Summary
Nous décrivons des protocoles pour préparer des oocysts et purifier des sporozoites pour étudier l'infection des organoïdes intestinaux et de voie aérienne humains par Cryptosporidium parvum. Nous démontrons les procédures pour la microinjection des parasites dans le lumen intestinal organoïde et l'immunostaining des organoïdes. Enfin, nous décrivons l'isolement des oborcystes générés des organoïdes.
Abstract
Cryptosporidium parvum est l'une des principales causes de la maladie diarrhéique humaine. Pour comprendre la pathologie du parasite et développer des médicaments efficaces, un système de culture in vitro qui récapitule les conditions dans l'hôte est nécessaire. Les organoïdes, qui ressemblent étroitement aux tissus de leur origine, sont idéaux pour étudier les interactions hôte-parasite. Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles (3D) dérivées de tissus qui sont dérivées de cellules souches adultes et se développent en culture pendant de longues périodes de temps sans subir d'aberration génétique ou de transformation. Ils ont une polarité bien définie avec des surfaces apicales et basolatérales. Les organoïdes ont diverses applications dans le dépistage des drogues, la biobanque, et la modélisation des maladies et les études d'interaction hôte-microbe. Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la façon de préparer les oocystes et les sporozoites de Cryptosporidium pour infecter les organoïdes intestinaux et respiratoires humains. Nous démontrons ensuite comment la microinjection peut être utilisée pour injecter les microbes dans le lumen organoïde. Il existe trois méthodes principales par lesquelles les organoïdes peuvent être utilisés pour les études d'interaction hôte-microbe : microinjection, tonte mécanique et placage, et en fabriquant des monocouches. La microinjection permet le maintien de la structure 3D et permet un contrôle précis des volumes de parasites et un contact latéral actoical direct pour les microbes. Nous fournissons des détails pour la croissance optimale des organoïdes pour la production d'imagerie ou d'oocyst. Enfin, nous démontrons également comment les oocysts nouvellement générés peuvent être isolés de l'organoïde pour un traitement et une analyse en aval.
Introduction
Le développement de médicaments ou de vaccins pour le traitement et la prévention de l'infection à Cryptosporidium a été entravé par l'absence de systèmes in vitro qui imitent précisément la situation in vivo chez l'homme1,2. Bon nombre des systèmes actuellement disponibles ne permettent que l'infection à court terme (5 jours) ou ne soutiennent pas le cycle de vie complet du parasite3,4. D'autres systèmes qui permettent le développement complet du parasite sont basés sur des lignées cellulaires immortalisées ou des lignées de cellules cancéreuses qui ne récapitulent pas fidèlement la situation physiologique chez l'homme5,6,7 . Les organoïdes ou « mini-organes » sont des structures dérivées de tissus 3D qui sont cultivées dans une matrice extracellulaire complétée par divers facteurs de croissance spécifiques aux tissus. Des organoïdes ont été développés à partir de divers organes et tissus. Ils sont génétiquement stables et récapitulent la plupart des fonctions des organes de leur origine, et peuvent être maintenus en culture pendant de longues périodes de temps. Nous avons développé une méthode pour infecter les organoïdes intestinaux et pulmonaires humains avec Cryptosporidium qui fournit un modèle in vitro précis pour l'étude des interactions hôte-parasite pertinentes à la cryptosporidiose intestinale et respiratoire8 ,9,10,11,12,13. Contrairement à d'autres modèles de culture publiés, le système organoïde est représentatif des interactions réelles des parasites hôtes, permet d'achever le cycle de vie afin que toutes les étapes du cycle de vie du parasite puissent être étudiées, et maintient la propagation du parasite pour un jusqu'à 28 jours10.
Cryptosporidium parvum est un parasite apicomplexan qui infecte l'épithélium des voies respiratoires et intestinales, causant une maladie diarrhéique prolongée. Le stade environnemental résistant est l'oocyste, trouvé dans les aliments et l'eau contaminés14. Une fois ingérés ou inhalés, l'oocyste excyste et libère quatre sporozoites qui se fixent aux cellules épithéliales. Sporozoites glisser sur les cellules hôtes et engager les récepteurs cellulaires hôtes, mais le parasite n'envahit pas complètement la cellule, et semble induire la cellule hôte pour l'engloutir15. Le parasite, qui est intériorisé dans un compartiment intracellulaire mais extracytoplasmique, reste à la surface apicale de la cellule, se reproduisant dans un vacuole parasitophore. Il subit deux séries de reproduction asexuée, un processus appelé mérogonie. Pendant la mérogonie, les meronts de type I se développent qui contiennent huit mériozoites qui sont libérés pour envahir de nouvelles cellules. Ces mériozoites envahissent de nouvelles cellules pour se développer en meronts de type II contenant quatre mériozoites. Ces mériozoites, lorsqu'ils sont libérés, infectent les cellules et se développent en macrogamonts et microgamonts. Les microgametes sont libérés et fécondent les macrogametes produisant des zygotes qui mûrissent en oocystes. Les oocystes matures sont ensuite libérés dans le lumen. Les okys sont soit à parois minces qui excystent immédiatement pour réinfecter l'épithélium, soit à d'épais parois s'éparpés qui sont libérés dans l'environnement pour infecter le prochain hôte14. Toutes les étapes du cycle de vie de Cryptosporidium ont été identifiées dans le système de culture organoïde précédemment développé par notre groupe10.
Depuis organoïdes humains reproduisent fidèlement les tissus humains9,11,13, et de soutenir toutes les étapes réplicatrices de Cryptosporidium10, ils sont le système idéal de culture tissulaire pour étudier Biologie du cryptosporidium et interactions hôte-parasite. Ici nous décrivons les procédures pour infecter des organoïdes avec des oocysts de Cryptosporidium et des sporozoites excystés, et isoler les nouveaux oocysts produits dans ce système de culture de tissu.
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Protocol
Toute la manipulation et la résection des tissus ont été effectuées en vertu des protocoles approuvés par la Commission d'examen institutionnel (CISR) avec le consentement du patient.
1. Préparation de C. parvum Oocysts pour l'injection
REMARQUE: Les oocystes de Cryptosporidium ont été achetés auprès d'une source commerciale (voir le Tableau des matériaux). Ces oocystes sont produits chez les veaux et sont stockés dans des salins tamponnés de phosphate (PBS) avec des antibiotiques. Ils peuvent être conservés pendant environ 3 mois à 4 oC et ne doivent jamais être congelés. Nous utilisons normalement des oocysts dans un délai d'un mois. Les organoïdes peuvent être infectés par des olécystes intacts, ou les sporozoites peuvent être isolés des olécystes exkysés et utilisés pour infecter les organoïdes s'il est important de ne pas avoir de report d'oocysts de l'inoculum d'origine.
-
Préparer des oocystes de Cryptosporidium pour infecter les cellules (Figure 1A).
- Gardez les oocysts sur la glace tout au long de toutes les manipulations jusqu'à ce qu'ils soient ajoutés aux organoïdes.
- Calculer le nombre d'oocystes nécessaires pour une plaque complète de six puits d'organoïdes (généralement environ 5 x 105-2,5 x 105 pour la plaque). Comptez le nombre d'ougtiques dans un hémocytomètre pour vérifier la quantité et le transfert à un tube de centrifugeuse.
REMARQUE: Pour faciliter la visualisation, les oocysts peuvent être mélangés 1:1 avec un anticorps fluorescent spécifique à l'oocyst (voir le Tableau des matériaux)avant d'être chargés sur l'hémocytomètre. Les oocysts étiquetés fluorophore peuvent alors être facilement visualisés et énumérés à l'aide d'un microscope à fluorescence. Nous suggérons d'injecter environ 100 à 1 000 oocystes/organoïdes. En général, 1 000 à 2 000 organoïdes peuvent être cultivés dans une assiette de six puits. - Apportez le volume de la suspension des oocysts jusqu'à 900 L avec PBS. Ajouter 100 l'eau de javel au sodium (p. ex. Clorox) (à 4 oC). Incuber 10 min sur glace.
- Centrifugeuse de 3 min dans un microcentrifugeà 8 000 x g à 4 oC. Orientez les tubes de la centrifugeuse avec l'ouverture du bouchon vers l'intérieur. Le granule peut être difficile à voir afin de savoir où les parasites ont pelleté dans le tube est essentiel.
- Retirez le supernatant avec une pipette en prenant soin d'éviter le granule. Ajouter 1 ml du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco pour mélanger.
- Centrifugeuse de 3 min dans un microcentrifugeà 8 000 x g à 4 oC.
- Répétez les lavages avec DMEM deux fois de plus.
- Préparer le milieu d'expansion (OME) ou le milieu organoïde de différenciation (OMD) auquel le taurocholate a été ajouté à une concentration finale de 0,5 % (w/v) (voir tableau des matériaux). Le taurocholate doit toujours être préparé et ajouté frais.
REMARQUE: Nous avons utilisé avec succès 0,5% de taurocholate dans nos tests d'infection où l'inoculum est intact oocysts, et vu des taux améliorés d'infection sans effets délétères sur les cellules hôtes. Cependant, le taurocholate peut avoir des effets imprévus sur les cellules, et des concentrations plus faibles ont été utilisées avec succès dans les essais d'infection16. - Resuspendre les oocysts dans 100 l de milieu de culture organoïde complété par 0,5% (w/v) taurocholate de sodium. Compter les oocysts à nouveau comme décrit dans l'étape 1.1.2.
- Ajouter le colorant vert rapide à la suspension afin de visualiser l'injection.
- Remplissez les pointes de microchargeur (voir le tableau des matériaux)avec la suspension d'oocyst et utilisez-la pour remplir les capillaires tirés.
MISE EN GARDE: L'ensemble de la procédure doit être fait dans une hotte de culture de tissu avec des protocoles de sécurité de niveau 2. L'utilisation de masques est recommandée car les oocystes de Cryptosporidium peuvent également être infectieux lorsqu'ils sont en vol.
2. Purification in vitro des sporozoites de C. parvum Oocysts
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Purifiez les sporozoites des oocystes de C. parvum après le blanchiment et le lavage de l'eau de Javel comme décrit ci-dessus.
- Transférer les oocysts dans un tube de 15 ml. Resuspendre les oocysts dans le milieu d'excystation à température ambiante (0,75% w/v taurocholate de sodium dans DMEM) pour obtenir 1 x 107 oocystes/mL. L'ajout de taurocholate améliore le taux d'excystation des oocysts, améliorant le rendement de sporozoite.
- Suspension d'oocyst d'incubation à 37 oC pour 1 à 1,5 h.
- Vérifier l'échantillon au microscope pour vérifier l'étendue de l'excystation; 60-80% excystation est raisonnable pour une bonne récupération des sporozoites. Si le niveau d'excystation est faible, incuber plus longtemps (encore 30 min à 1 h).
- Déterminer le pourcentage d'excystation par rapport au nombre d'oocystes de départ. Excystation est calculé comme :
% excystation [1 - (nombre d'oocystes intacts/nombre d'oocystes intacts au début)] x 100 - Laver les cellules pour enlever les réactifs excystation en ajoutant 14 ml de PBS ou de milieu, en mélangeant et en récupérant les cellules (oocystes intacts, coquilles d'oocyste et sporozoites) par centrifugation à 3 400 x g pendant 20 min pour récupérer les sporozoites. Aspirez soigneusement pour éviter de perdre des cellules.
- Resuspendre la pastille de sporozoite dans 1/2 ml de DMEM pour obtenir 3 x 107 oocystes/mL (basé sur le nombre d'oocystes de départ).
- Pour enlever les oocystes et les coquilles restants, filtrez la suspension à l'intérieur d'un filtre de 3 m (Figure 1B). Utilisez un appareil de décoche de filtre de 47 mm mladage muni d'un filtre en polycarbonate (taille de 3 pores m) fixé à un baril de seringue de 10 ml. Placez l'appareil de porte-filtre sur un tube de 15 ml. Placez l'assemblage dans un seau à glace ou dans une chambre froide.
- Ajouter 7,5 ml de suspension de sporozoite à l'assemblage du filtre et laisser filtrer par gravité. Lavez-vous avec un autre 7,5 ml de DMEM.
REMARQUE: Pour assurer le succès dans l'isolement de sporozoite les oocysts frais et l'excystation bonne sont critiques. S'il y a trop d'oocystes non-xcysted, la suspension ne coulera pas par gravité. L'application de pression sur la seringue peut forcer des oocysts non-xcysted à travers. La microinjection de sporozoites est plus difficile que celle des ocycystes parce que les sporozoites peuvent s'agglutiner et bloquer le capillaire. Pour éviter cela, nous recommandons de faire une pointe capillaire plus large lors de l'injection d'organoïdes avec des sporozoites. Pour atteindre des niveaux suffisants d'infection, 2 à 4 fois le nombre de sporozoites doit être injecté dans chaque organoïde par rapport aux organoïdes infectés par des opostes. - Centrifugelant la suspension filtrée de sporozoite à 3.400 x g utilisant un rotor de seau oscillant pendant 20 min aux sporozoites de granule.
- Resuspendre en 50 à 100 oL de milieu de culture organoïde OME ou OMD (voir le Tableau des Matériaux)complété par 0,05% (w/v) Colorant vert rapide et L-glutathione, bêtaine, L-cystéine, acide linoléique et tampon de réduction contenant de la taurine5 (voir le Tableau des matériaux).
REMARQUE: L'incubation d'oocystes trop longtemps peut entraîner la lyse des sporozoites et une mauvaise récupération et devrait donc être évitée.
3. In Vitro Culture of Human Intestinal and Lung Organoids for Microinjection
- Organoïdes intestinaux de culture sous l'expansion et les conditions de médias de différenciation.
note:Les détails de la propagation intestinale et pulmonaire d'organoïde ont été précédemment décrits dans d'autres articles8,13(voirTableau des matériauxpour les recettes médiatiques). Ici, nous décrivons brièvement la méthode de culture organoïde avec une référence spécifique à l'optimisation pourCryptosporidiuml'injection et la croissance. Nous avons constaté que pour l'imagerie des parasites dans les organoïdes, les organoïdes cultivés dans le milieu d'expansion sont préférables à ceux dans les milieuis de différenciation cultivées car il y a moins d'accumulation de débris que celle observée dans les organoïdes cultivés dans le milieu de différenciation. Cependant, si l'objectif est d'isoler les opostes, les organoïdes cultivés dans les médias de différenciation produisent un nombre beaucoup plus élevé d'oocystes.- Maintenir les organoïdes dans les cultures 3D dans la matrice extracellulaire (voir le Tableau des Matériaux) à 37 oC. Ajouter OME (médias d'expansion) sur le dessus et rafraîchir tous les jours.
REMARQUE: Pour les organoïdes pulmonaires, nous n'avons pas de supports d'expansion et de différenciation distincts. - Pour fendre et plaquer les organoïdes pour la microinjection, retirez les supports de la plaque de 6 puits contenant des organoïdes humains et ajoutez f12MD (Voir la table des matériaux)au puits et décomposez la matrice par pipetage avec une pointe de pipette de 1 ml plusieurs fois. Recueillir les cellules dans un tube de 15 ml (2 ml de F12 md par tube est suffisant pour d'autres procédures).
- Ajoutez 10 à 12 ml de F12 ML dans un autre tube de 15 ml et placez une tuyauterie en verre polie par le feu dans le milieu, pipette de haut en bas 3 fois pour briser les organoïdes intestinaux et pulmonaires humains.
REMARQUE: Utilisez un long tuyau en verre (20 à 30 cm) et polissez-le brièvement. Ne pas faire l'ouverture (1 mm de diamètre) très petit parce que les organoïdes peuvent être endommagés. Rendre la pointe de la tuyauterie lisse en la polissant brièvement. Casser les organoïdes en petits morceaux de 50 m. Les organoïdes pulmonaires ont une membrane externe plus épaisse et nécessitent donc un cisaillement plus fort avec la pipette en verre par rapport aux organoïdes intestinaux. En outre, ils ont un taux de croissance plus lent que les organoïdes intestinaux (jusqu'à 14 jours entre chaque passage). - Ajouter le F12MD jusqu'à 5 x 7 ml et la centrifugeuse à 350 x g pendant 5 min.
REMARQUE: La vitesse de centrifugation dans cette étape est plus élevée que la normale afin de faire une bonne pastille cellulaire qui est bien séparée de la matrice extracellulaire (voir le tableau des matériaux). Nous avons observé que par rapport aux organoïdes de l'intestin grêle de souris, les organoïdes intestins grêles humains sont plus difficiles à perturber. - Retirer le plus de milieu possible sans déranger les cellules, puis resuspendre la pastille avec une matrice maintenue à 4 oC; Il faut 200 à 300 l de matrice par puits d'une plaque de six puits. Les organoïdes doivent être divisés un sur trois pour maintenir une densité cellulaire assez élevée.
- Déposer les organoïdes dans des gouttelettes matricielles d'environ 5 à 10 l chacun dans le puits d'une plaque de six puits. Incuber de 20 à 30 min à 37 oC, puis ajouter le milieu d'expansion (OME) sur le dessus.
- Changez le support tous les 2/3 jours.
REMARQUE: En environ 5 à 7 jours, les organoïdes poussant dans l'EM atteignent une taille de 100 à 200 m et sont prêts pour l'injection. - Pour différencier les organoïdes, après 5 à 6 jours en EM, changer les médias en conditions de médias de différenciation (DM) et de garder pendant 5 à 6 jours supplémentaires avant d'injecter les parasites.
REMARQUE: Pour l'expansion des organoïdes, il est recommandé de plaquer les organoïdes densément. Pour la microinjection, l'utilisation d'une plaque de six puits est recommandée avec des organoïdes plaqués à une densité moindre. Par exemple, les organoïdes de plaque de trois puits d'une plaque de six puits dans une plaque pleine de six puits pour des microinjections. La matrice doit être maintenue à -20 oC pour l'entreposage à long terme et décongelée à 4 oC ou sur la glace avant utilisation. L'expansion des organoïdes pulmonaires est faite est d'une manière similaire, mais en utilisant des composants médias spécifiques organoïdes pulmonaires (tableau 1)8 .
- Maintenir les organoïdes dans les cultures 3D dans la matrice extracellulaire (voir le Tableau des Matériaux) à 37 oC. Ajouter OME (médias d'expansion) sur le dessus et rafraîchir tous les jours.
4. Microinjection d'Oocysts/Sporozoites dans l'Organoid Lumen
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Micro-injecter des parasites dans le côté apical de l'organoïde 3D (Figure 2).
- Préparer des capillaires en verre de 1 mm de diamètre à l'aide d'un puller micropipette.
REMARQUE: Les paramètres utilisés sur le puller micropipette (Voir tableau des matériaux)sont les suivantes : Chaleur 663, Pull 100, Vitesse 200, Temps et 40 ms. Les paramètres devront être ajustés en fonction des instructions de l'utilisateur pour une machine particulière. - Couper la pointe du capillaire avec des forceps. La taille/diamètre de l'extrémité capillaire mesure environ 9 à 12 m; cela permet un flux facile d'oocysts (taille de 4 à 5 m).
- Remplissez les capillaires d'une suspension d'oocyste ou de sporozoite à l'aide de pointes de microchargeur.
- Chargez le capillaire rempli d'oocystsur un micro-injecteur.
- Microinjecter 100 à 200 nL suspension dans chaque organoïde sous un microscope inversé à grossissement 5x, en gardant la pression constante. Après la microinjection, rafraîchissez les médias avec OME ou OMD tous les jours et maintenez la plaque à 37 oC.
REMARQUE: Nous n'utilisons pas de micromanipulateur pour la microinjection. L'utilisation du même capillaire est recommandée pour toute l'expérience afin d'assurer une injection égale dans chaque échantillon.
- Préparer des capillaires en verre de 1 mm de diamètre à l'aide d'un puller micropipette.
5. La coloration immunofluorescence des organoïdes
- Recueillir les organoïdes (1/2 x 24 puits) avec une pipette P1000 dans un tube de 15 ml contenant du F12 froid.
- Pellet organoïdes à 300 x g pendant 2 min, retirer le supernatant sans perturber la pastille, et doucement pipet la boulette lâche dans le volume restant.
- Ajouter 5 ml de paraformaldéhyde de 2 % dans le PBS. Pour empêcher les organoïdes de coller au mur ne pas inverser le tube. Laisser les organoïdes se déposer au fond du tube et fixer à 4 oC pendant la nuit ou 1 h à température ambiante.
- Retirez le fixatif et ajoutez 10 ml de tampon de perméabilisation (0,2 % de Triton en PBS).
- Faire pivoter le tube à température ambiante pendant 20 min (ce qui garantit que tous les organoïdes restent en suspension).
- Pelleter les organoïdes à 300 x g pendant 2 min, puis jeter le supernatant.
- Resuspendre délicatement les organoïdes dans 500 l de solution de blocage (Voir la Table des Matériaux)et transférer dans un tube microcentrifuge de 2 ml.
- Incuber 20 min à température ambiante sur un shaker. Laisser les organoïdes se déposer au fond du tube par gravité. Remplacez la solution de blocage par une solution d'anticorps primaire (Voir tableau des matériaux)et incubez pendant 1 h à la température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC.
- Laver 3x avec PBS contenant 0,1% d'entretrois. Laissez les organoïdes s'installer à chaque fois et retirez le supernatant.
- Ajouter la solution d'anticorps secondaire (Voir la table des matériaux) et couver pendant 2 h à température ambiante.
- Laver 3x avec PBS contenant 0,1% d'entretrois. Laisser 50 l de PBS après le troisième lavage.
- Montez sur la glissière en pipetilant les organoïdes suspendus dans 50 L de PBS sur la glissière. Retirez l'excès de PBS, ajoutez une goutte d'agent de montage (Voir la table des matériaux) et ajoutez la feuille de couverture sur le dessus. Sceller les côtés avec du vernis à ongles et laisser sécher.
6. Isolement des okysdes des organoïdes
- Isoler les oocysts nouvellement formés du lumen organoïde.
note:Les okycystes sont isolés des organoïdes par séparation immunomagnétique à l'aide d'un kit d'isolementTableau des matériaux) avec les modifications décrites ci-dessous. Les oocysts isolés peuvent alors être analysés par immunofluorescence et microscopie électronique.- Commencez par les organoïdes différenciés qui ont été maintenus dans OMD pendant 5-7 jours et qui sont non infectés, infectés pendant 1 jour et infectés pendant 5 jours. Utilisez les deux premiers comme contrôles négatifs.
REMARQUE: Nous avons constaté que les organoïdes différenciés produisent plus d'oocystes que les organoïdes intestinaux ou en expansion10. - Recueillir les organoïdes dans des tubes centrifugeurs de 15 ml. Centrifuger les organoïdes pendant 20 min à 3 000 x g et 10 oC.
REMARQUE: Cette vitesse élevée est nécessaire pour s'assurer qu'aucun oocysts n'est perdu hors de tous les organoïdes qui peuvent être cassés. - Retirer le support organoïde et le remplacer par 5 ml d'eau.
- Perturber les organoïdes en répétant des pipetilles vigoureuses avec une pipette Pasteur en verre poli e.
- Si les amas sont visibles, transférer la suspension organoïde à un homogénéisateur de dounce de verre, et homogénéiser jusqu'à ce que les organoïdes soient bien perturbés. L'homogénéisateur dounce n'affectera pas les oocysts.
- Une fois qu'il n'y a pas d'amas visibles, ajoutez 5 ml de tampon A du kit d'isolement d'oocyst. Mélanger, puis ajouter 120 l de perles magnétiques recouvertes d'igM anti-oocyst.
- Incuber la suspension cellulaire et les perles magnétiques pendant 2 h à température ambiante avec un mélange continu sur une plate-forme de bascule.
- À la fin de l'incubation, placez les tubes contenant des cellules et des perles sur un support de séparation magnétique conçu pour les tubes de 15 ml.
- Faire pivoter manuellement les tubes dans un support de séparation magnétique pendant 3 min. Les perles adhéreront au côté du tube à côté de l'aimant.
- Soigneusement, avec une pipette de 10 ml, retirer le supernatant des perles. Resuspendre les perles dans 450 L de tampon B et transférer dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
REMARQUE: Gardez le supernatant jusqu'à ce que l'isolement des oocysts soit confirmé. - Pour recueillir les perles et les oocystes restants, lavez le tube de 15 ml avec 450 l de tampon B et ajoutez ce lavage aux perles magnétiques dans le tube de microcentrifuge.
- Répétez l'étape 6.1.11 une fois de plus. Toutes les perles et les ougtiques capturés doivent maintenant être transférés dans le tube de microcentrifuge.
- Placez le tube de microcentrifuge sur un support de séparation magnétique conçu pour tenir des tubes de microcentrifuge.
- Faire pivoter le tube dans le support de séparation magnétique à la main pendant 3 min.
- Retirez soigneusement le supernatant avec une pipette dans un nouveau tube.
REMARQUE: Gardez le supernatant jusqu'à ce que l'isolement des oocysts soit confirmé. - Retirez le tube de microcentrifuge contenant des perles magnétiques et des oocysts du support de séparation magnétique.
- Ajouter 100 OL de 0,1 N HCl aux perles magnétiques pour éliper les oocysts des perles. Vortex pour 30 s.
REMARQUE: Vortexer doit être réglé à un peu moins de la vitesse maximale. - Incuber les perles dans 0.1 N HCl pendant 10 min à température ambiante.
- Vortex encore. Placez ensuite le tube sur le support de séparation magnétique. Attendez que les perles adhèrent au côté du tube, puis transférez le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifuge.
- Répétez les étapes 6.1.17 à 6.1.19 et combinez la deuxième éluate avec la première élution.
- Neutralisez l'éluate avec 20 oL de 1 N NaOH, ou un autre tampon neutralisant tel que 1 M Tris, pH 8.
- Pour compter les oocystes, prenez 10 l'uluate, combinez-le avec 10 oL d'anticorps spécifiques à l'oocyste (Voir tableau des matériaux)et comptez les oocystes fluorescents sur un hémocytomètre.
REMARQUE: Les oocystes isolés peuvent être stockés à 4 oC ou utilisés immédiatement pour l'immunofluorescence ou la microscopie électronique.
- Commencez par les organoïdes différenciés qui ont été maintenus dans OMD pendant 5-7 jours et qui sont non infectés, infectés pendant 1 jour et infectés pendant 5 jours. Utilisez les deux premiers comme contrôles négatifs.
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Representative Results
Les protocoles présentés ici donnent lieu à une purification efficace des oocystes et des sporozoites (Figure 1A) prêts pour la microinjection. Le protocole d'excystation entraîne la libération de sporozoites à partir d'environ 70 à 80 % des oocystes, il est donc essentiel de filtrer les oocystes et les coquilles restants à l'intérieur d'un filtre de 3 m. La filtration entraîne près de 100 % de purification de la sporozoite (figure 1B). En outre, l'ajout d'un colorant vert permet d'assurer l'injection de tous les organoïdes et permet la visualisation des organoïdes injectés pendant au moins 24 h après l'injection (Figure 2B).
Ces protocoles pour la préparation des oocystes et des sporozoites sont simples et ont été utilisés pendant de nombreuses années, il est donc prévu que les oocystes traités et les sporozoites purifiés seront viables et infectieux. Cependant, dans nos études, nous avons utilisé la microscopie électronique de balayage pour s'assurer que le processus d'excystation n'a pas endommagé les sporozoites ou les oocystes (figure 2A)10. L'injection de quantités égales d'ovocytes dans le lumen organoïde peut être confirmée visuellement par une simple imagerie microscopique (Figure 2C). Une partie des organoïdes infectés devrait être mis en place pour vérifier la propagation du parasite par PCR quantitative comme nous l'avons décrit10.
Les progrès du cycle de vie du parasite peuvent être visualisés par la collecte d'organoïdes infectés à différents moments après l'infection et l'analyse par microscopie électronique de transmission ou par immunofluorescence combinée avec 4,6-diamidino-2-phénylindole ( DAPI) coloration des noyaux parasites10. Par exemple, les anticorps contre les antigènes de surface de la merozoite, tels que le gp40 et le gp1517, peuvent être utilisés pour identifier les stades de meront; meronts de type I aura 8 noyaux et meronts de type II, 4 noyaux10. Récemment, un panneau d'anticorps monoclonaux spécifiques aux trophozoites, mériozoites, meronts de type I contre II, et macrogamonts est devenu disponible18. Ces anticorps seraient également très efficaces pour marquer le progrès du parasite à travers ses différentes étapes du cycle de vie dans les organoïdes.
Les tests d'immunofluorescence peuvent également être utilisés pour explorer quels types de cellules sont infectés par Cryptosporidium. Ceci était particulièrement important à regarder dans les organoïdes de voie aérienne car très peu est connu au sujet de la cryptosporidiose respiratoire, et la cellule d'hôte exacte pour le parasite n'était pas connue. Nous avons effectué des essais d'immunofluorescence sur les organoïdes infectés par Cryptosporidium,colocalisant le CC10, un marqueur pour les cellules de club et avons constaté que Le Cryptosporidium avait infecté à la fois des cellules cc10 négatives et positives(figure 3). Ces résultats ont été corroborés par TEMs dans lequel nous avons observé Cryptosporidium infectant les cellules sécrétrices et non sécrétrices dans les organoïdes de voie aérienne10.
Après que les organoïdes différenciés ont été infectés pendant cinq jours, il devrait y avoir nombre significatif d'oocysts étant produits. Dans nos mains, l'infection des organoïdes d'une plaque de six puits a donné environ 4000 oocysts, qui pourraient être facilement identifiés et comptés sur un hémocytomètre en étiquetant avec un anticorps oocyst-spécifique. La présence de quatre sporozoites dans les oocystes pourrait être confirmée en séchant une partie des ochoirs sur une glissière adhésive, en fixant avec du méthanol et en combinant la coloration DAPI avec un anticorps spécifique à l'oocyst (Figure 4). La vérification de la production d'oocystes épais murés pourrait être effectuée par l'analyse TEM10.
Figure 1 : Préparation et purification des oocystes et des sporozoites de Cryptosporidium. (A) Représentation schématique de la méthode utilisée pour la préparation de l'oocyste et de la sporozoite pour l'infection. (B) Image montrant l'excystation in vitro des oocysts. La filtration des oocyts et des coquilles non-cystés donne une solution purifiée des sporozoites. Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Microinjection d'oocysts dans le lumen organoïde. Ce chiffre a été modifié à partir de Heo et al.10. (A) scannuant des images de microscopie électronique (SEM) d'oocystes et de sporozoites. (B) Image montrant des organoïdes injectés d'oocyste. Le colorant vert aide à visualiser l'injection de chaque organoïde et persiste sur au moins 24 h. (C) Image d'un organoïde injecté avec des olottes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Image d'immunofluorescence de l'organoïde des voies respiratoires infectés par Cryptosporidium. Mucin est étiqueté avec anti-mucine 5 anticorps (rouge) dans le lumen de l'organoïde, les cellules de club sont étiquetées avec anti-CC10 (jaune), Cryptosporidium est détecté avec l'anticorps oocyst-spécifique (vert), et les noyaux cellulaires sont tachés de DAPI (bleu). Le panneau B est un élargissement de la zone indiquée sur la place du panneau A. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Image d'immunofluorescence de l'oocyst isolé des organoïdes intestinaux différenciés. La paroi d'Oocyst est étiquetée avec l'anticorps oocyst-spécifique dans le vert et les quatre noyaux de sporozoite sont visualisés avec DAPI (bleu) svp cliquez ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
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Discussion
La culture des parasites de Cryptosporidium dans les organoïdes intestinaux et de voie aérienne fournit un modèle précis pour étudier des interactions hôte-parasite10 mais a également beaucoup d'autres applications. Par exemple, les méthodes actuelles de sélection et de propagation des parasites cryptosporidium génétiquement modifiés nécessitent un passage chez la souris19 qui ne permet pas l'isolement des parasites qui ont des modifications essentielles pour l'infection in vivo. La culture organoïde de Cryptosporidium offre une alternative à cette procédure. Cependant, nous avons noté que les sporozoites électroporated s'agglutinent ensemble et bloquent la micropipette. Dans le but de sélectionner des parasites génétiquement modifiés, les organoïdes peuvent être cultivés sur des transwells enduits de collagène dans un format bidimensionnel dans des conditions de différenciation pour permettre l'infection par des sporozoites transfectés et, par conséquent, la sélection de les oocysts génétiquement modifiés. Les transwells permettent l'accès aux surfaces apicales et basolatérales et sont stables pendant de longues périodes.
À l'heure actuelle, nous cultureons les organoïdes dans un format bidimensionnel pour le dépistage à haut débit des médicaments pour les organoïdes dérivés du cancer (données non publiées). Cette méthode de culture organoïde peut également être adaptée pour tester des médicamentsanti-Cryptosporidium à l'aide des souches de cryptosporidium génétiquement modifiées marquées par la luciférase19. En outre, même si l'infection n'est pas étroitement synchronisée, l'infection des organoïdes avec des sporozoites fournit une synchronisation suffisante du cycle de vie que les médicaments peuvent être testés pour leur efficacité contre des stades spécifiques du cycle de vie.
Des systèmes de co-culture organoïde sont en cours de développement en tenant compte d'autres aspects du système hôte tels que le microbiote et les cellules immunitaires20. Ainsi, la capacité de disséquer les interactions entre le parasite et les cellules hôtes, les cellules immunitaires et le microbiote sera bientôt possible in vitro. La manipulation génétique de Cryptosporidium est également maintenant possible19, et la combinaison de souches fluorescentes reporter de Cryptosporidium et la culture organoïde fournira les outils pour le séquençage cellulaire unique des cellules infectées, et plus précisément le séquençage à cellule unique des cellules infectées par des stades spécifiques du parasite.
Le succès des expériences décrites ici dépend fortement de la viabilité et de l'infectiosité des oocysts. Différents lots d'oocystes de Cryptosporidium peuvent varier considérablement dans les taux d'excystation et la capacité d'infecter les cellules hôtes. Les rendements suffisants des sporozoites dépendent de bons taux d'excystation et le taux d'excystation n'est pas toujours corrélé à l'infectiosité. Si de faibles niveaux d'infection ou une mauvaise excystation sont observés avec un lot particulier d'oocysts, le temps et l'effort peuvent être sauvés en obtenant un nouveau lot d'oocysts plutôt que de tenter d'augmenter les nombres d'oocystes, ou l'allongement des temps d'incubation.
Les médias de culture organoïde doivent être rafraîchis tous les jours alternatifs. L'utilisation de passages antérieurs des cultures organoïdes est conseillée. Il est important de décongeler une nouvelle fiole d'organoïdes si les organoïdes commencent à se différencier dans les passages ultérieurs que la santé des cultures organoïdes déterminer considérablement la viabilité du parasite. Après l'infection, les médias organoïdes doivent être rafraîchis tous les jours pour éviter l'accumulation de substances toxiques dans les médias.
La culture organoïde de Cryptosporidium est limitée en ce que le parasite ne peut pas être propagé indéfiniment, et l'infection s'éteint après trois passages sur 28 jours10. La microinjection d'organoïdes suffisants pour des expériences de souris comme nous l'avons décrite peut prendre du temps et être physiquement exigeante. Néanmoins, à ce jour, aucune autre méthode ne permet le cycle de vie complet dans un système in vitro complètement représentatif de l'infection humaine, et aucun système culturel n'a été décrit qui permet l'exploration des interactions hôte-pathogène important pour infection respiratoire. La culture organoïde de Cryptosporidium fournit un nouvel outil puissant qui ouvre des avenues d'exploration dans les interactions hôte-parasite pas auparavant possible pour Cryptosporidium.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Deborah A. Schaefer de l'École des sciences biomédicales animales et comparées, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, Usa pour nous aider avec la production et l'analyse d'oocyst. Nous remercions également Franceschi Microscopy and Imaging Center et D.L. Mullendore de l'Université d'État de Washington pour la préparation et l'imagerie tem des ovocytes organoïdes isolés.
D.D. est le bénéficiaire d'une subvention VENI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. est le bénéficiaire d'une subvention VENI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO-ALW, 863.14.002) et a été soutenu par les bourses Marie Curie de la Commission européenne (Proposition 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). La recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Conseil européen de la recherche dans le cadre de l'accord de subvention avancée no 67013 de l'ERC et de la NIAIH des NIH dans le cadre de R21 AT009174 à RMO. Ce travail fait partie de l'Institut Oncode, qui est en partie financé par la Société néerlandaise du cancer et a été financé par une subvention de la Société néerlandaise du cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* - cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make up to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
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