedeiras. Rendimentos suficientes de esporozoites dependem de boas taxas de excistação e a taxa de excistação nem sempre é correlacionada com a infectividade. Se baixos níveis de infecção ou excistação pobre são observados com um lote particular de oocistos, o tempo e o esforço podem ser conservados obtendo um lote novo dos ooocysts um pouco do que tentando aumentar números do de oocistos, ou alongando épocas da incubação.
A mídia de cultura organóide deve ser atualizada a cada dia alternado. O uso de passagens mais adiantadas de culturas organoid é aconselhável. É importante descongelar um novo frasco de organóides se os organóides começarem a diferenciar-se em passagens posteriores como a saúde de culturas organóides determinam vastamente a viabilidade do parasita. Após a infecção, os meios organoid devem ser refrescados cada dia para evitar a acumulação de substâncias tóxicas nos meios.
A cultura organoide do Cryptosporidium é limitada, pois o parasita não pode ser propagado indefinidamente, e a infecção sai após três passagens ao longo de 28 dias10. A microinjeção de organóides suficientes para experimentos de mouse, como descrevemos, pode ser demorada e fisicamente taxando. No entanto, até à data, nenhum outro método permite o ciclo de vida completo em um sistema in vitro completamente representativo da infecção humana, nem tem qualquer sistema de cultura foi descrito que permite a exploração das interações hospedeiro-patógeno importante para infecção respiratória. A cultura organóide de Cryptosporidium fornece uma ferramenta nova poderosa que abra avenidas da exploração em interações do hospedeiro-parasita não previamente possíveis para Cryptosporidium.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Deborah a. Schaefer, da escola de Ciências Biomédicas de animais e comparativos, da faculdade de agricultura e ciências biológicas da Universidade do Arizona, Tucson, AZ, EUA, por nos ajudar com a produção e análise do oocisto. Nós igualmente Agradecemos o centro da microscopia e da imagem latente de Franceschi e o DL Mullendore na Universidade de estado de Washington para a preparação e a imagem latente de ooocysts organoid isolados.
D.D. é o beneficiário de um subsídio de VENI da organização neerlandesa para a investigação científica (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. é o beneficiário de uma subvenção VENI da organização neerlandesa de investigação científica (NWO-ALW, 863.14.002) e foi apoiado por bolsas Marie Curie da Comissão Europeia (proposta 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). A investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito do acordo de subvenção avançado do ERC n. º 67013 e da NIH NIAIH R21 AT009174 à RMO. Este trabalho faz parte do Instituto Oncode, que é parcialmente financiado pela sociedade holandesa do cancro e foi financiado por uma subvenção da sociedade holandesa do cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* - cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make up to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
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