Summary

Étudier l'infection à Cryptosporidium dans les systèmes de culture organoïde humaine dérivés de tissus 3D par microinjection

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Nous décrivons des protocoles pour préparer des oocysts et purifier des sporozoites pour étudier l’infection des organoïdes intestinaux et de voie aérienne humains par Cryptosporidium parvum. Nous démontrons les procédures pour la microinjection des parasites dans le lumen intestinal organoïde et l’immunostaining des organoïdes. Enfin, nous décrivons l’isolement des oborcystes générés des organoïdes.

Abstract

Cryptosporidium parvum est l’une des principales causes de la maladie diarrhéique humaine. Pour comprendre la pathologie du parasite et développer des médicaments efficaces, un système de culture in vitro qui récapitule les conditions dans l’hôte est nécessaire. Les organoïdes, qui ressemblent étroitement aux tissus de leur origine, sont idéaux pour étudier les interactions hôte-parasite. Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles (3D) dérivées de tissus qui sont dérivées de cellules souches adultes et se développent en culture pendant de longues périodes de temps sans subir d’aberration génétique ou de transformation. Ils ont une polarité bien définie avec des surfaces apicales et basolatérales. Les organoïdes ont diverses applications dans le dépistage des drogues, la biobanque, et la modélisation des maladies et les études d’interaction hôte-microbe. Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la façon de préparer les oocystes et les sporozoites de Cryptosporidium pour infecter les organoïdes intestinaux et respiratoires humains. Nous démontrons ensuite comment la microinjection peut être utilisée pour injecter les microbes dans le lumen organoïde. Il existe trois méthodes principales par lesquelles les organoïdes peuvent être utilisés pour les études d’interaction hôte-microbe : microinjection, tonte mécanique et placage, et en fabriquant des monocouches. La microinjection permet le maintien de la structure 3D et permet un contrôle précis des volumes de parasites et un contact latéral actoical direct pour les microbes. Nous fournissons des détails pour la croissance optimale des organoïdes pour la production d’imagerie ou d’oocyst. Enfin, nous démontrons également comment les oocysts nouvellement générés peuvent être isolés de l’organoïde pour un traitement et une analyse en aval.

Introduction

Le développement de médicaments ou de vaccins pour le traitement et la prévention de l’infection à Cryptosporidium a été entravé par l’absence de systèmes in vitro qui imitent précisément la situation in vivo chez l’homme1,2. Bon nombre des systèmes actuellement disponibles ne permettent que l’infection à court terme (5 jours) ou ne soutiennent pas le cycle de vie complet du parasite3,4. D’autres systèmes qui permettent le développement complet du parasite sont basés sur des lignées cellulaires immortalisées ou des lignées de cellules cancéreuses qui ne récapitulent pas fidèlement la situation physiologique chez l’homme5,6,7 . Les organoïdes ou « mini-organes » sont des structures dérivées de tissus 3D qui sont cultivées dans une matrice extracellulaire complétée par divers facteurs de croissance spécifiques aux tissus. Des organoïdes ont été développés à partir de divers organes et tissus. Ils sont génétiquement stables et récapitulent la plupart des fonctions des organes de leur origine, et peuvent être maintenus en culture pendant de longues périodes de temps. Nous avons développé une méthode pour infecter les organoïdes intestinaux et pulmonaires humains avec Cryptosporidium qui fournit un modèle in vitro précis pour l’étude des interactions hôte-parasite pertinentes à la cryptosporidiose intestinale et respiratoire8 ,9,10,11,12,13. Contrairement à d’autres modèles de culture publiés, le système organoïde est représentatif des interactions réelles des parasites hôtes, permet d’achever le cycle de vie afin que toutes les étapes du cycle de vie du parasite puissent être étudiées, et maintient la propagation du parasite pour un jusqu’à 28 jours10.

Cryptosporidium parvum est un parasite apicomplexan qui infecte l’épithélium des voies respiratoires et intestinales, causant une maladie diarrhéique prolongée. Le stade environnemental résistant est l’oocyste, trouvé dans les aliments et l’eau contaminés14. Une fois ingérés ou inhalés, l’oocyste excyste et libère quatre sporozoites qui se fixent aux cellules épithéliales. Sporozoites glisser sur les cellules hôtes et engager les récepteurs cellulaires hôtes, mais le parasite n’envahit pas complètement la cellule, et semble induire la cellule hôte pour l’engloutir15. Le parasite, qui est intériorisé dans un compartiment intracellulaire mais extracytoplasmique, reste à la surface apicale de la cellule, se reproduisant dans un vacuole parasitophore. Il subit deux séries de reproduction asexuée, un processus appelé mérogonie. Pendant la mérogonie, les meronts de type I se développent qui contiennent huit mériozoites qui sont libérés pour envahir de nouvelles cellules. Ces mériozoites envahissent de nouvelles cellules pour se développer en meronts de type II contenant quatre mériozoites. Ces mériozoites, lorsqu’ils sont libérés, infectent les cellules et se développent en macrogamonts et microgamonts. Les microgametes sont libérés et fécondent les macrogametes produisant des zygotes qui mûrissent en oocystes. Les oocystes matures sont ensuite libérés dans le lumen. Les okys sont soit à parois minces qui excystent immédiatement pour réinfecter l’épithélium, soit à d’épais parois s’éparpés qui sont libérés dans l’environnement pour infecter le prochain hôte14. Toutes les étapes du cycle de vie de Cryptosporidium ont été identifiées dans le système de culture organoïde précédemment développé par notre groupe10.

Depuis organoïdes humains reproduisent fidèlement les tissus humains9,11,13, et de soutenir toutes les étapes réplicatrices de Cryptosporidium10, ils sont le système idéal de culture tissulaire pour étudier Biologie du cryptosporidium et interactions hôte-parasite. Ici nous décrivons les procédures pour infecter des organoïdes avec des oocysts de Cryptosporidium et des sporozoites excystés, et isoler les nouveaux oocysts produits dans ce système de culture de tissu.

Protocol

Toute la manipulation et la résection des tissus ont été effectuées en vertu des protocoles approuvés par la Commission d’examen institutionnel (CISR) avec le consentement du patient. 1. Préparation de C. parvum Oocysts pour l’injection REMARQUE: Les oocystes de Cryptosporidium ont été achetés auprès d’une source commerciale (voir le Tableau des matériaux). Ces oocystes sont produits chez les veaux et sont…

Representative Results

Les protocoles présentés ici donnent lieu à une purification efficace des oocystes et des sporozoites (Figure 1A) prêts pour la microinjection. Le protocole d’excystation entraîne la libération de sporozoites à partir d’environ 70 à 80 % des oocystes, il est donc essentiel de filtrer les oocystes et les coquilles restants à l’intérieur d’un filtre de 3 m. La filtration entraîne près de 100 % de purification de la sporozoite (figure 1B). En outre, l’a…

Discussion

La culture des parasites de Cryptosporidium dans les organoïdes intestinaux et de voie aérienne fournit un modèle précis pour étudier des interactions hôte-parasite10 mais a également beaucoup d’autres applications. Par exemple, les méthodes actuelles de sélection et de propagation des parasites cryptosporidium génétiquement modifiés nécessitent un passage chez la souris19 qui ne permet pas l’isolement des parasites qui ont des modifications e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à Deborah A. Schaefer de l’École des sciences biomédicales animales et comparées, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, Usa pour nous aider avec la production et l’analyse d’oocyst. Nous remercions également Franceschi Microscopy and Imaging Center et D.L. Mullendore de l’Université d’État de Washington pour la préparation et l’imagerie tem des ovocytes organoïdes isolés.

D.D. est le bénéficiaire d’une subvention VENI de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. est le bénéficiaire d’une subvention VENI de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO-ALW, 863.14.002) et a été soutenu par les bourses Marie Curie de la Commission européenne (Proposition 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). La recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Conseil européen de la recherche dans le cadre de l’accord de subvention avancée no 67013 de l’ERC et de la NIAIH des NIH dans le cadre de R21 AT009174 à RMO. Ce travail fait partie de l’Institut Oncode, qui est en partie financé par la Société néerlandaise du cancer et a été financé par une subvention de la Société néerlandaise du cancer.

Materials

Basement membrane extract (extracellular matrix) amsbio 3533-010-02  
Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) Waterborne, Inc A400FLR-1X Final Concentration = Use 2-3 drops/slide
Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads Waterborne, Inc IMS400-20  
Dynamag 15 rack Thermofisher Scientific 12301D  
Dynamag 2 rack Thermofisher Scientific 12321D  
EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm EMD-Millipore TSTP02500  
Fast green dye SIGMA F7252-5G    
Femtojet 4i Microinjector Eppendorf 5252000013  
Glass capillaries of 1 mm diameter WPI TW100F-4  
Matrigel (extracellular matrix) Corning 356237  
Microfuge tube 1.5ml Eppendorf T9661-1000EA  
Micro-loader tips Eppendorf 612-7933  
Micropipette puller P-97 Shutter instrument P-97  
Normal donkey Serum Bio-Rad C06SB  
Penstrep Gibco 15140-122  
Sodium hypoclorite (use 5%) Clorox 50371478  
Super stick slides Waterborne, Inc S100-3  
Swinnex-25 47mm Polycarbonate filter holder EMD-Millipore SX0002500  
Taurocholic acid sodium salt hydrate SIGMA T4009-5G  
Tween-20 Merck 8221840500  
Vectashield mounting agent Vector Labs H-1000  
Vortex Genie 2 Scientific industries, Inc SI0236  
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)     Final amount
DMEM Invitrogen 12634-010 500ml
Penstrep Gibco 15140-122 5ml of stock in 500ml DMEM
Glutamax Gibco 35050038 5ml of stock in 500ml DMEM
Hepes Gibco 15630056 5ml of stock in 500ml DMEM
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)     Final concentration
A83-01 Tocris 2939-50mg 0.5µM
Adv+++     make upto 100 ml
B27 Invitrogen 17504044 1X
EGF Peprotech AF-100-15 50ng/mL
Gastrin Tocris 3006-1mg 10 nM
NAC Sigma A9125-25G 1.25mM
NIC Sigma N0636-100G 10mM
Noggin CM In house*   10%
P38 inhibitor (SB202190) Sigma S7076-25 mg 10µM
PGE2 Tocris 2296/10 10 nM
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1ml/500ml media
RSpoI CM In house*   20%
Wnt3a CM In house*   50%
In house* – cell lines will be provided upon request      
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)     To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)
LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)     Final concentration
Adv+++     make upto 100 ml
ALK-I A83-01 Tocris 2939-50mg 500nM
B27 Invitrogen 17504044 0.0763888889
FGF-10 Peprotech 100-26 100ng/ml
FGF-7 Peprotech 100-19 25ng/ml
N-Acetylcysteine Sigma A9125-25G 1.25mM
Nicotinamide Sigma N0636-100G 5mM
Noggin UPE U-Protein Express Contact company directly 10%
p38 MAPK-I Sigma S7076-25 mg 1µM
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1:500
RhoKI Y-27632 Abmole Bioscience M1817_100 mg 2.5µm
Rspo UPE U-Protein Express Contact company directly 10%
Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)     Final concentration
L-Glutathione reduced Sigma G4251-10MG 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
Betaine Sigma 61962 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
L-Cysteine Sigma 168149-2.5G 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
Linoleic acid Sigma L1376-10MG 6.8 μg/ml of OME/OMD /LOM
Taurine Sigma T0625-10MG 0.5 μg/μl of OME/OMD/LOM
Blocking buffer (for immunoflourescence staining)     Final concentration
Donkey/Goat serum Bio-Rad C06SB 2%
PBS Thermo-Fisher 70011044 Make upto 100ml
Tween 20 Merck P1379 0.1%
List of Antibodies used      
Alexa 568 goat anti-rabbit Invitrogen A-11011 Dilution-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo Waterborne, Inc A400FLK Dilution- 1:200
Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive Waterborne, Inc IMS400-20 Dilution-1:500
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306 Dilution-1:1000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674 Invitrogen A22287 Dilution-1:1000; RRID: AB_2620155
Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). Upon request Upon request Dilution-1:500
Sporo-Glo Waterborne, Inc A600FLR-1X Dilution- 1:200

References

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Cite This Article
Dutta, D., Heo, I., O’Connor, R. Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection. J. Vis. Exp. (151), e59610, doi:10.3791/59610 (2019).

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