Summary
Vi beskriver protokoller til at forberede oocyster og rense sporozoiter til at studere infektion af humane tarm og luftvejs organoider af Cryptosporidium parvum. Vi demonstrerer procedurerne for mikroinjektion af parasitter i tarm organoid lumen og immun farvning af organoider. Endelig beskriver vi isolationen af genererede oocyster fra organoiderne.
Abstract
Cryptosporidium at er en af de vigtigste årsager til menneskelig diarré sygdom. At forstå patologi af parasitten og udvikle effektive lægemidler, et in vitro-kultur system, der rekapitulerer betingelserne i værten er nødvendig. Organoider, der ligner væv i deres oprindelse, er ideelle til at studere vært-parasisite interaktioner. Organoider er tredimensionale (3D) væv-afledte strukturer, som er afledt af voksne stamceller og vokse i kultur i længere perioder uden at gennemgå nogen genetisk aberration eller omdannelse. De har veldefinerede polaritet med både apikale og basolaterale overflader. Organoider har forskellige anvendelser i dopingtest, bio Banking, og sygdoms modellering og Host-Microbe interaktionsstudier. Her præsenterer vi en trin-for-trin protokol om, hvordan man forbereder oocyster og sporozoiter af Cryptosporidium til at inficere menneskelige tarm og luftvejene organoider. Vi viser derefter, hvordan mikroinjektion kan bruges til at injicere mikrober i organoid lumen. Der er tre vigtige metoder, som organoider kan bruges til Host-Microbe interaktionsstudier-mikroinjektion, mekanisk klipning og plating, og ved at gøre monolayers. Mikroinjektion muliggør vedligeholdelse af 3D-strukturen og giver mulighed for præcis kontrol af parasitisk volumen og direkte apikale side kontakt for mikroberne. Vi giver detaljer for optimal vækst af organoider til enten billeddannelse eller oocysttal produktion. Endelig viser vi også, hvordan de nyligt genererede oocyster kan isoleres fra organoid til yderligere downstream-behandling og analyse.
Introduction
Udvikling af lægemidler eller vacciner til behandling og forebyggelse af Cryptosporidium infektion er blevet hæmmet af manglen på in vitro-systemer, der præcist efterligner in vivo situationen i mennesker1,2. Mange af de i øjeblikket tilgængelige systemer enten kun tillader kortvarig infektion (< 5 dage) eller ikke understøtter den komplette livscyklus af parasiten3,4. Andre systemer, der muliggør en fuldstændig udvikling af parasitten, er baseret på immortaliserede cellelinjer eller Cancer cellelinjer, som ikke trofast gengør den fysiologiske situation i mennesker5,6,7 . Organoider eller ' mini-organer ' er 3D væv afledte strukturer, der dyrkes i en ekstracellulær matrix suppleret med forskellige vævsspecifikke vækstfaktorer. Organoider er udviklet fra forskellige organer og væv. De er genetisk stabile og rekapitulerer de fleste funktioner i organerne af deres oprindelse, og kan opretholdes i kulturen i længere tid. Vi har udviklet en metode til at inficere humane tarm-og lunge organoider med Cryptosporidium , der giver en nøjagtig in vitro-model til studiet af vært-parasisite interaktioner relevante for tarm og respiratorisk Cryptosporidiose8 ,9,10,11,12,13. I modsætning til andre offentliggjorte kultur modeller, er organoid-systemet repræsentativt for den virkelige værts parasitator interaktion, giver mulighed for færdiggørelse af livscyklus, således at alle stadier af parasitens livscyklus kan undersøgt, og opretholder parasisite formering i op til 28 dage10.
Cryptosporidium at er en apicomplexan parasisite, der inficerer epitel af de respiratoriske og intestinale skrifter, forårsager langvarig diarré sygdom. Den resistente miljømæssige fase er oocyst, findes i forurenet mad og vand14. Når det indtages eller inhaleres, oocysten excysts og frigiver fire sporozoiter, der binder sig til epiteliale celler. Sporozoiter glide på værter celler og engagere Host celle receptorer, men parasit ikke fuldt invadere cellen, og synes at inducere værten cellen til at opsluge det15. Parasitet, som er internaliseret i et intracellulært, men extracytoplasmic rum, forbliver på den apikale overflade af cellen, replikerer inden for en parasitophorous vakuole. Det gennemgår to runder af aseksuelle reproduktion-en proces kaldet merogony. Under merogony, type I meronts udvikle som indeholder otte merozoiter, der er frigivet til at invadere nye celler. Disse merozoiter invaderer nye celler for at udvikle sig til type II-meronter, der indeholder fire merozoiter. Disse merozoiter, når de frigives, inficere celler og udvikle sig til makro gamonter og mikrogamonter. Mikrogameter frigives og befrugte makrogametes, der producerer zygoter, som modnes til oocyster. Modne oocyster frigives efterfølgende i lumen. Oocyster er enten tyndvæggede, som umiddelbart excyst at reinficere Epitelet, eller tyk walled, som er frigivet i miljøet for at inficere den næste vært14. Alle stadier af Cryptosporidium livscyklus er blevet identificeret i organoid kultur system tidligere udviklet af vores gruppe10.
Da humane organoider trofast replikerer humane væv9,11,13og understøtter alle replikerende stadier af Cryptosporidium10, er de det ideelle vævskultur system til at studere Cryptosporidium biologi og vært-parasisite interaktioner. Her beskriver vi procedurerne for inficering af organoider med både Cryptosporidium oocyster og excysted sporozoiter og isolering af de nye oocyster, der produceres i dette vævskultur system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al vævs håndtering og resektion blev udført under de godkendte protokoller for institutionel revision (IRB) med patientens samtykke.
1. klargøring af C. at oocyster til injektion
Bemærk: Cryptosporidium oocyster blev købt fra en kommerciel kilde (Se tabellen over materialer). Disse oocyster produceres i kalve og opbevares i fosfat-bufferet saltvand (PBS) med antibiotika. De kan opbevares i ca. 3 måneder ved 4 °C og må aldrig fryses. Vi bruger normalt oocyster inden for en måned. Organoider kan være inficeret med enten intakte oocyster, eller sporozoiter kan isoleres fra excysted oocyster og bruges til at inficere organoider, hvis det er vigtigt ikke at have oocyster overført fra den oprindelige inoculum.
-
Forbered Cryptosporidium oocyster til inficerende celler (figur 1a).
- Hold oocyster på is gennem alle manipulationer, indtil de tilsættes til organoiderne.
- Beregn antallet af oocyster, der er nødvendige for en fuld seks-brønd plade af organoider (normalt omkring 5 x 105– 2,5 x 105 for pladen). Tæl antallet af oocyster i et hemocytometer for at kontrollere mængden og overførslen til et centrifugeglas.
Bemærk: For at støtte i visualisering kan oocyster blandes 1:1 med et oocyst-specifikt fluorescerende antistof (Se tabellen over materialer), før de læsses på hemocytometer. De fluorophore-mærkede oocyster kan derefter let visualiseres og optælles ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Vi foreslår at injicere omkring 100 – 1000 oocyster/organoid. I almindelighed, 1000-2000 organoider kan dyrkes i en seks-brønd plade. - Bring volumen af oocysterne suspension op til 900 μL med PBS. Tilsæt 100 μL natriumhypochlorit (f. eks. Clorox) blegemiddel (ved 4 °C). Inkuber i 10 min på is.
- Der centrifugeres i 3 minutter i en mikrocentrifuge ved 8.000 x g ved 4 °c. Drej rørene i centrifugen med hætten opadvendt indad. Pellet kan være svært at se så vide, hvor parasitter har foderpiller i røret er afgørende.
- Fjern supernatanten med en pipette, der er omhyggelig med at undgå pellet. Tilsæt 1 mL Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) og vortex for at blande.
- Der centrifugeres i 3 minutter i en mikrocentrifuge ved 8.000 x g ved 4 °c.
- Gentag skyller med DMEM to gange mere.
- Forbered ekspansions medium (ome) eller differentiering organoid medium (omd), som blev er blevet føjet til en endelig koncentration på 0,5% (w/v) (Se tabel over materialer). Taurocholate skal altid tilberedes og tilsættes frisk.
Bemærk: Vi har med succes brugt 0,5% blev i vores infektion assays, hvor inokulum er intakt oocyster, og så forbedrede frekvenser af infektion uden skadelige virkninger på værtscellerne. Men, blev kan have uventede virkninger på celler, og lavere koncentrationer er blevet anvendt med succes i infektion assays16. - Resuspension af oocyster i 100 μL organoid kulturmedium suppleret med 0,5% (w/v) natrium taurocholate. Tæl oocyster igen som beskrevet i trin 1.1.2.
- Tilsæt hurtigt grønt farvestof til suspensionen for at visualisere injektion.
- Fyld mikro-loader Tips (Se tabellen over materialer) med oocysttal suspension og bruge det til at fylde trukket kapillærer.
Forsigtig: Hele proceduren bør ske i en vævskultur hætte med niveau-2 sikkerhedsprotokoller. Brug af masker anbefales som Cryptosporidium oocyster kan også smitte, når luftbårne.
2. in vitro rensning af sporozoiter fra C. at oocyster
-
Purify sporozoiter fra C. parvum oocyster efter blegning og udvaskning af blegemiddel som beskrevet ovenfor.
- Oocysterne overføres til et 15 mL rør. Resuspension oocyster i stuetemperatur excystation medium (0,75% w/v natrium blev i DMEM) at opnå 1 x 107 oocyster/ml. Tilføjelsen af blev forbedrer excystations hastigheden af oocysterne og forbedrer sporozoitudbyttet.
- Incubate oocysttal suspension ved 37 °C i 1 – 1.5 h.
- Kontroller eksemplet mikroskopisk for omfanget af excystation; 60 – 80% excystation er rimelig for god genopretning af sporozoiter. Hvis niveauet af excystation er lav, Inkuber længere (en anden 30 min til 1 h).
- Bestem procent excystation i forhold til antallet af start oocyster. Excystation beregnes som:
% excystation = [1 – (antal intakte oocyster/antal oocyster ved start)] x 100 - Vask celler til at fjerne excystation reagenser ved at tilføje 14 mL PBS eller medium, blande og inddrive celler (intakte oocyster, oocysttal skaller, og sporozoiter) ved centrifugering på 3.400 x g for 20 min at inddrive sporozoiter. Aspirer forsigtigt for at undgå at miste celler.
- Resuspension sporozoite pellet i 1 – 2 mL DMEM at opnå 3 x 107 oocysts/ml (baseret på antallet af start oocyster).
- For at fjerne resterende oocyster og skaller filtreres suspensionen gennem et 3 μm filter (figur 1b). Brug et 47 mm filterholder apparat udstyret med polycarbonat filter (porestørrelse på 3 μm), der er fastgjort til en 10 mL sprøjte tønde. Filterholderen placeres oven på et 15 mL rør. Placer samlingen i en isspand eller i kølerum.
- Tilsæt 7,5 mL af sporozoite suspensionen til filter modulet og lad det filtrere gennem tyngdekraften. Vaskes med yderligere 7,5 mL DMEM.
Bemærk: For at sikre succes i sporozoite isolation friske oocyster og god excystation er kritiske. Hvis der er for mange unexcysted oocyster, vil suspensionen ikke flyde gennem tyngdekraften. Påføring af tryk på sprøjten kan tvinge unexcysted oocyster igennem. Mikroinjektion af sporozoiter er mere udfordrende end for oocyster, fordi sporozoiter kan klumpe og blokere kapillær. For at undgå dette anbefaler vi at lave en bredere kapillær spids, når du injicerer organoider med sporozoiter. For at opnå tilstrækkelig grad af infektion, 2 – 4 gange antallet af sporozoiter skal injiceres i hver organoid i forhold til organoider inficeret med oocyster. - Centrifuger den filtrerede sporozoite suspension ved 3.400 x g ved hjælp af en svingende skovl rotor i 20 min til pellet sporozoiter.
- Resuspension i 50 – 100 μL OME eller OMD organoid Culture medium (Se tabellen over materialer) suppleret med 0,05% (w/v) hurtigt grønt farvestof og l-glutathion, betain, L-Cystein, linolsyre og taurin-indeholdende reducerende buffer5 (Se Tabel over materialer).
Bemærk: Inkuberet oocyster for længe kan resultere i lysis af sporozoiter og dårlig helbredelse og derfor bør undgås.
3. in vitro-kultur af humane tarm-og lunge Organoider til mikroinjektion
- Kultur tarm organoider under ekspansion og differentiering medie forhold.
Bemærk:Detaljerne i intestinal og lunge organoid formering er tidligere beskrevet i andre artikler8,13(SeTabel over materialertil medie opskrifter). Her beskriver vi kort den organoide kultur metode med specifik henvisning til optimering forCryptosporidiuminjektion og vækst. Vi har konstateret, at for billeddannelse af parasitter i organoider, organiske oider dyrket i ekspansions medium er at foretrække frem for dem i dyrket differentiering medier, da der er mindre ophobning af affald end der ses i organoider dyrket i differentiering medium. Men hvis målet er at isolere oocyster, producerer organoider, der dyrkes i differentierings medier, langt højere antal oocyster.- Vedligehold organoider i 3D-kulturer i ekstracellulær matrix (Se tabellen over materialer) ved 37 °c. Tilføj OME (udvidelses medier) øverst og Opdater hver dag.
Bemærk: For lunge organoider har vi ikke separate udvidelses-og differentierings medier. - At opdele og plade organoider til mikroinjektion, fjerne medier fra 6-brønden plade indeholdende humane organoider og tilføje F12 + + + (Se tabellen over materialer) til brønden og opdele matrixen ved pipettering med en 1 ml pipettespids flere gange. Saml cellerne i et 15 mL rør (2 mL F12 + + + pr. rør er nok til yderligere procedurer).
- Tilsæt 10 – 12 mL F12 + + + til et andet 15 mL rør, og Placer et ildpoleret glas pipet i mediet, og pipetten op og ned 3 gange for at nedbryde de humane tarm-og lunge organoider.
Bemærk: Brug en lang glas pipet (20 – 30 cm) og brand-polish det kort. Gør ikke åbningen (1 mm diameter) meget lille, fordi organoider kan blive beskadiget. Gør spidsen af pipet glat ved kortvarigt at brand polere det. Bryd organoider i mindre stykker af ~ 50 μm. lunge organoider har en tykkere ydre membran og kræver derfor stærkere klipning med glas pipetten sammenlignet med intestinale organoider. Desuden har de en langsommere vækstrate end intestinale organoider (op til 14 dage mellem hver passaging). - Tilsæt F12 + + + op til 5 – 7 mL og centrifugeres ved 350 x g i 5 min.
Bemærk: Centrifugeringshastigheden i dette trin er højere end normalt for at lave en god celle pellet, der er godt adskilt fra den ekstracellulære matrix (Se tabellen over materialer). Vi har observeret, at i forhold til mus tyndtarmen organoider, humane tyndtarmen organoider er sværere at forstyrre. - Fjern så meget medium som muligt uden at forstyrre cellerne, og Genoptag derefter pellet med matrix vedligeholdt ved 4 °C; 200 – 300 μL matrix pr. brønd af en seks-brønd plade er påkrævet. Organoider bør opdeles en ud af tre for at opretholde en temmelig høj celletæthed.
- Plade organoider i matrix dråber på omkring 5 – 10 μL hver i brønden af en seks-brønd plade. Inkuber 20 – 30 minutter ved 37 °C, og tilsæt derefter ekspansions mediet (OME) på toppen.
- Skift mellem mediet hver 2 – 3 dage.
Bemærk: I omkring 5 – 7 dage, organoider vokser i EM nå en størrelse på 100 – 200 μm og er klar til injektion. - For at differentiere organoider, efter 5 – 6 dage i EM, ændre medierne til differentiering medier (DM) betingelser og holde i 5 – 6 yderligere dage før injektion af parasitter.
Bemærk: For udvidelse af organoider anbefales det at plade organoider tæt. Til mikroinjektion anbefales brug af en seks-brønd plade med organoider belagt med en mindre tæthed. For eksempel plade organoider fra tre brønde af en seks-brønd plade i en fuld seks-brønd plade til mikroinjektioner. Matrix skal opbevares ved-20 °C ved langtidsopbevaring og optøet ved 4 °C eller på is før brug. Udvidelse af lunge organoider er gjort, er en lignende måde, men ved hjælp af lunge organoid specifikke mediekomponenter (tabel 1)8 .
- Vedligehold organoider i 3D-kulturer i ekstracellulær matrix (Se tabellen over materialer) ved 37 °c. Tilføj OME (udvidelses medier) øverst og Opdater hver dag.
4. mikroinjektion af oocyster/Sporozoiter i Organoid lumen
-
Mikroinjektion af parasitter i den apikale side af 3D organoid (figur 2).
- Forbered glas kapillærer på 1 mm diameter ved hjælp af en mikropipette Puller.
Bemærk: Indstillinger, der anvendes på mikropipetten aftrækker (Se tabel over materialer) er: Heat = 663, pull = 100, Velocity = 200, time = 40 MS. indstillingerne skal justeres i henhold til bruger instruktionerne for en bestemt maskine. - Skær spidsen af kapillar med tang. Størrelsen/diameteren af kapillar enden måler ca. 9 – 12 μm; Dette muliggør nem strøm af oocyster (4 – 5 μm størrelse).
- Fyld kapillærer med oocysttal eller sporozoite suspension ved hjælp af mikro-loader tips.
- Ilægning af den oocyst fyldte kapillar på en mikroinjektor.
- Microinjicere 100 – 200 nL suspension i hver organoid under et inverteret mikroskop ved 5x forstørrelse, holde trykket konstant. Efter mikroinjektion, Genopfrisk medier med OME eller OMD hver dag og opretholde pladen ved 37 °C.
Bemærk: Vi bruger ikke en micromanipulator til mikroinjektion. Brug af samme kapillar anbefales til hele forsøget for at sikre lige injektion i hver prøve.
- Forbered glas kapillærer på 1 mm diameter ved hjælp af en mikropipette Puller.
5. immunofluorescens farvning af Organoider
- Saml organoider (1 – 2 x 24 brønde) med en P1000-pipette i et 15 mL rør, der indeholder kold F12 + + +.
- Pellet organoider ved 300 x g i 2 min, Fjern supernatanten uden at forstyrre pellet, og forsigtigt pipet pellet løs i den resterende volumen.
- Tilsæt 5 mL 2% PARAFORMALDEHYD i PBS. For at forhindre, at organoider klæber til væggen ikke invertere røret. Lad organoiderne bosætte sig i bunden af røret og fastgør ved 4 °C natten over eller 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern fikseringsmiddel og tilsæt 10 mL permeabiliseringbuffer (0,2% Triton i PBS).
- Drej røret ved stuetemperatur i 20 minutter (Dette sikrer, at alle organoider forbliver i suspension).
- Pellet organoider på 300 x g i 2 min, og derefter kassere supernatanten.
- Resuspendér organoiderne forsigtigt i 500 μL blokerende opløsning (Se tabellen over materialer) og Overfør til et 2 ml mikrocentrifuge glas.
- Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur på en shaker. Tillader organoider at bosætte sig i bunden af røret ved tyngdekraft. Udskift blokerende opløsning med primær antistof opløsning (Se tabel over materialer) og Inkuber i 1 – 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °c.
- Vask 3x med PBS, der indeholder 0,1% Tween. Lad organoider bosætte sig hver gang og fjerne supernatanten.
- Tilsæt sekundær antistof opløsning (Se tabellen over materialer) og Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask 3x med PBS, der indeholder 0,1% Tween. Efterlad 50 μL PBS efter den tredje vask.
- Monter på diaset ved at pipettere organoider suspenderet i 50 μL PBS på diaset. Fjern overskydende PBS, tilføje en dråbe af monterings middel (Se tabellen over materialer) og tilføje dækglas på toppen. Forsegl siderne med neglelak, og lad den tørre.
6. isolering af oocyster fra Organoider
- Isoleres nydannede oocyster fra organoid lumen.
Bemærk:Oocyster isoleres fra organoiderne ved immunomagnetisk adskillelse ved hjælp af et oocysttal isolationssæt (SeTabel over materialer) med de ændringer, der er beskrevet nedenfor. De isolerede oocyster kan derefter analyseres ved immunofluorescens og elektronmikroskopi.- Start med differentierede organoider, der er blevet opretholdt i OMD i 5 – 7 dage, og som er ikke-inficerede, inficeret for 1 dag og inficeret i 5 dage. Brug de to første som negative kontrolelementer.
Bemærk: Vi har konstateret, at differentierede organoider producerer flere oocyster end lunge eller ekspanderende tarm organoider10. - Organoider opsamles i 15 mL centrifugeglas. Organoiderne centrifugeres i 20 minutter ved 3.000 x g og 10 °c.
Bemærk: Denne høje hastighed er nødvendig for at sikre, at ingen oocyster er tabt ud af nogen organoider, der kan være brudt. - Fjern organoid-mediet, og Udskift det med 5 mL vand.
- Forstyrre organoider ved gentagen kraftig pipettering med en ildpoleret glas Pasteur-pipette.
- Hvis klumper er synlige, overføre organoid suspension til en glas dounce homogenisator, og homogenisere indtil organoider er godt forstyrret. Dounce-homogenisator vil ikke påvirke oocysterne.
- Når der ikke er nogen synlige klumper, tilsættes 5 mL buffer A fra det oocystiske isolationssæt. Bland og tilsæt derefter 120 μL af de magnetiske perler belagt med anti-oocyst IgM.
- Inkuber cellesuspensionen og de magnetiske perler i 2 timer ved stuetemperatur med kontinuerlig blanding på en rocker platform.
- I slutningen af inkubationen placeres rørene, der indeholder celler og perler på en magnetisk separations rist designet til 15 mL rør.
- Drej rørene i magnetisk separations stativ manuelt i 3 min. Perlerne vil holde sig til siden af røret ved siden af magneten.
- Forsigtigt, med en 10 mL pipette, Fjern supernatanten fra perlerne. Perlerne opslæmmes i 450 μL buffer B og overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
Bemærk: Opbevar supernatanten indtil isolationen af oocysterne bekræftes. - For at samle eventuelle resterende perler og oocyster skal du vaske 15 mL røret med 450 μL buffer B og tilsætte denne vask til de magnetiske perler i mikrocentrifuge røret.
- Gentag trin 6.1.11 en gang til. Alle perler og tilfangetagne oocyster bør nu overføres til mikrocentrifuge røret.
- Mikrocentrifuge røret placeres på et magnetisk separations stativ, der er konstrueret til opbevaring af mikrocentrifuge glas.
- Drej røret i det magnetiske separations stativ i hånden i 3 min.
- Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette i et nyt rør.
Bemærk: Opbevar supernatanten indtil isolationen af oocysterne bekræftes. - Fjern mikrocentrifuge glasset med magnetiske perler og oocyster fra det magnetiske separations stativ.
- Tilsæt 100 μL 0,1 N HCl til magnetiske perler for at eluere oocysterne ud af perlerne. Vortex til 30 s.
Bemærk: Vortexer skal indstilles til lidt mindre end maksimal hastighed. - Inkuber perlerne i 0,1 N HCl i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vortex igen. Placer derefter røret tilbage på magnetisk separations stativ. Vent på, at perlerne holder sig til siden af røret, og overfør derefter supernatanten til et nyt mikrocentrifuge glas.
- Gentag trin 6.1.17 til 6.1.19, og Kombiner det andet eluat med den første elution.
- Eluatet neutraliseres med 20 μL 1 N NaOH eller en anden neutraliserende buffer såsom 1 M Tris, pH 8.
- For at tælle oocyster skal du tage 10 μL af eluatet, kombinere det med 10 μL oocyst-specifikt antistof (Se tabel over materialer) og tælle fluorescerende oocyster på et hemocytometer.
Bemærk: Isolerede oocyster kan opbevares ved 4 °C eller anvendes straks til immunofluorescens eller elektronmikroskopi-billeddannelse.
- Start med differentierede organoider, der er blevet opretholdt i OMD i 5 – 7 dage, og som er ikke-inficerede, inficeret for 1 dag og inficeret i 5 dage. Brug de to første som negative kontrolelementer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De protokoller, der præsenteres her, resulterer i en effektiv rensning af oocyster og sporozoiter (figur 1a) klar til mikroinjektion. Excystations protokollen resulterer i frigivelse af sporozoiter fra ca. 70 – 80% af oocysterne, derfor er det vigtigt at filtrere de resterende oocyster og skaller gennem et 3 μm filter. Filtrering resulterer i næsten 100% sporozoite rensning (figur 1b). Desuden er tilsætning af et grønt farvestof med til at sikre injektion af alle organoider og muliggør visualisering af injicerede organoider i mindst 24 timer efter injektion (figur 2b).
Disse protokoller til fremstilling af oocyster og sporozoiter er ligetil og har været anvendt i mange år, så det forventes, at de behandlede oocyster og oprenset sporozoiter vil være levedygtige og infektiøse. Men i vores undersøgelser, vi brugte scanning elektronmikroskopi at sikre, at excystation processen ikke skade sporozoiter eller oocyster (figur 2a)10. Injektion af lige mængder af oocyster i organoid lumen kan visuelt bekræftes ved simpel mikroskopisk billeddannelse (figur 2c). En del af inficerede organoider bør oprettes for at verificere parasisite formering ved kvantitativ PCR, som vi har beskrevet10.
Fremskridt gennem parasit livscyklus kan visualiseres ved indsamling af inficerede organoider på forskellige tidspunkter efter infektion og analyse ved transmission elektronmikroskopi eller ved immunofluorescens kombineret med 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol ( Dapi) farvning af parasit kerner10. For eksempel kan antistoffer mod merozoit overfladeantigener, såsom gp40 og GP1517 , anvendes til at identificere meront-stadier; type I meronts vil have 8 kerner og type II meronter, 4 kerner10. For nylig er et panel af monoklonale antistoffer, der er specifikke for trophozoitter, merozoiter, type I versus II-meronter og makro gamonter, blevet tilgængelige18. Disse antistoffer ville også være meget effektiv i mærkningen fremskridt af parasiden gennem sine forskellige livscyklusstadier i organoider.
Immunofluorescens assays kan også bruges til at undersøge, hvilke celletyper der er inficeret med Cryptosporidium. Dette var især vigtigt at se på i luftvejene organoider som meget lidt vides om respiratorisk cryptosporidiosis, og den nøjagtige vært celle for parasiten var ikke kendt. Vi gennemførte immunofluorescens assays på Cryptosporidium-inficerede organoider, co-lokalisering CC10, en markør for klub celler og fandt, at Cryptosporidium inficeret både CC10-negative og positive celler (figur 3). Disse resultater blev bekræftet af TEMs, hvor vi observerede Cryptosporidium inficere sekretoriske og ikke-sekretoriske celler i luftvejene organoider10.
Efter at differentierede organoider er blevet inficeret i fem dage, bør der produceres et betydeligt antal oocyster. I vores hænder, infektion af organoider fra 1 6-brønd plade gav omkring 4000 oocyster, som let kunne identificeres og tælles på en hemocytometer ved mærkning med en oocyst-specifikke antistof. Tilstedeværelsen af fire sporozoiter i oocysterne kunne bekræftes ved at udtørre en del af oocysterne på et klæbe glas, fastgøre med methanol og kombinere DAPI-farvning med oocysttal specifikt antistof (figur 4). Verifikation af produktionen af tykke murede oocyster kan ske ved TEM-analyse10.
Figur 1: klargøring og rensning af Cryptosporidium oocyster og sporozoiter. A) skematisk gengivelse af den metode, der anvendes til behandling af oocysttal og sporozoit til infektion. (B) billede, der viser in vitro-excystation af oocyster. Filtrering af unexcysted oocyts og skaller giver en renset opløsning af sporozoiter. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: mikroinjektion af oocyster i organoid lumen. Dette tal er blevet ændret fra Heo et al.10. (A) scanning af elektronmikroskopi (SEM) billeder af oocyster og sporozoiter. (B) billede, der viser oocyst-injicerede organoider. Den grønne farvestof hjælper med at visualisere injektion af hver organoid og fortsætter over mindst 24 h. (C) billede af en organoid injiceres med oocyster. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: immunofluorescens billede af Cryptosporidium-inficeret luftvejs organoid. Mucin er mærket med anti-mucin 5 antistoffer (rød) i lumen af organoid, er klub celler mærket med anti-CC10 (gul), Cryptosporidium detekteres med oocyst-specifikke antistof (grøn), og cellekerner er PLETTET med dapi (blå). Panel B er en udvidelse af det område, der er angivet på pladsen i panel A. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: immunofluorescens billede af oocysttal isoleret fra differentierede intestinale organoider. Oocyst væg er mærket med oocyst-specifikke antistof i grøn og de fire sporozoit kerner visualiseret med DAPI (blå) venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kultur af Cryptosporidium parasitter i tarm og luftvejs organoider giver en præcis model til at studere vært-parasisite interaktioner10 men også har mange andre applikationer. For eksempel, nuværende metoder til udvælgelse og formeringsmateriale genetisk modificerede Cryptosporidium parasitter kræver passage i mus19 , som ikke tillader isolering af parasitter, der har ændringer afgørende for in vivo infektion. Organoid kultur af Cryptosporidium giver et alternativ til denne procedure. Vi har dog bemærket, at elektro porterede sporozoiter klumper sammen og blokerer mikropipetten. Med henblik på udvælgelse af genetisk modificerede parasitter kan organoider dyrkes på kollagenbelagte transboringer i et todimensionalt format under differentierings betingelser for at tillade infektion med transficeret sporozoiter og dermed udvælgelsen af de genetisk modificerede oocyster. Transboringer giver adgang til både de apiske og basolaterale overflader og er stabile i længere perioder.
I øjeblikket, vi kultur organoider i et todimensionalt format for høj gennemstrømning screening af lægemidler til kræft væv-afledte organoider (ikke-offentliggjorte data). Denne metode til organoid kultur kan også tilpasses til afprøvning af anti-Cryptosporidium lægemidler ved hjælp af de genetisk modificerede der Tagged Cryptosporidium stammer19. Desuden, selv om infektionen ikke er stramt synkroniseret, infektion af organoider med sporozoiter giver tilstrækkelig synkronisering af livscyklus, at narkotika kan testes for deres effektivitet mod specifikke livscyklusstadier.
Organoid Co-kultur systemer er nu under udvikling under hensyntagen til nogle andre aspekter af værtssystemet såsom mikrobiota og immunceller20. Således, evnen til at dissekere interaktioner mellem parasit og Host celler, immunceller og mikrobiota vil snart være muligt in vitro. Genetisk manipulation af Cryptosporidium er også nu muligt19, og kombinationen af fluorescerende reporter stammer af Cryptosporidium og organoid kultur vil give værktøjerne til enkelt celle sekvensering af inficerede celler, og endnu mere specifikt enkelt celle sekvensering af celler inficeret med specifikke stadier af parasiden.
Succesen med de her beskrevne eksperimenter afhænger i høj grad af oocysts levedygtighed og infektivitet. Forskellige partier af Cryptosporidium oocyster kan variere meget i excystation satser og evne til at inficere værtsceller. Tilstrækkelige udbytter af sporozoiter er afhængig af god excystation satser og excystation sats er ikke altid korreleret til smitteevne. Hvis der observeres lave niveauer af infektion eller dårlig excystation med et bestemt parti af oocyster, kan tid og kræfter spares ved at få et nyt parti af oocyster i stedet for at forsøge at øge oocystiske tal eller forlænge inkubationstiderne.
Organoid kultur medier bør opdateres hver suppleant dag. Brug af tidligere passager af organoide kulturer er tilrådeligt. Det er vigtigt at tø et nyt hætteglas med organoider, hvis organoider begynder at skelne i senere passager, da sundhed af organoid kulturer langt bestemme levedygtigheden af parasitat. Efter infektion, organoid medier skal opdateres hver dag for at undgå ophobning af giftige stoffer i medierne.
Organoid kultur af Cryptosporidium er begrænset i, at parasiten ikke kan udbredes på ubestemt tid, og infektionen Peters ud efter tre passager over 28 dage10. Mikroinjektion af tilstrækkelige organoider til muse eksperimenter som vi har beskrevet kan være tidskrævende og fysisk beskatning. Ikke desto mindre, til dato, ingen anden metode muliggør den komplette livscyklus i et in vitro-system helt repræsentative for menneskelig infektion, eller har nogen kultur system er blevet beskrevet, der giver udforskning af værten-patogen interaktioner vigtigt for luftvejsinfektion. Organoid kultur Cryptosporidium giver et kraftfuldt nyt værktøj, der åbner op for muligheder for udforskning af Host-parasisite interaktioner ikke tidligere muligt for Cryptosporidium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Deborah A. Schaefer fra School of Animal og komparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA for at hjælpe os med oocysttal produktion og analyse. Vi takker også Franceschi Microscopy og Imaging Center og D.L. Mullendore på Washington State University for TEM forberedelse og billeddannelse af isolerede organoid oocyster.
D.D. er modtager af et VENI-stipendium fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. er modtager af et VENI-stipendium fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO-ALW, 863.14.002) og blev støttet af Marie Curie-stipendier fra Europa-Kommissionen (forslag 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Den forskning, der førte til disse resultater, har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd under EFR'S avancerede tilskudsaftale nr. 67013 og fra NIH NIAIH under R21 AT009174 til RMO. Dette arbejde er en del af Oncode Institute, som delvis finansieres af det hollandske Cancer selskab og blev finansieret af et stipendium fra det hollandske Cancer selskab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* - cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make up to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O'Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
