Summary

دراسة عدوى Cryptosporidium في أنظمة الثقافة العضوية البشرية المشتقة من الأنسجة ثلاثية الدناطية عن طريق الحقن المجهري

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

نحن نصف بروتوكولات لإعداد oocysts وتنقية sporozoites لدراسة العدوى من أجهزة الجهاز الهضمي والهواء البشري من قبل Cryptosporidium parvum. نقوم بتوضيح إجراءات الحقن المجهري للطفيليات في تجويف الأعضاء المعوية وتلطيخ المناعة من الأعضاء. وأخيرا، ونحن نصف عزل ة الخراجات المتولدة من الأعضاء.

Abstract

Cryptosporidium parvum هو واحد من الأسباب الرئيسية لمرض الإسهال البشري. لفهم أمراض الطفيلي وتطوير الأدوية الفعالة ، هناك حاجة إلى نظام زراعة في المختبر يلخص الظروف في المضيف. الأعضاء، التي تشبه إلى حد كبير الأنسجة من أصلها، مثالية لدراسة التفاعلات بين المضيف والطفيلي. الأعضاء هي هياكل ثلاثية الأبعاد مشتقة من الأنسجة مشتقة من الخلايا الجذعية للبالغين وتنمو في الثقافة لفترات طويلة من الزمن دون أن تتعرض لأي انحراف وراثي أو تحول. لديهم القطبية محددة جيدا مع كل من الأسطح البهيجة وbasolateral. الأعضاء لديها تطبيقات مختلفة في اختبار المخدرات، والأعمال المصرفية الحيوية، ونمذجة الأمراض ودراسات التفاعل بين المضيف والميكروبات. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لكيفية إعداد oocysts وsporozoites من Cryptosporidium لإصابة الأمعاء البشرية والجهاز الهوائي. ثم نبين كيف يمكن استخدام الحقن المجهري لحقن الميكروبات في التجويف العضوي. هناك ثلاث طرق رئيسية يمكن من خلالها استخدام الأعضاء في دراسات التفاعل بين المضيف والميكروبات – الحقن المجهري، القص الميكانيكي والطلاء، وعن طريق صنع الطبقات الأحادية. الحقن المجهري يتيح الحفاظ على هيكل 3D ويسمح للسيطرة الدقيقة على أحجام الطفيليات والاتصال الجانبي apical مباشرة للميكروبات. نحن نقدم تفاصيل للنمو الأمثل للأعضاء إما التصوير أو إنتاج الكيسة. وأخيرا، ونحن نبين أيضا كيف يمكن عزل oocysts ولدت حديثا من الجهازية لمزيد من المعالجة النهائية والتحليل.

Introduction

وقد أعاق تطوير الأدوية أو اللقاحات لعلاج والوقاية من عدوى Cryptosporidium بسبب عدم وجود أنظمة في المختبر التي تحاكي على وجه التحديد في حالة الجسم الحي في البشر1،2. العديد من النظم المتاحة حاليا إما تسمح فقط العدوى على المدى القصير (<5 أيام) أو لا تدعم دورة الحياة الكاملة للطفيلي3،4. وتقوم الأنظمة الأخرى التي تمكن من التطور الكامل للطفيلي على خطوط الخلايا الخالدة أو خطوط الخلايا السرطانية التي لا تلخص بأمانة الوضع الفسيولوجي في البشر5و6و7 . الأعضاء أو “الأعضاء المصغرة” هي هياكل مشتقة من الأنسجة ثلاثية الأبعاد والتي تزرع في مصفوفة خارج الخلية تكملها عوامل نمو مختلفة خاصة بالأنسجة. وقد وضعت الأعضاء من مختلف الأجهزة والأنسجة. وهي مستقرة وراثيا وخلاصة معظم وظائف الأجهزة من أصلها، ويمكن الحفاظ عليها في الثقافة لفترات طويلة من الزمن. لقد طورنا طريقة لإصابة أجهزة الجهاز ية والرئة المعوية البشرية مع Cryptosporidium التي توفر نموذج دقيق في المختبر لدراسة التفاعلات بين المضيف والطفيليات ذات الصلة بالأمعاء والجهاز التنفسي cryptosporidiosis8 ،9،10،11،12،13. على النقيض من النماذج الثقافية المنشورة الأخرى، يمثل النظام العضوي تفاعلات الطفيليات المضيفة في الحياة الحقيقية، ويسمح بإكمال دورة الحياة بحيث يمكن دراسة جميع مراحل دورة حياة الطفيلي، ويحافظ على انتشار الطفيليات لمدة تصل إلى 28 يوما10.

Cryptosporidium parvum هو طفيلي أبي مركب يصيب ظهارة الجهاز التنفسي والأمعاء، مما يسبب مرض الإسهال لفترات طويلة. المرحلة البيئية المقاومة هي الكيسة، وجدت في المواد الغذائية والمياه الملوثة14. مرة واحدة بلعها أو استنشاقها، وexcysts oocysts ويطلق أربعة sporozoites التي تعلق على الخلايا الظهارية. Sporozoites تنزلق على الخلايا المضيفة والانخراط مستقبلات الخلية المضيفة، ولكن الطفيلي لا يغزو الخلية تماما، ويبدو أن حث الخلية المضيفة لغمرها15. يبقى الطفيلي، الذي يتم استيعابه داخل مقصورة داخل الخلايا ولكن خارج السيتوبلازم، على السطح الاستئصالي للخلية، وتكرار داخل vacuole الطفيلية. وهو يخضع لجولتين من التكاثر غير الجنسي – وهي عملية تسمى merogony. خلال merogony، نوع I meronts تطوير التي تحتوي على ثمانية merozoites التي يتم تحريرها لغزو خلايا جديدة. هذه merozoites غزو خلايا جديدة لتطوير إلى نوع 2 meronts تحتوي على أربعة merozoites. هذه merozoites، عندما صدر، تصيب الخلايا وتتطور إلى macrogamonts وmicrogamonts. يتم تحرير Microgametes وتخصيب الماكروجاميتس إنتاج الزيجوت التي تنضج في oocysts. يتم إطلاق الخراجات الناضجة في وقت لاحق في التجويف. الخراجات هي إما رقيقة الجدران التي excyst على الفور لإعادة تطهير ظهارة، أو سميكة الجدران التي يتم تحريرها في البيئة لتصيب المضيف المقبل14. وقد تم تحديد جميع مراحل دورة حياة Cryptosporidium في نظام الثقافة العضوية التي وضعت سابقا من قبل مجموعتنا10.

منذ الأعضاء البشرية بصدق تكرار الأنسجة البشرية11،13،ودعم جميع المراحل المستنسخة من Cryptosporidium10،فهي نظام زراعة الأنسجة المثالي لدراسة علم الأحياء Cryptosporidium والتفاعلات بين المضيف والطفيلي. هنا نقوم بوصف إجراءات إصابة الأعضاء مع كل من Cryptosporidium oocysts وsporozoites excysted، وعزل oocysts الجديدة المنتجة في هذا النظام زراعة الأنسجة.

Protocol

تم إجراء جميع مناولة الأنسجة واستئصالها في إطار البروتوكولات المعتمدة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) بموافقة المريض. 1. إعداد C. parvum Oocysts للحقن ملاحظة: تم شراء الخراجات Cryptosporidium من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). يتم إنتاج هذه الخراجات ف…

Representative Results

البروتوكولات المعروضة هنا تؤدي إلى تنقية فعالة من الخراجات وsporozoites(الشكل 1A)على استعداد للحقن الدقيق. يؤدي بروتوكول excystation إلى إطلاق sporozoites من حوالي 70-80٪ من الخراجات، وبالتالي فمن الضروري تصفية الخراجات والقذائف المتبقية من خلال مرشح 3 ميكرومتر. نتائج الترشيح في ما يقرب من 10…

Discussion

ثقافة الطفيليات Cryptosporidium في الجهازيات المعوية ومجرى الهواء يوفر نموذجا دقيقا لدراسة التفاعلات المضيفة الطفيلية10 ولكن أيضا لديها العديد من التطبيقات الأخرى. على سبيل المثال، تتطلب الطرق الحالية لاختيار ونشر طفيليات Cryptosporidium المعدلة وراثيا ً مروراً في الفئران<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن ممتنون لديبورا أ. شايفر من كلية العلوم الطبية الحيوية الحيوانية والمقارنة، كلية الزراعة وعلوم الحياة، جامعة أريزونا، توسون، AZ، الولايات المتحدة الأمريكية لمساعدتنا في إنتاج وتحليل الخراجات. كما نشكر مركز فرانشي للتنظير المجهري والتصوير وD.L. Mullendore في جامعة ولاية واشنطن لإعداد وتصوير الخراجات العضوية المعزولة.

وقد حصل على منحة من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). وقد حصلت المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO-ALW، 863.14.002) على منحة من المعهد الهولندي للبحوث العلمية، وحظيت بدعم زمالات ماري كوري من المفوضية الأوروبية (الاقتراح 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). وقد تلقى البحث الذي أدى إلى هذه النتائج تمويلاً من المجلس الأوروبي للبحوث بموجب اتفاقية المنح المتقدمة الخاصة بلجنة البحوث الدولية رقم 67013 ومن المعهد الوطني للصحة في إطار R21 AT009174 إلى RMO. هذا العمل هو جزء من معهد Oncode، الذي يمول جزئيا من قبل الجمعية الهولندية للسرطان وتم تمويله من منحة من جمعية السرطان الهولندية.

Materials

Basement membrane extract (extracellular matrix) amsbio 3533-010-02  
Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) Waterborne, Inc A400FLR-1X Final Concentration = Use 2-3 drops/slide
Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads Waterborne, Inc IMS400-20  
Dynamag 15 rack Thermofisher Scientific 12301D  
Dynamag 2 rack Thermofisher Scientific 12321D  
EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm EMD-Millipore TSTP02500  
Fast green dye SIGMA F7252-5G    
Femtojet 4i Microinjector Eppendorf 5252000013  
Glass capillaries of 1 mm diameter WPI TW100F-4  
Matrigel (extracellular matrix) Corning 356237  
Microfuge tube 1.5ml Eppendorf T9661-1000EA  
Micro-loader tips Eppendorf 612-7933  
Micropipette puller P-97 Shutter instrument P-97  
Normal donkey Serum Bio-Rad C06SB  
Penstrep Gibco 15140-122  
Sodium hypoclorite (use 5%) Clorox 50371478  
Super stick slides Waterborne, Inc S100-3  
Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder EMD-Millipore SX0002500  
Taurocholic acid sodium salt hydrate SIGMA T4009-5G  
Tween-20 Merck 8221840500  
Vectashield mounting agent Vector Labs H-1000  
Vortex Genie 2 Scientific industries, Inc SI0236  
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)     Final amount
DMEM Invitrogen 12634-010 500ml
Penstrep Gibco 15140-122 5ml of stock in 500ml DMEM
Glutamax Gibco 35050038 5ml of stock in 500ml DMEM
Hepes Gibco 15630056 5ml of stock in 500ml DMEM
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)     Final concentration
A83-01 Tocris 2939-50mg 0.5µM
Adv+++     make upto 100 ml
B27 Invitrogen 17504044 1X
EGF Peprotech AF-100-15 50ng/mL
Gastrin Tocris 3006-1mg 10 nM
NAC Sigma A9125-25G 1.25mM
NIC Sigma N0636-100G 10mM
Noggin CM In house*   10%
P38 inhibitor (SB202190) Sigma S7076-25 mg 10µM
PGE2 Tocris 2296/10 10 nM
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1ml/500ml media
RSpoI CM In house*   20%
Wnt3a CM In house*   50%
In house* – cell lines will be provided upon request      
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)     To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)
LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)     Final concentration
Adv+++     make upto 100 ml
ALK-I A83-01 Tocris 2939-50mg 500nM
B27 Invitrogen 17504044 0.0763888889
FGF-10 Peprotech 100-26 100ng/ml
FGF-7 Peprotech 100-19 25ng/ml
N-Acetylcysteine Sigma A9125-25G 1.25mM
Nicotinamide Sigma N0636-100G 5mM
Noggin UPE U-Protein Express Contact company directly 10%
p38 MAPK-I Sigma S7076-25 mg 1µM
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1:500
RhoKI Y-27632 Abmole Bioscience M1817_100 mg 2.5µm
Rspo UPE U-Protein Express Contact company directly 10%
Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)     Final concentration
L-Glutathione reduced Sigma G4251-10MG 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
Betaine Sigma 61962 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
L-Cysteine Sigma 168149-2.5G 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
Linoleic acid Sigma L1376-10MG 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM
Taurine Sigma T0625-10MG 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
Blocking buffer (for immunoflourescence staining)     Final concentration
Donkey/Goat serum Bio-Rad C06SB 2%
PBS Thermo-Fisher 70011044 Make upto 100ml
Tween 20 Merck P1379 0.1%
List of Antibodies used      
Alexa 568 goat anti-rabbit Invitrogen A-11011 Dilution-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo Waterborne, Inc A400FLK Dilution- 1:200
Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive Waterborne, Inc IMS400-20 Dilution-1:500
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306 Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674 Invitrogen A22287 Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155
Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). Upon request Upon request Dilution-1:500
Sporo-Glo Waterborne, Inc A600FLR-1X Dilution- 1:200

References

  1. Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
  2. Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
  3. Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
  4. Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. Evolution of Cryptosporidium in vitro culture. International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).
  5. Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
  6. DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
  7. Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
  8. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , (2018).
  9. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  12. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. O’Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
  15. Lendner, M., Daugschies, A. Cryptosporidium infections: molecular advances. Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).
  16. Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
  17. O’Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
  18. Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
  19. Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
  20. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).

Play Video

Cite This Article
Dutta, D., Heo, I., O’Connor, R. Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection. J. Vis. Exp. (151), e59610, doi:10.3791/59610 (2019).

View Video